Summary
अधिवृक्क प्रांतस्था द्वारा स्रावित हार्मोन तनाव और रोगों के खिलाफ जानवरों के लिए महत्वपूर्ण है. यहां, हम प्राथमिक चूहा अधिवृक्क कोशिकाओं संस्कृति के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । यह अधिवृक्क steroidogenesis और लिपिड जैव संश्लेषण में ब्याज की अभिकर्मक के तंत्र की जांच के लिए विट्रो मंच में एक अच्छा हो सकता है ।
Abstract
हार्मोन जो अधिवृक्क प्रांतस्था स्रावों तनाव और रोगों के खिलाफ जानवरों के लिए महत्वपूर्ण है. विधि यहां वर्णित प्राथमिक सुसंस्कृत चूहे अधिवृक्क कोशिकाओं और संबंधित कार्यात्मक assays (प्रतिदीप्ति लिपिड छोटी बूंद की सतह प्रोटीन, साथ ही corticosterone विश्लेषण के दाग) की प्रक्रिया है । विवो मॉडल में एक के विपरीत, अधिवृक्क monolayer संस्कृतियों में interexperiments की भिन्नता कम है और प्रयोगात्मक हालत को नियंत्रित करने के लिए आसान है. इसके अलावा, चूहों का स्रोत अन्य जानवरों की तुलना में भी अधिक स्थिर है, जैसे गोजातीय लोग । वहां भी कई मानव अधिवृक्क सेल लाइनों (nci-H295, nci-H295R, SW13, आदि) है कि अधिवृक्क अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, इन पंक्तियों के स्टेरॉयड उत्पादन अभी भी कई कारकों से प्रभावित हो जाएगा, जो सीरम बहुत संख्या शामिल, मार्ग संख्या, उत्परिवर्ती/विशिष्ट जीन की हानि, आदि. 17α-हाइड्रॉक्सिलेज की कमी के अलावा, अधिवृक्क फिजियोलॉजी का अध्ययन करने के लिए एक बेहतर और अधिक सुविधाजनक तकनीक है चूहा adrenocortical कोशिकाओं की प्राथमिक संस्कृति । संक्षेप में, प्राथमिक चूहा अधिवृक्क संस्कृतियों अधिवृक्क ग्रंथि प्रणाली में ब्याज की अभिकर्मक के तंत्र की जांच करने के लिए शोधकर्ताओं के लिए विट्रो मंच में एक अच्छा हो सकता है.
Introduction
अंतःस्रावी प्रणाली शारीरिक गतिविधियों और homeostasis को विनियमित करने के लिए जिम्मेदार है1. गुर्दे के कपाल ध्रुव पर स्थित अधिवृक्क ग्रंथियों में से एक प्रमुख अंतःस्रावी अंगों में से एक है जो मिनरलोकोर्टिकोइड, ग्लूकोकॉर्टिकोइड, और एण्ड्रोजन2,3स्राव करते हैं । अधिवृक्क ग्रंथि के दो विशिष्ट भाग हैं: कॉर्टेक्स और मज्जा । अधिवृक्क प्रांतस्था तीन परतों के होते हैं: बाहरी ग्लोमेरुलोसा, मध्यवर्ती केवड़ा, और भीतरी रेटिकुलेरिस3. zona ग्लोमेरोलोसा एल्डोस्टेरोन, एक mineralocorticoid, जो गुर्दे3में सोडियम आयन और पानी reabsorbing में एड्स की मूल स्राविटिंग साइट है । zona केवड़ा मुख्य रूप से सामान्य शारीरिक स्थितियों में ग्लूकोकोर्टिकोइड के बेसल स्तर का उत्पादन करता है3. कृंतकों में कोर्टिकोस्टेरॉइड और मनुष्यों में कोर्टीसोल रक्त ग्लूकोज3को विनियमित करके तनाव से मुकाबला करने में शरीर की सहायता करने के लिए कार्य करते हैं । कुछ हद तक, वे भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को बाधित और प्रतिरक्षा प्रणाली को विनियमित कर सकते हैं4,5. अन्य स्तनधारियों के विपरीत, चूहों और चूहों अधिवृक्क ग्रंथि में एक 17α-hydroxylase अभिव्यक्ति की कमी के कारण एक कार्यात्मक zona जालिका नहीं है6,7. इस प्रकार, चूहों और चूहों से adrenals एड्रेनल सी-19 स्टेरॉयड (कोर्टिसोल और एड्रेनल एण्ड्रोजन) के स्राव से रहित हैं ।
