Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

En Mikrofluidisk plattform för att stimulera kondrocyter med dynamisk kompression

Published: September 13, 2019 doi: 10.3791/59676
Automatic Translation
1, 2, 1, 3,4
1Department of Genetics, Cell Biology and Anatomy, University of Nebraska Medical Center, 2Department of Physiology and Pharmacology, Karolinska Institutet, 3Department of Mechanical and Materials Engineering, University of Nebraska-Lincoln, 4Nebraska Center for Materials and Nanoscience, University of Nebraska-Lincoln

Summary

Den här artikeln innehåller detaljerade metoder för att tillverka och karakterisera en pneumatiskt aktiverande mikrofluidisk enhet för Chondrocyte-komprimering.

Abstract

Mekaniska stimuli är kända för att modulera biologiska funktioner av celler och vävnader. Nyligen genomförda studier har föreslagit att kompressiv stress förändrar tillväxtplattan brosk arkitektur och resulterar i tillväxt modulering av långa ben av barn. För att avgöra vilken roll kompressiv stress i bentillväxt, skapade vi en mikroflödessystem enhet aktiveras av pneumatiskt tryck, att dynamiskt (eller statiskt) komprimera tillväxtplattan kondrocyter inbäddade i natriumalginat hydrogel cylindrar. I den här artikeln beskriver vi detaljerade metoder för att tillverka och karakterisera den här enheten. Fördelarna med vårt protokoll är: 1) fem olika magnituder av tryckhållfasthet kan genereras på fem tekniska replikat i en enda plattform, 2) det är lätt att visualisera cellmorfologin via ett konventionellt ljusmikroskop, 3) celler kan snabbt isoleras från enheten efter komprimering för att underlätta nedströms analyser, och 4) plattformen kan tillämpas för att studera mechanobiologi av någon celltyp som kan växa i hydrogels.

Introduction

Mikro-Engineered plattformar är värdefulla verktyg för att studera molekylär, cellulära och vävnadsnivå biologi eftersom de möjliggör dynamisk kontroll av både fysiska och kemiska mikromiljöer1,2,3 ,4,5,6,7,8. Således kan flera hypoteser testas samtidigt på ett väl kontrollerat sätt. När det gäller tillväxtplattan brosk, det finns ökande belägg för en viktig roll av tryckhållfasthet stress i modulerande bentillväxt genom åtgärder på tillväxtplattan brosk9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25. Men verkningsmekanismen för tryckhållfasthet-i synnerhet hur stress styr bildandet av Chondrocyte kolumner i tillväxtplattan-är dåligt förstådd.

Målet med detta protokoll är att skapa en pneumatiskt manövrerande mikrofluidisk Chondrocyte-komprimeringsenhet26 för att belysa mekanismerna för mechanobiologi i tillväxtplattan kondrocyter (figur 1a-c). Anordningen består av två delar: den pneumatiska aktiverings enheten och alginatgelkonstruktionen. Den mikrofluidiska pneumatiska aktiverings enheten är tillverkad med Polydimetylsiloxan (PDMS) baserad på foto-och mjuk litografi. Denna enhet innehåller en 5 x 5 array av tunna PDMS membran ballonger som kan pumpas på olika sätt baserat på deras diameter. Alginatgelkonstruktionen består av de kondrocyter som är inbäddade i en 5 x 5 uppsättning alginatgelcylindrar, och hela alginat-Chondrocyte-konstrukterna monteras med aktiverings enheten. Alginatgelkonstruktioner komprimeras av de pneumatiskt uppblåsta PDMS-ballongerna (figur 1b). Den mikroflödessystem enheten kan generera fem olika nivåer av kompressiv stress samtidigt i en enda plattform baserad på skillnader i PDMS ballong diameter. Således är ett högt genomflöde test av Chondrocyte Mekanobiologi under flera kompressionsförhållanden möjligt.

