Summary
Dit artikel biedt gedetailleerde methoden voor het vervaardigen en karakteriseren van een pneumatisch bedienend microfluïdisch apparaat voor chondrocyten compressie.
Abstract
Mechanische stimuli zijn bekend om het moduleren van biologische functies van cellen en weefsels. Recente studies hebben gesuggereerd dat compressieve stress verandert groei plaat kraakbeen architectuur en resulteert in groei modulatie van lange botten van kinderen. Om de rol van compressieve stress in botgroei te bepalen, hebben we een microfluïdisch apparaat gecreëerd dat door de pneumatische druk wordt bediend, om de groei plaat chondrocyten die in alginaat hydrogel cilinders zijn ingebed dynamisch (of statisch) te comprimeren. In dit artikel beschrijven we gedetailleerde methoden voor het fabriceren en karakteriseren van dit apparaat. De voordelen van ons protocol zijn: 1) vijf verschillende magnitudes van druk stress kunnen worden gegenereerd op vijf technische replicaten in een enkel platform, 2) het is gemakkelijk om celmorfologie te visualiseren via een conventionele lichtmicroscoop, 3) cellen kunnen snel worden geïsoleerd vanaf het apparaat na compressie om downstream testen te faciliteren, en 4) kan het platform worden toegepast om mechanobiologie te bestuderen van elk celtype dat in hydrogels kan groeien.
Introduction
Micro-engineered platforms zijn waardevolle hulpmiddelen voor het bestuderen van de moleculaire, cellulaire en weefselniveau biologie, omdat ze dynamische controle van zowel de fysieke en chemische micro-omgevingen1,2,3 ,4,5,6,7,8. Zo kunnen meerdere hypotheses tegelijkertijd op een strak gecontroleerde manier worden getest. In het geval van groei plaat kraakbeen, er zijn toenemende bewijzen van een belangrijke rol van compressieve stress bij het moduleren van botgroei door middel van actie op de groei plaat kraakbeen9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25. Echter, het werkingsmechanisme van compressieve stress – in het bijzonder, hoe stress leidt de vorming van chondrocyten kolommen in de groei plaat – is slecht begrepen.
Het doel van dit protocol is om een pneumatisch bedienend microfluïdisch chondrocyten compressie apparaat te creëren26 om mechanismen van mechanobiologie in de groei plaat chondrocyten te verhelderden (Figuur 1a-c). Het apparaat bestaat uit twee delen: de pneumatische bedieningseenheid en de alginaat gelconstructie. De microfluïdische pneumatische bedieningseenheid is vervaardigd met behulp van Polydimethylsiloxaan (PDM'S) op basis van de foto-en soft-lithografie. Deze unit bevat een 5 x 5 array van dunne PDMS membraan ballonnen die verschillend kunnen worden opgeblazen op basis van hun diameters. De alginaat gel construct bestaat uit de chondrocyten ingebed in een 5 x 5 array van alginaat gelcilinders, en de hele alginaat-Chondrocyte constructies worden geassembleerd met de bedieningseenheid. De alginaatgel constructies worden gecomprimeerd door de pneumatisch opgeblazen PDMS ballonnen (Figuur 1b). Het microfluïdische apparaat kan tegelijkertijd vijf verschillende niveaus van druk stress genereren in een enkel platform op basis van verschillen in de ballon diameter van de PDMS. Zo is een high-throughput test van chondrocyten mechanobiologie onder meerdere compressie omstandigheden mogelijk.
Het in dit protocol beschreven microfluïdische apparaat heeft veel voordelen ten opzichte van het conventionele compressie apparaat, zoals externe fixators14,21,23 en macroscopische compressie apparaten16, 19 , 27 , 28 voor het bestuderen van chondrocyten mechanobiologie: 1) het microfluïdische apparaat is kosteneffectief omdat het kleinere hoeveelheden monsters verbruikt dan het macroscopische compressie apparaat, 2) het microfluïdische apparaat is tijd effectief omdat het meerdere compressie condities gelijktijdig, 3) het microfluïdische apparaat kan mechanische en chemische stimuli combineren door een concentratie gradiënt van chemicaliën te vormen op basis van de beperkte menging in microkanalen, en 4) verschillende microscopie technieken (timelapse microscopie en fluorescentie confocale microscopie) kunnen worden toegepast met het microfluïdische apparaat gemaakt van transparante PDM'S.