प्राथमिक संवर्धित adrenocortical कोशिकाओं अधिवृक्क शरीर क्रिया विज्ञान8को नियंत्रित करने के तंत्र की जांच के लिए उपयोगी हो दिखाया गया है । अन्य steroidogenic ऊतकों की तरह, प्रत्येक अधिवृक्क क्षेत्र मुक्त कोलेस्ट्रॉल9से अपने स्टेरॉयड संश्लेषित. एड्रेनोकोर्टिकोट्रोपिक हार्मोन (acth) उत्तेजना पर, मुक्त कोलेस्ट्रॉल टूटने लिपिड बूंदों से जारी किया जाता है और, इस प्रकार, केवड़ा में स्टेरॉयड उत्पादन को बढ़ाता है और10जालिका.
कई समूहों adrenocortical कार्सिनोस से स्थिर सेल लाइनों को स्थापित करने का प्रयास किया है । हालांकि, कई चिंताओं में विट्रो मॉडल8के रूप में adrenocortical सेल लाइनों का उपयोग सीमित है । सेल लाइनों के स्टेरॉयड प्रतिक्रियाओं मार्ग के बीच अलग हो सकता है, सीरम की बहुत संख्या, और सीरम की गुणवत्ता, आदि. इसके अलावा, वाणिज्यिक अधिवृक्क सेल लाइनों (Y1 और SW13) corticosterone छिपाना नहीं है, यह अधिवृक्क steroidogenesis8का अध्ययन करने के लिए और अधिक कठिन बना । पूर्व वीवो मॉडल के रूप में गोजातीय और घोड़े का उपयोग करना एक अच्छा विकल्प हो सकता है, भले ही इन बाजारों से ऊतक कुछ अज्ञात जोखिमों को अस्पष्ट कर सकते हैं । उनकी तुलना में, चूहा अधिवृक्क ग्रंथियों का प्रबंधन आसान है और स्रोत अपेक्षाकृत अधिक स्थिर और रोगजनक-मुक्त है । एक साथ ले लिया, वर्तमान विधि यहां वर्णित चूहा अधिवृक्क केवड़ा कोशिकाओं में corticosterone संश्लेषण के संबंधित तंत्र की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
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Protocol
पशु विषयों सहित सभी प्रक्रियाओं को काऊशुंग मेडिकल यूनिवर्सिटी के संस्थागत पशु परिचर्या एवं उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है.
1. प्रायोगिक प्रक्रिया
- बलिदान वयस्क (8 से 12 सप्ताह की आयु) महिला/पुरुष एसडी चूहों सह द्वारा2 इच्छामृत्यु ।
- ७०% इथेनॉल लागू करें और इसे त्वचा में अवशोषित हो, और फिर एक ऊतक कागज के साथ त्वचा पोंछ ।
- सुपिने की स्थिति में एक साफ प्लास्टिक की थाली पर चूहा रखो ।
- मिडलाइन पर "बाहरी" घुमावदार संदंश के साथ त्वचा लिफ्ट और एक "Y" आकार बनाने के द्वारा एक कुंद विच्छेदन प्रदर्शन (जांघ के स्तर से subcostal कोण करने के लिए) ।
- ७०% इथेनॉल के साथ कैंची कुल्ला और, फिर, मांसपेशियों में कटौती, यह भी एक "Y" आकार बनाने ।
-
पेट के पीछे बाईं अधिवृक्क ग्रंथि का पता लगाएं ।
नोट: सही अधिवृक्क जिगर के पीछे गहराई से पाया जा सकता है.- पेट या जिगर उठा और एक और घुमावदार संदंश के साथ adrenals को अलग करने के लिए संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें ।
- अधिवृक्क ग्रंथियों एक बाँझ पकवान में डालने के बाद, ध्यान से ठीक forceps साथ अधिवृक्क कैप्सूल निकालें.