Den mikroflödessystem anordning beskrev i denne protokoll har många forellerna över den traditionell sammantryckningen anordning sådan som yttre fixeringssystemen14,21,23 och makroskopiska sammantryckningen anordningen16, 19 , 27 , 28 för att studera Chondrocyte mechanobiology: 1) den mikroflödessystem enheten är kostnadseffektiv eftersom den förbrukar mindre volym av prover än den makroskopiska komprimerings enhet, 2) den mikroflödessystem enheten är tidseffektiv eftersom den kan testa flera kompressionsförhållanden samtidigt, 3) den mikroflödessystem enheten kan kombinera mekaniska och kemiska stimuli genom att bilda en koncentration gradient av kemikalier baserade på den begränsade blandningen i mikrokanaler, och 4) olika mikroskopi tekniker (Time-lapse mikroskopi och fluorescenskonfokalmikroskopi) kan appliceras med mikroflödessystem-enheten gjord av transparenta PDMS.

Vi antog och modifierade metoden för Moraes et al.7,29 för att skapa olika tryck stressnivåer i en enda enhet för att möjliggöra hög genomströmning Mekanobiologi studier av Chondrocyte komprimering. Vårt tillvägagångssätt är lämpligt för celler (t. ex. chondrocyter) som behöver tredimensionell (3D) kulturmiljö och för biologiska analyser efter att komprimera celler. Även om vissa mikroflödessystem cell komprimerings enheter kan komprimera celler odlade på tvådimensionella (2D) substrat30,31,32, kan de inte användas för chondrocyter eftersom 2D odlade kondrocyter Dedifferentiering. Det finns mikroflödessystem plattformar för att komprimera 3D odlade celler i photopolymerized hydrogeler7,33, men de är begränsade i isolerar celler efter kompressions experiment eftersom isolera celler från photopolymerized hydrogel är inte lätt. Dessutom kan effekterna av ultraviolett (UV) exponering och foto crosslinking initierare på celler behöva utvärderas. I kontrast, vår metod tillåter snabb isolering av celler efter kompressions experiment för post biologiska analyser eftersom natriumalginat hydrogeler kan depolymeriseras snabbt av kalciumkelatorer. De detaljerade metoderna för enhets tillverkning och karakterisering beskrivs i detta protokoll. Ett kort förfarande för att tillverka den mikrofluidiska Chondrocyte-komprimeringsenheten visas i figur 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Obs: Använd personlig skyddsutrustning såsom handskar och labbrock för varje steg i detta protokoll.

1. Master mögel tillverkning

Obs: Utför steg 1,1-1,3 i ett draghuv.

  1. Glas behandling
    Obs: Använd en ansiktsskärm, handskar och en labbrock för steg 1,1.
    1. Gör Piranha-lösning (60 mL) genom att blanda svavelsyra (H2so4) och väteperoxid (h2O2) med ett volym förhållande på 3:1.
      FÖRSIKTIGHET: Använd inte Piranha-lösning och aceton i samma draghuv på grund av explosionsrisken.
    2. Placera en glasskiva (50,8 mm × 76,2 mm × 1,2 mm) i Piranha-lösning i 30 minuter vid 40 ° c.
    3. Skölj glasplattan med avjoniserat vatten (diH2O).
    4. Placera glasplattan i aceton i rumstemperatur i 10 minuter.
    5. Skölj glasplattan med isopropanol och torka den med kväve (N2) gas.
    6. Baka glasplattan vid 200 ° c i 20 min på en värmeplatta. Alla efterföljande bakning steg använder en värmeplatta.
  2. SU-8 frö lager formation på glasplattan
    1. Sprid SU-8 5 på glasplattan med en engångspipett för att täcka runt 2/3 av plattans yta.
    2. Snurra glasplattan med SU-8 5 photoresists på 500 rpm för 35 s (initial spinning cykel) och sedan 2 500 rpm för 40 s (Final spinning Cycle) med hjälp av en spin coater. Alla efterföljande spinn beläggnings steg inkluderar samma inledande snurrande cykel.
    3. Baka SU-8 5 belagda glasplattan vid 65 ° c för 2 min och sedan vid 95 ° c i 5 min.
    4. Exponera SU-8 5 belagda glasplattan till UV-ljus (60 mW/cm2, avståndet mellan UV-lampa och photomasken är 20 cm, total mängd UV-ljusenergi = 60 MJ/cm2) för 1 s.
      Observera: UV-exponeringstid bör justeras efter kraften hos ett använt UV-ljus.
    5. Baka SU-8 5 belagda glasplattan vid 65 ° c i 2 min och vid 95 ° c i 5 min.
    6. Placera den bakade glasplattan i SU-8 utvecklare för 2 min.
    7. Baka SU-8 5 belagt glas vid 180 ° c i 20 min.
  3. SU-8 kanal mönster tillverkning med Photolithography (figur 2A steg 1-3)
    1. Häll SU-8 100 på SU-8 5 seedade glasplattan för att täcka runt 2/3 av plattans yta.
    2. Snurra glasplattan med SU-8 100 vid 3 000 RPM för 38 s (≈ 90 μm tjockt).
    3. Baka SU-8 100 belagda glasplattan vid 65 ° c i 10 min och sedan vid 95 ° c i 30 min. Om SU-8 100 är fortfarande klibbigt efter detta förfarande, baka glasplattan för en längre tid vid 95 ° c tills SU-8 100 blir icke-klibbiga.
    4. Placera en högupplöst MicroChannel-photomasken (25 400 dpi, se kompletterande figur 1) på SU-8 100 belagda glasplattan och exponera photomasken täckta glasplattan till UV-ljus för 4 s (total mängd UV-ljusenergi = 240 MJ/cm2).
      Observera: UV-exponeringstid bör justeras efter kraften hos ett använt UV-ljus.
    5. Ta bort photomasken från glasplattan och baka glasplattan vid 65 ° c i 2 min och sedan 95 ° c i 20 min.
    6. Förvara den bakade glasplattan i en behållare, som är insvept med aluminiumfolie för att blockera något ljus, för övernattning härdning.
    7. Utveckla SU-8 100 kanal mönster på glasplattan i SU-8 utvecklare för 15 min.
    8. Tvätta SU-8 mönstrad glasplatta (Master Mold) med isopropylalkohol och torka den med N2 gas. Om vita partiklar kvarstår under denna process, upprepa steg 7 för 5 min.