We hebben de methode van Moraes et al.7,29 aangenomen en aangepast om verschillende druk stress niveaus te creëren in een enkel apparaat om high-throughput mechanobiologie studies van chondrocyten compressie mogelijk te maken. Onze aanpak is geschikt voor cellen (bijv. chondrocyten) die drie-dimensionale (3D) cultuur omgeving nodig hebben en voor biologische assays na het comprimeren van cellen. Hoewel sommige microfluïdische celcompressiestellen cellen kunnen comprimeren op tweedimensionale (2D) substraten30,31,32, kunnen ze niet worden gebruikt voor chondrocyten omdat 2D gekweekte chondrocyten dedifferentiëren. Er zijn microfluïdische platformen voor het comprimeren van 3D gekweekte cellen in photopolymerized hydrogels7,33, maar ze zijn beperkt in het isoleren van cellen na compressie experimenten omdat cellen isoleren van photopolymerized hydrogel is niet gemakkelijk. Bovendien moeten de effecten van ultraviolette (UV) belichting en foto crosslinking-initiators op cellen mogelijk worden geëvalueerd. In tegenstelling hiermee maakt onze methode het mogelijk snelle isolatie van cellen na compressie experimenten voor post biologische assays omdat alginaat hydrogels snel kunnen worden gedepolymeriseerd door calcium chelatoren. De gedetailleerde apparatuur fabricage en karakterisatie methoden worden beschreven in dit protocol. Een korte procedure voor het vervaardigen van de microfluïdische chondrocyten compressie-inrichting wordt weergegeven in Figuur 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Draag persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) zoals handschoenen en Labcoat voor elke stap in dit protocol.
1. Master Mold fabricage
Opmerking: Voer stap 1,1-1,3 uit in een rook afzuigkap.
- Glas behandeling
Opmerking: Draag een gelaatsscherm, handschoenen en een Labcoat voor stap 1,1.- Maak Piranha-oplossing (60 mL) door zwavelzuur (H2dus4) en waterstofperoxide (h2O2) te mengen met een volume verhouding van 3:1.
Let op: gebruik geen Piranha-oplossing en aceton in dezelfde rook afzuigkap als gevolg van explosiegevaar. - Plaats een glasplaat (50,8 mm × 76,2 mm × 1,2 mm) in de Piranha-oplossing gedurende 30 minuten bij 40 °C.
- Spoel de glasplaat af met gedeïoniseerd water (diH2O).
- Plaats de glasplaat in aceton bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
- Spoel de glasplaat met isopropanol en droog deze met stikstof (N2) gas.
- Bak de glasplaat bij 200 °C gedurende 20 minuten op een kookplaat. Bij alle volgende bakstappen wordt een verwarmingsplaat gebruikt.
- Maak Piranha-oplossing (60 mL) door zwavelzuur (H2dus4) en waterstofperoxide (h2O2) te mengen met een volume verhouding van 3:1.
- SU-8 zaad lagen vorming op de glasplaat
- Verdeel de SU-8 5 op de glasplaat met een wegwerp pipet om ongeveer 2/3 van het oppervlak van de plaat te bedekken.
- Draai de glasplaat met SU-8 5 photoresisten bij 500 rpm voor 35 s (initiële spin cyclus) en vervolgens 2.500 rpm voor 40 s (Final Spinning Cycle) met behulp van een spin coater. Alle daaropvolgende spin coating stappen omvatten dezelfde initiële draaiende cyclus.
- Bak de SU-8 5 gecoate glasplaat bij 65 °C gedurende 2 minuten en daarna bij 95 °C gedurende 5 minuten.
- De SU-8 5 gecoate glasplaat blootstellen aan UV-licht (60 mW/cm2, afstand tussen UV-lamp en photomask is 20 cm, totale hoeveelheid UV-lichtenergie = 60 MJ/cm2) voor 1 s.
Opmerking: de UV-belichtingstijd moet worden aangepast aan de kracht van een gebruikt UV-licht. - Bak de SU-8 5 gecoate glasplaat bij 65 °C gedurende 2 minuten en bij 95 °C gedurende 5 minuten.
- Plaats de gebakken glasplaat in de SU-8 Developer voor 2 min.
- Bak de SU-8 5 gecoat glas bij 180 °C gedurende 20 min.
- SU-8 kanaal patroon fabricage met behulp van foto lithografie (Figuur 2a stap 1-3)
- Giet SU-8 100 op de SU-8 5 geseede glasplaat om ongeveer 2/3 van het oppervlak van de plaat te bedekken.
- Draai de glasplaat met SU-8 100 bij 3.000 rpm voor 38 s (≈ 90 μm dik).
- Bak de SU-8 100 gecoate glasplaat bij 65 °C gedurende 10 minuten en daarna bij 95 °C gedurende 30 minuten. Als SU-8 100 nog steeds plakkerig na deze procedure, bak de glasplaat voor een langere tijd bij 95 °C tot SU-8 100 niet kleverig wordt.