- कैंची की एक नाजुक जोड़ी के साथ, छोटे टुकड़ों में सीरम मुक्त है dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (dmem) के एक छोटा सा के साथ adrenals कट/
-
तीन अलग ताकना आकार पाश्चर पाइपट्स तैयार करें और सभी अधिवृक्क टुकड़ों को एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में कोलेजिनस द्वितीय के साथ मध्यम युक्त (~ 0.5-0.8 मिलीग्राम/एमएल) के लिए पहले पाश्चयुअल पिपेट का उपयोग करते हैं ।
- धीरे 10x के बारे में ऊतक टुकड़े triturate । बाकी के पाइप्स का उपयोग करें और ऊपर दिए गए चरणों को दोहराएं जब तक कि सभी टुकड़े छोटे न हो जाएं ।
नोट: पाश्चर पाइपट्स के विभिन्न छिद्र आकार को आग से गर्म करके बनाया जा सकता है । पहला पिपेट मूल आकार (लगभग 1 मिमी) है, दूसरा एक के ताकना आकार के बारे में ०.८ मिमी है, और तीसरे pasteur पिपेट के बारे में है ०.५ मिमी । पाचन के दौरान, अधिवृक्क के टुकड़े छोटे हो जाएगा । इस प्रकार, यांत्रिक प्रक्रिया के माध्यम से, adrenals पचा और अधिक पूरा किया जा सकता है । एक पानी स्नान में ट्यूब सेते (३७ डिग्री सेल्सियस पर) और यह हर 5 मिनट, कुल में 4x हिला ।
- धीरे 10x के बारे में ऊतक टुकड़े triturate । बाकी के पाइप्स का उपयोग करें और ऊपर दिए गए चरणों को दोहराएं जब तक कि सभी टुकड़े छोटे न हो जाएं ।
- 20 मिनट की ऊष्मायन के बाद, ताजा और शांत माध्यम (साठ गुना मात्रा; उदाहरण के लिए, 5 मिलीलीटर के ऊतकों + 25 मिलीलीटर के शांत dmem/F-12 मध्यम) युक्त २.५% भ्रूण गोजातीय सीरम (fbs) और 5% हॉर्स सीरम एंजाइम प्रभाव को रोकने के लिए ।
- 10 मिनट के लिए ८०० एक्स जी पर केन्ट्रेगेशन द्वारा सेल छर्रों को इकट्ठा करें ।
- कोशिकाओं को निलंबित करने के लिए मध्यम की एक उचित मात्रा जोड़ें ।
नोट: प्रत्येक ग्रंथि के बारे में कर सकते हैं ~ 3 x 10 5 करने के लिए ~ 4 x 105 कोशिकाओं. - प्लेट वांछित प्लेटों या व्यंजन में कोशिकाओं को विकास माध्यम के साथ (1:1 [v/वी] dmem और हैम एफ 12 मध्यम के मिश्रण, 25 मिमी hepes और 1% पेनिसिलिन और streptomycin के साथ पूरक) रात भर (दिन 0) ३७ डिग्री सेल्सियस पर, ९५% हवा और 5% सह2के एक humidified वातावरण में ।
नोट: आमतौर पर, हम 24 में प्लेट कोशिकाओं-अच्छी तरह से प्लेटों (चार ग्रंथियों/प्लेट) corticosterone परख के लिए और ३५ मिमी व्यंजन में (एक ग्रंथि/पश्चिमी ब्लॉट विश्लेषण के लिए लगभग एक दो व्यंजन) । - सीरम मुक्त गर्म dmem/एफ-12 मध्यम (दिन 1) के साथ कोशिकाओं 2x ध्यान से धोने । नए विकास माध्यम को बदलें ।
- ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को बनाए रखना ९५% हवा और 5% सह2 दिन 3 तक के एक humidified वातावरण में ।
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Representative Results