2. pneumatisk manöverenhet

  1. MicroChannel-skikt (Layer 1)
    Anmärkning: Utför steg 2.1.1-2.1.2 i ett draghuv.
    1. Släpp 200 μL av (Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl) -1-Triklorosilane på en täckglas och placera den i en vakuumkammare med befälhavaren mögel.
    2. Applicera vakuum för 2 min i kammaren och vänta 6 h (eller över natten) för silanisering av mögel.
    3. Blanda PDMS med ett viktförhållande på 10:1 (prepolymer: härdningsmedel) i 5 min.
      Anmärkning: alla efterföljande PDMS gjutning steg innehåller samma prepolymer och härdning agent viktförhållande (10:1).
    4. Häll PDMS på Master mögel och Degas PDMS i en vakuumkammare i 30 min.
    5. Sandwich PDMS med en bit av OH-film.
    6. Kläm fast den ovan inklämta enheten med en glasplatta, skum kuddar och plexiglasplattor (figur 2A steg 4).
    7. Cure PDMS i en ugn vid 80 ° c för 6 h.
    8. Isolera PDMS-skiktet (Layer 1) med OH-filmen från den inklämta strukturen (figur 2A steg 5).
    9. Aktivera ytor av lager 1 och en ren glasplatta (glasplatta 1; 50,8 mm × 76,2 mm × 1,2 mm) med en plasma renare i 1 min.
      Obs: plasma rengöringstiden kan variera beroende på kraften hos en begagnad plasma renare.
    10. Bond Layer 1 på glasplattan 1 och placera dem i ugnen vid 80 ° c i 30 min.
    11. Ta bort OH-filmen från Layer 1.
  2. Tunt PDMS-membran (Layer 2)
    1. Spin Coat ohärdat PDMS på en OH-film på 1 000 rpm i 1 min för att få ett 60 μm tjockt PDMS skikt.
    2. Delvis bota spin belagda PDMS (Layer 2) i ugnen vid 80 ° c för 20-30 min.
    3. Aktivera Layer 1 på glasplattan 1 och Layer 2 med hjälp av plasma rengöraren i 1 min.
      Obs: plasma rengöringstiden kan variera beroende på kraften hos en begagnad plasma renare.
    4. Bond lagret 2 på lager 1 och placera dem i ugnen vid 80 ° c över natten.
  3. Rör block
    1. Placera metall rören vertikalt på en petriskål.
    2. Häll försiktigt PDMS i skålen för att dränera ca 3/4 av metall rören.
    3. Bota PDMS i ugnen vid 60 ° c för 6 h (eller över natten).
    4. Skär en bit PDMS block som innehåller en metallrör.
    5. Slå ett hål på Layer 2 för inloppet.
    6. Aktivera PDMS-blocket och Layer 2 med plasma rengöraren i 1 min.
    7. Fäst PDMS block på inlopps delen av Layer 2 och placera hela aktiverings enheten i ugnen vid 80 ° c för övernattning.