- Plaats een Microchannel photomask met hoge resolutie (25.400 dpi, Zie aanvullende figuur 1) op de SU-8 100 gecoate glasplaat en stel de glasplaat bedekt met een UV-licht voor 4 s (totale hoeveelheid UV-lichtenergie = 240 MJ/cm2).
Opmerking: de UV-belichtingstijd moet worden aangepast aan de kracht van een gebruikt UV-licht. - Verwijder de photomask van de glasplaat en bak de glasplaat bij 65 °C gedurende 2 minuten en daarna 95 °C gedurende 20 minuten.
- Houd de gebakken glasplaat in een container, die is verpakt met aluminiumfolie om elk licht te blokkeren, voor nachtelijke uitharding.
- Ontwikkel gedurende 15 minuten SU-8 100 kanaal patronen op de glasplaat van de SU-8 Developer.
- Was de SU-8 patroon glasplaat (Master Mold) met isopropylalcohol en droog het met N2 gas. Als witte deeltjes tijdens dit proces blijven, herhaalt u stap 7 voor 5 min.
2. pneumatische bedieningseenheid
- Microchannel Layer (laag 1)
Opmerking: Voer stap 2.1.1-2.1.2 uit in een rook afzuigkap.- Druppel 200 μL (Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl) -1-trichloorsilaan op een dekslip en plaats deze in een vacuümkamer met de Master mal.
- Breng 2 minuten vacuüm in de kamer en wacht 6 uur (of 's nachts) op silanisatie van de mal.
- Meng PDM'S met een gewichtsverhouding van 10:1 (prepolymer: Cure agent) gedurende 5 min.
Opmerking: alle volgende PDMS Casting stap bevat dezelfde prepolymer en Cure agent weight ratio (10:1). - Giet PDM'S op de Master Mold en Degas PDM'S in een vacuümkamer gedurende 30 min.
- Sandwich PDM'S met een stukje transparantie film.
- Klem de bovenstaande ingeklemd montage met een glasplaat, schuim pads en plexiglas platen (Figuur 2a stap 4).
- Genezen PDMS in een oven bij 80 °C gedurende 6 uur.
- Isoleer de PDMS-laag (Layer 1) met de transparantiefilm uit de ingeklemd structuur (Figuur 2a stap 5).
- Activeer oppervlakken van laag 1 en een schone glasplaat (glasplaat 1; 50,8 mm × 76,2 mm × 1,2 mm) met behulp van een plasma reiniger gedurende 1 minuut.
Opmerking: de plasma reinigingstijd kan variëren op basis van de kracht van een gebruikte plasma reiniger. - Hecht laag 1 op glasplaat 1 en plaats deze gedurende 30 minuten in de oven bij 80 °C.
- Verwijder de transparantie film uit laag 1.
- Dun PDMS membraan (Layer 2)
- Spin Coat niet-uitgeharde PDM'S op een transparantiefilm bij 1.000 rpm gedurende 1 minuut om een 60 μm dikke PDMS laag te verkrijgen.
- Gedeeltelijk genezen spin gecoate PDMS (Layer 2) in de oven bij 80 °C gedurende 20-30 min.
- Activeer laag 1 op glasplaat 1 en Layer 2 met behulp van de plasma reiniger gedurende 1 minuut.
Opmerking: de plasma reinigingstijd kan variëren op basis van de kracht van een gebruikte plasma reiniger. - Bind de laag 2 op laag 1 en plaats ze in de oven bij 80 °C 's nachts.
- Slang blok
- Leg metalen buizen verticaal op een petrischaaltje.
- Giet de PDM'S zachtjes in de schaal om ongeveer 3/4 van de metalen buizen te onderdompelen.
- Geneest PDM'S in de oven bij 60 °C gedurende 6 uur (of 's nachts).
- Knip een stukje PDMS blok met één metalen buis.
- Punch een gat op Layer 2 voor de inlaat.
- Activeer de PDMS Block en Layer 2 met behulp van de plasma reiniger gedurende 1 min.
- Bevestig het blok PDMS op het inlaat gedeelte van laag 2 en plaats de gehele bedieningseenheid in de oven op 80 °C voor een overnachting.
3. alginaat-Chondrocyte (of kraal) constructies
- Aminosilanized glasplaat
- Knip een glasplaat (50,8 mm × 76,2 mm × 1,2 mm) in twee half-sized glasplaten (50,8 mm × 38,1 mm × 1,2 mm) met behulp van een diamant scriber.
- Plaats de glasplaten in 0,2 M waterstofchloride (HCl) en schud zachtjes (bijv. 55 rpm) ze 's nachts.
- Spoel de glasplaten af met diH2O.
- Schud de glasplaten in 0,1 M natriumhydroxide (NaOH) voor 1 uur bij 55 rpm en spoel ze af met diH2O.