यहां वर्णित प्रक्रिया का उपयोग करते हुए, प्राथमिक संवर्धित अधिवृक्क कोशिकाओं को एक फेज-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप (चित्रा 1a) के तहत प्रतिष्ठित किया जा सकता है । आगे की पुष्टि करने के लिए कि कोशिका द्रव्य के भीतर vesicles लिपिड बूंदों हैं, एडिस भेदभाव से संबंधित प्रोटीन (एडीआरपी) के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला दिन-3 संस्कृतियों (चित्रा 1b) पर आयोजित किया जा सकता है । कोशिकाएं कांच के coverslips पर उगाई जाती थीं । कोशिकाओं को फास्फेट-buffered खारा (pbs) के साथ तीन बार धोया और 4% paraformaldehyde के साथ तय किया गया । pbs के साथ तीन बार धोने के बाद, कोशिकाओं को अवरुद्ध कर रहे थे और ०.१% triton एक्स-१०० 5% नोनफेट दूध में के साथ permeabilized । प्राथमिक adrp एंटीबॉडी 5% नोनफेट दूध में (1:50) पतला था और रातोंरात incubated था । pbs धोने के तीन बार के बाद, कोशिकाओं बकरी विरोधी खरगोश Alexa fluor ४८८ माध्यमिक एंटीबॉडी (1:100) के साथ incubated किया गया । धोने के चरणों को दोहराने के बाद, कोशिकाओं को लंबा सोने एंटीफ़ेड बढ़ते मध्यम के साथ घुड़सवार थे और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत जांच की गई । इसके अलावा, चूहे अधिवृक्क कोशिकाओं की हार्मोन उत्पादक क्षमता corticosterone परख द्वारा निर्धारित किया जा सकता है । चूहा अधिवृक्क कोशिकाओं पर acth की उत्तेजना एक सकारात्मक नियंत्रण (चित्रा 1c) के रूप में काम कर सकता है । एकत्र किए गए मीडिया पतला किया गया और corticosterone सामग्री के लिए बीएसए, चेन एट अल.11द्वारा वर्णित प्रक्रिया के अनुसार ।
चित्रा 1: अधिवृक्क कोशिकाओं के लक्षण वर्णन और corticosterone प्रतिक्रिया acth उपचार के लिए. (क) प्रावस्था-3 दिन के विपरीत चित्र प्राथमिक संवर्धित चूहा अधिवृक्क कोशिकाओं । (ख) एडीआरपी अभिरंजक दिखाया गया है । (ग) दिन-3 संवर्धित चूहा अधिवृक्क कोशिकाओं acth के साथ इलाज किया गया (1 बजे और 1 एनएम) के लिए 6 ज. मीडिया एकत्र किया गया और एक-८० ° c रेफ्रिजरेटर में संग्रहीत उपयोग तक । corticosterone स्तर एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (elisa) द्वारा मापा गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
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Discussion
अधिवृक्क ग्रंथियों पर्यावरण अनुकूलन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं3. हार्मोन जिसके द्वारा अधिवृक्क प्रांतस्था स्रावित करता विनियमित और शारीरिक कार्यों और homeostasis को समायोजित कर सकते हैं3. में vivo मॉडल शरीर में वास्तविक शारीरिक प्रभाव को दर्शाता है । तथापि, यह अभी भी कई जटिल कारकों से प्रभावित है, प्रयोगों में अस्थिर प्रभाव के कारण. इसके विपरीत, इन विट्रो सेल मॉडल में लाभ है जो यह पशु मॉडल के