3. alginat-Chondrocyte (eller pärla) konstruktioner

  1. Amino-silanized glass pläterar
    1. Skär en glasskiva (50,8 mm × 76,2 mm × 1,2 mm) i två halvstora Glasplattor (50,8 mm × 38,1 mm × 1,2 mm) med hjälp av en diamant scriber.
    2. Placera glasplattorna i 0,2 M väteklorid (HCl) och skaka försiktigt (t. ex. 55 rpm) dem över natten.
    3. Skölj glasplattorna med diH2O.
    4. Skaka glasplattorna i 0,1 M natriumhydroxid (NaOH) för 1 h vid 55 rpm och skölj dem med diH2O.
    5. Skaka glasplattorna i 1% (v/v) 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTES) för 1 h vid 55 rpm och skölj dem med diH2O.
    6. Torka de amino-silanized glasplattorna i ett dragskåp över natten.
  2. Aguppstod gel mögel för natriumalginat gel konstruktioner
    1. Blanda 5% (w/v) Agreste och 200 mM kalciumklorid (CaCl2) i dih2O.
    2. Koka agaros gellösningen med en mikrovågsugn (eller en värmeplatta). Koktiden varierar beroende på volymen av aguppstod gel lösning och kraften i mikrovågsugnen (eller temperaturen på värmeplattan).
    3. Häll kokt aguppstod gel lösning på en aluminium mögel (se kompletterande figur S2), och smörgås den med en glasplatta.
    4. Vänta 5 min och unmold den stelnade aguppstod gel från aluminium mögel.
  3. Tillväxtplattan Chondrocyte skörd
    1. Isolera tillväxt plåtar från bakbenen på neonatal möss.
    2. Placera tillväxt plattorna i 1 mL 0,25% kollagenase för 3 h i en inkubator vid 37 ° c och 8% koldioxid (CO2), för att ta bort extracellulär matrix (ECM).
    3. Centrifugera det smälta provet i 5 min vid 125 x g för att tillverka en Chondrocyte-pellet och avlägsna supernatanten från provet. Här, 1 x g är accelerationen av gravitation.
    4. Omsuspendera Chondrocyte-pelleten i 1 mL av Dulbecco ' s modifierade Eagle ' s medium (DMEM).
    5. Räkna antalet chondrocyter i DMEM med hjälp av en cell räknare.
    6. Centrifugera de kondrocyter i DMEM för 5 min vid 125 x g för att göra en Chondrocyte pellet igen och ta bort supernatanten från provet.
    7. Du kan också Omsuspendera Chondrocyte-pelleten i Chondrocyte Culture media (CCM)34 innehållande 2 μm calcein am, och inkubera provet vid 37 ° c i 30 min. Upprepa steg 3.3.6 och gå vidare till steg 3.3.8.
    8. Omsuspendera Chondrocyte-pelleten i önskad volym av kaustik kalcinerad magnesiumoxid och förvara dem i inkubatorn vid 37 ° c och 8% CO2 före användning.
  4. Alginat-Chondrocyte (eller Bead) konstruktioner (figur 2C)
    1. Blanda 1,5% (w/v) alginat i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med 5 mg/mL sulfo-NHS, 10 mg/mL 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl) carbodiimidhydroklorid (EDC).
    2. Tillsätt 8 x 106 kondrocyter i 1 ml alginatgel-lösning [eller tillsätt 3 μl fluorescerande pärlor (542/612 nm) i 1 ìm diameter (20, 5ml) med en lösning av alginatgel (0,3% (v/v))].
    3. Placera 150 μL av alginate-Chondrocyte (eller Bead) lösningen på den amino-silaniserade glasplattan som tillverkas i steg 3,1.
    4. Täck natriumalginat gel lösning med Agros gel mögel i 3 min.
    5. Ta bort överdriven natriumalginat gel lösning överfyllda från aguppstod gel mögel med ett rakblad och ta bort Agros gel mögel. Sedan, cylindriska alginat-kondrocyte (eller pärla) konstruktioner erhålls på aminosilanized glasplattan.
    6. Placera alginat-Chondrocyte konstruktioner i cross-linking lösning (50 mM CaCl2 /140 mm NaCl i dih2O) för 1 min för ytterligare polymerisation.