- Schud de glasplaten in 1% (v/v) 3-aminopropyltrimethoxysilaan (APTES) voor 1 uur bij 55 rpm en spoel ze af met diH2O.
- Droog de met aminosilanized glasplaten 's nachts in een rook afzuigkap.
- Agarose gel schimmel voor alginaat gel constructies
- Meng 5% (w/v) agarose en 200 mM calciumchloride (CaCl2) in dih2O.
- Kook de agarose-geloplossing met een microgolfoven (of een kookplaat). De kooktijd varieert afhankelijk van het volume van de agarose-geloplossing en de kracht van de magnetron (of de temperatuur van de verwarmingsplaat).
- Giet de gekookte agarose-geloplossing op een aluminium mal (Zie aanvullende figuur S2) en sandwich met een glasplaat.
- Wacht 5 min en ontvorm de gestukte agarose gel uit de aluminium mal.
- Groei plaat chondrocyten oogst
- Isoleer de groei platen van de achterpoten van neonatale muizen.
- Plaats de groei plaatjes in 1 mL van 0,25% Collagenase voor 3 uur in een incubator bij 37 °C en 8% koolstofdioxide (CO2) om de extracellulaire matrix (ECM) te verwijderen.
- Centrifugeer het verteerde monster gedurende 5 minuten bij 125 x g om een chondrocyten pellet te maken en verwijder supernatant uit het monster. Hier, 1 x g is de versnelling van de zwaartekracht.
- Rebreng de chondrocyten pellet in 1 mL van Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM).
- Tel het aantal chondrocyten in DMEM met behulp van een celteller.
- Centrifugeer de chondrocyten in DMEM gedurende 5 minuten bij 125 x g om een chondrocyten pellet opnieuw te maken en verwijder supernatant uit het monster.
- Voer desgewenst de chondrocyten pellet in de chondrocyten culture media (CCM)34 met 2 μM calceïne am uit en inbroed het monster gedurende 30 minuten bij 37 °c. Herhaal stap 3.3.6 en ga naar stap 3.3.8.
- Rebreng de chondrocyten pellet in een gewenst volume CCM en bewaar ze in de incubator bij 37 °C en 8% CO2 voor gebruik.
- Alginaat-chondrocyten (of kraal) constructies (figuur 2c)
- Meng 1,5% (w/v) alginaat in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) met 5 mg/mL sulfo-NHS, 10 mg/mL 1-ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl) carbodiimidehydrochloride (EDC).
- Voeg 8 x 106 chondrocyten toe aan de 1 ml alginaatgel oplossing [of Voeg 3 μL fluorescerende parels van 1 μm (542/612 nm) toe in 1 ml alginaatgel oplossing (0,3% (v/v))].
- Plaats 150 μL van de oplossing alginaat-chondrocyten (of kraal) op de in stap 3,1 vervaardigde aminosilanized glasplaat.
- Bedek de alginaatgel oplossing met de agarose gel Mold gedurende 3 min.
- Verwijder overmatige alginaatgel oplossing die overstroomt van de agarose-gelmal met een scheermesje en verwijder de agarose-gelmal. Vervolgens worden cilindrische alginaat-chondrocyten (of kraal) constructies verkregen op de met aminosilanized glasplaat.
- Plaats de alginaat-chondrocyten constructies in dwars koppelings oplossing (50 mM CaCl2 /140 mm NaCl in dih2O) gedurende 1 minuut voor verdere polymerisatie.
4. apparaatmontage (figuur 2D)
Opmerking: PDMS spacers en 3D gedrukte klemmen moeten apart worden klaargemaakt.
- Zoek vier 1 mm dikke PDMS spacers op de vier hoeken van de Layer 2 van de bediening unit.
- Plaats 700 μL CCM om de luchtkamers van laag 2 te bedekken.
- Plaats de alginaat-Chondrocyte (of kraal) constructies op laag 2 terwijl de constructies voorzichtig met de luchtkamers worden uitgelijnd.
- Klem het apparaat met 3D-gedrukte klemmen (figuur 1c).
5. bediening van het apparaat
- Sluit de uitlaat van een luchtpomp aan (Zie tabel met materialen) met de inlaat van een magneetventiel met een silicium slang.
- Sluit de uitlaat van de magneetklep aan op de inlaat van de gemonteerde inrichting met een silicium slang.
- Sluit de magneetklep aan op een functiegenerator.
- Manipuleer de magneetklep met een vierkante Golf (bijv. 1 Hz) die door de functiegenerator wordt gegenereerd.
- Zet de luchtpomp aan om het apparaat pneumatisch te bedienen.