लिए अतुलनीय बनाता है । सबसे पहले, पर्यावरण की स्थिति में इन विट्रो प्रणाली में नियंत्रण करने के लिए आसान है । हार्मोन किसी भी उत्तेजना से प्रभावित होने की संभावना है. vivo प्रयोगों में आम तौर पर एक अविशिष्ट प्रतिक्रिया में परिणाम है क्योंकि पशुओं के संकट से ग्रस्त हैं । दूसरा, पदार्थ शरीर में निगरानी के लिए आसान नहीं हैं, लेकिन सभ्य प्रणाली में उत्तरदायी हैं । तीसरा, इन विट्रो प्रणाली प्रत्येक स्वतंत्र प्रयोग के बीच प्रसरण को कम कर देता है । कई वैज्ञानिक रिपोर्टों में 10%-20% fbs12,13,14,15युक्त adrenocortical कोशिकाओं की एक संस्कृति मीडिया दिखा, जबकि यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल 5% fbs और २.५% घोड़े सीरम का उपयोग करता है बनाए रखने के लिए एक सप्ताह तक के लिए अधिवृक्क कोशिकाओं की वृद्धि.
steroidogenesis साइटोक्रोम P450 पक्ष श्रृंखला दरार एंजाइमों द्वारा मुक्त कोलेस्ट्रॉल की दरार से शुरू किया जाता है । जैसा कि चित्र 1a, Bमें दिखाया गया है, अधिवृक्क कोशिकाओं लिपिड बूंदों के कई और विभिन्न आकारों का प्रदर्शन, यह सुझाव स्टेरॉयड जैवसंश्लेषण की जांच के लिए एक अच्छा उपकरण है और/या लिपिड जीव विज्ञान (केवड़ा कोशिकाओं प्रमुख और बड़ा लिपिड है बूंदों)1,3. adrp, भी perilipin 2 के रूप में जाना जाता है, एक लिपिड छोटी बूंद की सतह प्रोटीन जो लिपिड बूंदों के भीतर तटस्थ लिपिड के भंडारण में सहायता करता है16. लिपिड की एक राशि का प्रदर्शन adrenocortical कोशिकाओं के कारण, adrp (या अन्य लिपिड छोटी बूंद सतह प्रोटीन, perilipin की तरह) परीक्षण एजेंटों हार्मोन संश्लेषण16को प्रभावित कि क्या जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता.
अधिवृक्क ग्रंथियों के विकास और कार्य कसकर हाइपोथैलेमस corticotropic जारी हार्मोन और पिट्यूटरी acth द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं, neuropeptides, न्यूरोट्रांसमीटर, और वृद्धि कारकों, आदि17. चित्रा 1c पता चलता है कि corticosterone उत्पादन काफी एक एकाग्रता पर निर्भर फैशन में acth उपचार द्वारा प्रेरित किया गया था । इसके अलावा, 1 बजे acth और 1 एनएम के बारे में corticosterone उत्पादन को प्रेरित 30 और ७०-गुना, क्रमशः । यह प्रदर्शित किया गया है कि दिन-3 संवर्धित प्राथमिक अधिवृक्क कोशिकाओं acth उत्तेजना के लिए एक बेहतर प्रतिक्रिया प्रदर्शन15. यह भी कारण है कि वर्तमान अध्ययन में दिन-3 संस्कृति का उपयोग किया गया था । इसके अलावा, elisa किट द्वारा corticosterone के माप भी अनुसंधान के लिए एक सरल और आसान उपकरण है । इसलिए, प्राथमिक सुसंस्कृत चूहा अधिवृक्क कोशिकाओं अधिवृक्क steroidogenesis का अध्ययन करने के लिए मंच प्रदान न केवल लेकिन यह भी भड़काऊ से संबंधित रोगों की जांच करने के लिए लागू हो सकता है.