6. beeldvorming van chondrocyten in het apparaat
Opmerking: voor het verkrijgen van een goede beeldkwaliteit, beeld chondrocyten (of fluorescerende kralen) in alginaat gel door glasplaat 2 omdat uitgebreide PDMS ballonnen en luchtkamers optische beelden kunnen verstoren. Als een omgekeerde Microscoop wordt gebruikt voorbeeld vorming, moet het apparaat zo worden ingesteld dat glasplaat 2 naar beneden wordt gericht.
- Bereid het apparaat met chondrocyten (of fluorescerende kralen) zoals weergegeven in de vorige secties.
- Neem z-stack beelden van chondrocyten (of fluorescerende kralen) met een confocale Microscoop vóór en onder compressie, respectievelijk. Kies een z-stap maat op basis van de scherptediepte van een gebruikt confocale beeldvormings systeem.
- De hoogte van chondrocyten (of een alginaat-kraal construct) kan worden gemeten met de automatische beeldverwerkings methode die wordt weergegeven in vorige literaturen26,35.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit artikel toont gedetailleerde stappen van de microfluïdische chondrocyten compressie apparaat fabricage (Figuur 2). Het apparaat bevat een 5 x 5 matrices van cilindrische alginaat-chondrocyten constructies, en deze constructies kunnen worden gecomprimeerd met vijf verschillende magnitudes van compressie (Figuur 1, Figuur 3 en Figuur 4). De hoogte van het pneumatische micro kanaal is ongeveer 90 μm en de ballon diameters van de PDMS zijn respectievelijk 1,2, 1,4, 1,6, 1,8 en 2,0 mm. De prestaties van het apparaat werden gekwantificeerd met confocale microscopie met statische compressie condities en beeldverwerking. Statische compressie werd gebruikt voor de microscopische beeldvorming omdat de z-stack Imaging met de confocale microscopie een paar minuten duurt, dus het is te traag voor kwantitatieve beeldvorming tijdens de dynamische compressie.
Afbeelding 3a toont de 5 × 5 arrays van alginaat hydrogel kolommen (diameter: ~ 0,8 mm, hoogte: ~ 1 mm) gegoten op glasplaat 2. Deze gel constructies werden afgebeeld door het toevoegen van fluorescerende kralen in de gel. Afbeelding 3B toont een voorbeeld van een geval waarin de gelkolom is gecomprimeerd met 33,8% in hoogte door de grootste PDMS-ballon. De resulterende druk spanning van de gel constructies steeg met ongeveer 5% per 0,2 mm toename in de ballon diameter van de PDMS zoals weergegeven in figuur 3c.
De compressieve vervorming van chondrocyten werd bepaald door beeldvorming van de cellen in een 613 μm × 613 μm × 40 – 55 μm (x × y × z) volume in de buurt van het gel construct centrum zoals afgebeeld in figuur 4a. Afbeelding 1d toont een voorbeeldafbeelding van een chondrocyten die met 16% is gecomprimeerd door de grootste PDMS-ballon. Afbeelding 4b toont de verdeling van de gemeten celcompressie stam waarden, en de totale cellen werden meer gecomprimeerd door grotere PDMS-ballonnen. Daarom werden de hoeveelheid alginaatgel en chondrocyten compressie bepaald door de diameter van de PDMS-ballonnen (Figuur 3 en Figuur 4) met een constante druk van 14 kPa.
Figuur 1. Microfluïdische chondrocyten compressie apparaat.
a) Schematische voorstelling van de gemonteerde inrichting. Een 5 × 5 array van alginaat – chondrocyten constructies zijn uitgelijnd op PDMS-ballonnen met 5 verschillende diameters (d = 1,2, 1,4, 1,6, 1,8 en 2,0 mm), waarbij D de diameter is van de PDMS-ballon (of luchtkamer). b) Schematische werking van de bediening van het apparaat. Het apparaat wordt bediend door pneumatische druk die de PDMS-ballonnen uitbreidt. c) beeld van een daadwerkelijk apparaat (munt diameter = 19 mm). d) verticale dwarsdoorsneden van een chondrocyten vóór (links) en onder (rechts) compressie op de grootste PDMS-ballon (d = 2,0 mm) (celcompressieve stam, εCell = | celhoogte wijzigen/initiële celhoogte | x 100 = 16%). Dit cijfer is overgenomen uit 26.
Figuur 2. Gedetailleerde stappen van microfluïdische chondrocyten compressie apparaat fabricage.
a) fotolithografie voor het genereren van een su-8 Master Mold en het volgen van zachte lithografie voor het maken van een PDMS laag met pneumatische microkanalen (Layer 1). b) dun PDMS-membraan (laag 2) op een door spin coating gegenereerde transparantie film. c) cilindrische alginaatgel-giet methode op glas (glasplaat 2). d) montage van de microfluïdische chondrocyten compressie-inrichting. Dit cijfer is overgenomen uit 26. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te downloaden.
Figuur 3. Meting van alginaat gelvervorming bij statische compressie.
a) 5 x 5 matrices van cilindrische alginaatgel constructies (diameter: ~ 800 μm, hoogte: ~ 1 mm). b) alginaatgel, gecomprimeerd met de grootste PDMS-ballon (D = 2,0 mm). De compressieve stam van de alginaatgel is 33,8%. c) compressieve stam van alginaatgel (εgel) stijgt ongeveer 5% per 0,2 mm increment van PDMS ballon diameter (D). Foutbalk: standaarddeviatie. Rode lijn: lineaire fitting lijn dit cijfer is gereproduceerd van 26.
Figuur 4. Meting van chondrocyten vervorming bij statische compressie.
a) een z-stack afbeelding [613 μm × 613 μm × 40 – 55 μm (x × y × z)] werd in het midden van de gel constructie verkregen, 300 – 400 μm van de gel bodem. b) verschillende magnitudes van chondrocyten compressieve stam (εCell) resulteerden in een functie van de ballon diameter (D) van de PDMS. 
: gemiddelde waarden. 
: elke gegevenspunten. Boven (of onder) en middelste lijnen van het vak zijn respectievelijk de standaarddeviatie en de mediaanwaarde. Dit cijfer is overgenomen uit 26.
Afbeelding S1. Microchannel photomask-ontwerp voor stap 1.3.4 (eenheid = mm). Klik hier om dit cijfer te downloaden.
Figuur S2. Aluminium mal ontwerp voor stap 3.2.3 (eenheid = mm). Klik hier om dit cijfer te downloaden.
Figuur S3. Permanente vervorming van de alginaatgel (1,5%, w/v) onder 1 h-lange dynamische (1 Hz) en statische compressie. Dit cijfer is overgenomen uit 26. Klik hier om dit cijfer te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om de effecten van druk stress op de groei plaat chondrocyten te testen, ontwikkelden we de microfluïdische chondrocyten compressie-inrichting (Figuur 1) om verschillende niveaus van druk stress toe te passen op de chondrocyten in de alginaat hydrogel steiger voor 3D cultuur in hoge doorvoer wegen. Om andere onderzoekers te helpen om ons apparaat aan te nemen of om soortgelijke apparaten te ontwikkelen, hebben we details gegeven van de stappen voor het fabricage apparaat in dit protocol artikel.
De cruciale stappen in dit protocol zijn 1) het vervaardigen van de PDMS-laag met pneumatische microkanalen (Layer 1) zonder luchtbellen, omdat luchtbellen in laag 1 pneumatische microkanalen kunnen beschadigen terwijl de achtergrond transparantiefilm wordt afgepeld, 2) het behoud van een constante temperatuur (bijv. 80 °C) voor het uitharden van PDMS-ballonnen (Layer 2) omdat de elasticiteit van PDMS afhankelijk is van de Uithardings temperatuur36, 3) het uitlijnen van de alginaatgel constructies met de PDMS-ballonnen en 4) met behulp van vers aminosilanized glas plaat (glasplaat 2) voor het verlijmen van de alginaatgel kolommen op glasplaat 2 binnen twee dagen na de verzilting behandeling.
De belangrijkste beperking van dit protocol is dat het relatief arbeidsintensief is om het apparaat te fabriceren omdat het proces foto lithografie en meerdere stappen van zachte lithografie omvat. Bovendien moeten de prestaties van microfluïdische celcompressie apparaten die zijn gefabriceerd op basis van ons protocol worden geëvalueerd wanneer verschillende soorten hydrogels en cellen worden gebruikt. Dit is omdat eventuele verschillen in de mechanische eigenschappen van hydrogels en cellen van invloed zijn op de prestaties van het apparaat.
Hoewel onze microfluïdische celcompressie-apparaat is voor het toepassen van dynamische compressie op chondrocyten, de prestaties ervan werd geëvalueerd door beeldvormende statisch gecomprimeerde alginaat gels en cellen. Dit is omdat het moeilijk is om de afbeelding gels en cellen onder dynamische compressie met de conventionele confocale microscopie. We vergeleek statische (14 kPa, 1 uur) en dynamische compressie (14 kPa, 1 Hz, 1 uur) in termen van de permanente vervorming van alginaatgel en stelden vast dat de permanente vervorming van de gel onder de dynamische compressie verwaarloosbaar was in vergelijking met de statische compressie (Zie Aanvullende figuur S3).