वर्तमान प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम adrenals के पाचन और संदूषण के नियंत्रण कर रहे हैं । इसलिए, पाचन समय का नियंत्रण, शारीरिक चूषण बल, और ऊतक पाचन स्तर के अवलोकन सेल अस्तित्व के लिए बहुत महत्वपूर्ण हैं । इसके अलावा, त्वचा को काटने और adrenals को अलग करने की विधि भी महत्वपूर्ण है । हमेशा पशु फर से किसी भी संक्रमण को रोकने के लिए ७०% इथेनॉल में सभी उपकरणों विसर्जित कर दिया । अधिक कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए, प्रत्येक चूषण के दौरान सक्शन आवृत्ति को दस बार से कम नियंत्रित किया जाना चाहिए । इसके अलावा, यदि ऊतकों की स्थिति आगे के कदमों के लिए अच्छी नहीं है, तो कोलेजैनेस-युक्त माध्यम में ऊष्मायन 30 मिनट से अधिक लंबा नहीं होना चाहिए ।
क्योंकि चूहों की अधिवृक्क ग्रंथियों छोटे हैं, ग्लोमेरुलोसा परत अधिवृक्क कैप्सूल के छीलने के दौरान खो सकता है. यह प्रदर्शित किया गया है कि decapsulation संयोजी ऊतक कैप्सूल और पूरे zona ग्लोमेरुलोसा18को हटाने के परिणामस्वरूप. पुरुष चूहों की अधिवृक्क ग्रंथियों मादा चूहों की तुलना में छोटे हैं. इसके अतिरिक्त, लिपिड बूंदों 11 सप्ताह पुरानी महिला या पुरुष6चूहों में बड़ा होने के लिए दिखाई देते हैं । उपलब्ध कोशिकाओं के बारे में, महिला चूहों प्रयोगों के लिए एक अच्छा विकल्प हो सकता है.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
यह काम राष्ट्रीय विज्ञान परिषद ताइवान (NSC102-2320-B-037-008-MY3) और एक राष्ट्रीय चेंग-कुंग विश्वविद्यालय अस्पताल के अनुसंधान अनुदान (nckuh-१०१०२०४५) से अनुदान द्वारा समर्थित था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Female/male, SD/Wistar rats (8-12 weeks) | BioLASCO | male or femal rats are suitable for experiments. Female's adrenal glands are larger than male rats, however, female rats own the oestrous cycles that may influence the experiments | |
| Collagenase, type II | Sigma | C-6885 | isolation of adrenal cells |
| DMEM | ThermoFisher | 12800-017 | powder media for adrenal cells |
| Ham's F12 | ThermoFisher | 21700-075 | powder media for adrenal cells |
| HEPES | JT.baker | 4018 | buffer (powder) |
| NaHCO3 | JT.baker | 3506-1 | |
| Horse serum | Hyclone | 16050014 | |
| Fetal bovine serum | SAFC | 12103C | |
| Penicillin (10,000 U)-streptomycin (10,000 ug/mL) | Corning | 30-002-Cl | antibiotics |
| Curved forceps | BRAUN | BD343R | |
| Forceps | BRAUN | BD331R | |
| Scissor | BRAUN | BC224R | cut rat skin and muscle |
| Delicate scissor | BRAUN | BC101R | cut adrenal glands |
| Adipose-differentiation related protein | Abcam | ab108323 | antibody for lipid droplet associated protein |
| Corticosterone ELISA kit | cayman | 500655 | assay for corticosterone synthesis |
| Inverted light microscopy | Leica | ||
| Fluorescence microscope | Nikon | ||
| Triton X-100 | JT.baker | X198-07 | for immunofluorescence staining |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa 488 Fluor secondary antibody | ThermoFisher | A-11034 | for immunofluorescence staining |
| Anti-ADFP | Abcam | 108323 | for immunofluorescence staining |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher | P36935 | for immunofluorescence staining |
References
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