Een voordeel van onze methode is dat het kan worden gebruikt voor andere celtypen die 3D-cultuur omgeving nodig hebben. De resulterende compressie van het apparaat kan worden gemoduleerd afhankelijk van toepassingen door de diameter en dikte van de PDMS-ballonnen en/of de druk in de ballon te wijzigen. Het is ook mogelijk om de elasticiteit van de PDMS-ballon te wijzigen door de mengverhouding tussen het prepolymer en het Uithardings middel aan te passen. Cellen in dit apparaat kunnen in real-time worden afgebeeld met behulp van licht/fluorescentiemicroscopie, en het apparaat kan snel worden gedemonteerd voor celoogst om downstreamanalyse mogelijk te maken. Een ander voordeel is de mogelijkheid om vijf verschillende mechanische stress niveaus te genereren met vijf technische replicaties per stressniveau met behulp van één apparaat. Het combineren van replicatie en een dosis-respons analyse zorgt voor een hoge mate van strengheid en reproduceerbaarheid in de resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We bedanken drs. Christopher Moraes en Stephen A. Morin voor hun ondersteuning voor apparaatontwerp en fabricage. Deze studie werd ondersteund door Bioengineering for Human Health Grant van de University of Nebraska-Lincoln (UNL) en de University of Nebraska Medical Center (UNMC), en Grant AR070242 van de NIH/NIAMS. We danken Janice A. Taylor en James R. Talaska van de geavanceerde microscopie kern faciliteit aan de Universiteit van Nebraska Medical Center voor het verlenen van hulp met confocale microscopie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (ATPES) | Sigma-Aldrich | 741442-100ML | |
| (Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane | United Chemical Technologies | T2492-KG | |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K354 | |
| Air pump | Schwarzer Precision | SP 500 EC-LC4.5V DC | We used the model purchased in 2015. The internal design and performance of air pump (SP 500 EC-LC) changed in early 2016. Also, air pump performance has changed in the course of time. Thus, air pressure generated by an SP 500 EC-LC air pump should be calibrated before use. |
| Alginate powder | FMC Corporation | Pronova UP MVG | |
| Barb Straight Connectors (Metal tube) | Pneumadyne | EB40-250 | |
| Calcein AM | Invitrogen | C3100MP | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| Dyed red aqueous fluorescent particles | Thermo Fisher Scientific | R0100 | |
| EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | 22980 | |
| Foam pad | GRAINGER | Item # 5GCE8 | |
| Function / Arbitrary Waveform Generator | Keysight Technologies | 33210A | |
| Hydrochloric acid | Fisher Chemical | A144-500 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher BioReagents | BP2633500 | |
| Isopropyl alcohol | BDH1174-4LP | VWR | |
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 22-267-013 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Power supply | Keysight Technologies | E3630A | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S318-1 | |
| Solenoid manifold | Pneumadyne | MSV10-1 | |
| Solenoid valve | Pneumadyne | S10MM-30-12-3 | |
| Spin coater | Laurell Technologies | WS-650Mz-23NPPB | |
| SU8 Developer | MicroChem Corp. | Y020100 4000L1PE | |
| SU8-100 | MicroChem Corp. | Y131273 0500L1GL | |
| SU8-5 | MicroChem Corp. | Y131252 0500L1GL | |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Thermo Fisher Scientific | 24510 | |
| Sulfuric acid | EMD Millipore | MSX12445 |
References
- Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Analytical Chemistry. 76 (18), 5257-5264 (2004).
- Malek, A. M., Izumo, S. Mechanism of endothelial cell shape change and cytoskeletal remodeling in response to fluid shear stress. Journal of Cell Science. 109 (4), 713-726 (1996).
- Paguirigan, A. L., Beebe, D. J. Microfluidics meet cell biology: bridging the gap by validation and application of microscale techniques for cell biological assays. BioEssays. 30 (9), 811-821 (2008).
- García-Cardeña, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (8), 4478-4485 (2001).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Moraes, C., Chen, J. H., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated arrays for high-throughput screening of cellular response to cyclic substrate deformation. Lab on a Chip. 10 (2), 227-234 (2010).
- Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays. Biomaterials. 31 (3), 577-584 (2010).
- Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnology and Bioengineering. 102 (2), 632-643 (2009).
- Bougault, C., Paumier, A., Aubert-Foucher, E., Mallein-Gerin, F. Molecular analysis of chondrocytes cultured in agarose in response to dynamic compression. BMC Biotechnology. 8 (1), 71 (2008).
- Kaviani, R., Londono, I., Parent, S., Moldovan, F., Villemure, I. Compressive mechanical modulation alters the viability of growth plate chondrocytes in vitro. Journal of Orthopaedic Research. 33 (11), 1587-1593 (2015).
- Ménard, A. L., et al. In vivo dynamic loading reduces bone growth without histomorphometric changes of the growth plate. Journal of Orthopaedic Research. 32 (9), 1129-1136 (2014).
- Robling, A. G., Duijvelaar, K. M., Geevers, J. V., Ohashi, N., Turner, C. H. Modulation of appositional and longitudinal bone growth in the rat ulna by applied static and dynamic force. Bone. 29 (2), 105-113 (2001).
- Sergerie, K., et al. Growth plate explants respond differently to in vitro static and dynamic loadings. Journal of Orthopaedic Research. 29 (4), 473-480 (2011).
- Valteau, B., Grimard, G., Londono, I., Moldovan, F., Villemure, I. In vivo dynamic bone growth modulation is less detrimental but as effective as static growth modulation. Bone. 49 (5), 996-1004 (2011).
- Walsh, A. J. L., Lotz, J. C. Biological response of the intervertebral disc to dynamic loading. Journal of Biomechanics. 37 (3), 329-337 (2004).
- Zimmermann, E. A., et al. In situ deformation of growth plate chondrocytes in stress-controlled static vs dynamic compression. Journal of Biomechanics. 56, 76-82 (2017).
- Akyuz, E., Braun, J. T., Brown, N. A. T., Bachus, K. N. Static versus dynamic loading in the mechanical modulation of vertebral growth. Spine. 31 (25), E952-E958 (2006).
- Alberty, A., Peltonen, J., Ritsilä, V. Effects of distraction and compression on proliferation of growth plate chondrocytes: A study in rabbits. Acta Orthopaedica Scandinavica. 64 (4), 449-455 (1993).
- Amini, S., Veilleux, D., Villemure, I. Tissue and cellular morphological changes in growth plate explants under compression. Journal of Biomechanics. 43 (13), 2582-2588 (2010).
- Aronsson, D. D., Stokes, I. A. F., Rosovsky, J., Spence, H. Mechanical modulation of calf tail vertebral growth: implications for scoliosis progression. Journal of Spinal Disorders. 12 (2), 141-146 (1999).
- Cancel, M., Grimard, G., Thuillard-Crisinel, D., Moldovan, F., Villemure, I. Effects of in vivo static compressive loading on aggrecan and type II and X collagens in the rat growth plate extracellular matrix. Bone. 44 (2), 306-315 (2009).
- Reich, A., et al. Weight loading young chicks inhibits bone elongation and promotes growth plate ossification and vascularization. Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2381-2389 (2005).
- Stokes, I. A., Mente, P. L., Iatridis, J. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. Enlargement of growth plate chondrocytes modulated by sustained mechanical loading. Journal of Bone and Joint Surgery. 84 (10), 1842-1848 (2002).
- Stokes, I. A. F., Clark, K. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. Alterations in the growth plate associated with growth modulation by sustained compression or distraction. Bone. 41 (2), 197-205 (2007).
- Lee, D., Erickson, A., Dudley, A. T., Ryu, S. Mechanical stimulation of growth plate chondrocytes: previous approaches and future directions. Experimental Mechanics. , (2018).
- Lee, D., Erickson, A., You, T., Dudley, A. T., Ryu, S. Pneumatic microfluidic cell compression device for high-throughput study of chondrocyte mechanobiology. Lab on a Chip. 18 (14), 2077-2086 (2018).
- Guilak, F. Compression-induced changes in the shape and volume of the chondrocyte nucleus. Journal of Biomechanics. 28 (12), 1529-1541 (1995).
- Knight, M. M., Ghori, S. A., Lee, D. A., Bader, D. L. Measurement of the deformation of isolated chondrocytes in agarose subjected to cyclic compression. Medical Engineering & Physics. 20 (9), 684-688 (1998).
- Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated platforms for mechanically dynamic cell culture. Journal of Visualized Experiments. (46), e224 (2010).
- Sim, W. Y., et al. A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation. Lab on a Chip. 7 (12), 1775-1782 (2007).
- Hosmane, S., et al. Valve-based microfluidic compression platform: single axon injury and regrowth. Lab on a Chip. 11 (22), 3888-3895 (2011).
- Ho, K. K. Y., Wang, Y. L., Wu, J., Liu, A. P. Advanced microfluidic device designed for cyclic compression of single adherent cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6 (148), (2018).
- Seo, J., et al. Interconnectable dynamic compression bioreactors for combinatorial screening of cell mechanobiology in three dimensions. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (16), 13293-13303 (2018).
- Erickson, A. G., et al. A tunable, three-dimensional in Vitro culture model of growth plate cartilage using alginate hydrogel acaffolds. Tissue Engineering Part A. 24 (1-2), 94-105 (2018).
- Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement. Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).
- Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).