4. apparat montering (figur 2D)

Observera: PDMS distanser och 3D-tryckta klämmor måste förberedas separat.

  1. Lokalisera fyra 1 mm tjocka PDMS distanserar på de fyra hörnen av Layer 2 av aktiverings enheten.
  2. Placera 700 μL av CCM för att täcka luft kamrarna i skikt 2.
  3. Placera alginate-Chondrocyte (eller pärla) konstruktioner på Layer 2 medan noggrant anpassa konstruktioner med luftkammare.
  4. Kläm fast enheten med 3D-tryckta klämmor (figur 1c).

5. aktivering av anordningen

  1. Anslut utloppet från en luftpump (se tabell över material) med en Magnetventilens inlopp med en kisel slang.
  2. Anslut Magnetventilens utlopp med den monterade enhetens inlopp med en kisel slang.
  3. Anslut magnetventilen med en funktionsgenerator.
  4. Manipulera magnetventilen med en fyrkantig våg (t. ex. 1 Hz) som genereras av funktions generatorn.
  5. Slå på luftpumpen för att aktivera enheten pneumatiskt.

6. avbildning av chondrocyter i enheten

Anmärkning: för att få en bra bildkvalitet, bild kondrocyter (eller fluorescerande pärlor) i natriumalginat gel genom glasplatta 2 eftersom utökade PDMS ballonger och luftkammare kan förvränga optiska bilder. Om ett inverterat Mikroskop används för avbildning måste enheten ställas in så att glasplattan 2 är vänd nedåt.

  1. Förbered enheten med kondrocyter (eller fluorescerande pärlor) som visas i föregående avsnitt.
  2. Ta z-stack bilder av chondrocyter (eller fluorescerande pärlor) med ett konfokal Mikroskop före och under kompression, respektive. Välj en z-stegstorlek baserat på skärpedjupet i ett använt konfokala avbildningssystem.
  3. Höjden av chondrocyter (eller en alginate-pärla konstruera) kan mätas med automatisk bildbehandling metod som visas i tidigare litteraturer26,35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denna artikel visar detaljerade steg i mikroflödessystem Chondrocyte komprimering enhet Fabrication (figur 2). Enheten innehåller en 5 x 5 matriser av cylindriska alginate-Chondrocyte konstruktioner, och dessa konstruktioner kan komprimeras med fem olika magnituder av kompression (figur 1, figur 3 och figur 4). Höjden på den pneumatiska mikrokanalen är cirka 90 μm, och PDMS ballong diametrar är 1,2, 1,4, 1,6, 1,8 och 2,0 mm, respektive. Enhetens prestanda kvantifierades med konfokalmikroskopi med statiska komprimerings förhållanden och bildbehandling. Statisk komprimering var anställd för mikroskopisk avbildning eftersom z-stacken avbildning med konfokalmikroskopi tar några minuter, så det är för långsamt för kvantitativ avbildning under den dynamiska komprimeringen.

Figur 3a visar 5 × 5 matriser av natriumalginat hydrogel kolonner (diameter: ~ 0,8 mm, höjd: ~ 1 mm) gjuten på glasplatta 2. Dessa gel konstruktioner var avbildas genom att lägga till fluorescerande pärlor i gelen. Figur 3b visar ett exempel på att gelkolonnen komprimerats med 33,8% i höjd av den största PDMS-ballongen. Den resulterande tryck stammen av gelkonstruktioner ökade med cirka 5% per 0,2 mm ökning i PDMS ballong diameter som visas i figur 3c.

Kompressiv deformation av chondrocyter bestämdes genom avbildning av cellerna i en 613 μm × 613 μm × 40 – 55 μm (x × y × z) volym nära gel konstruera Center som visas i figur 4a. Figur 1d visar en exempel bild av en Chondrocyte som komprimerades med 16% av den största PDMS ballong. Figur 4b visar fördelningen av de uppmätta värdena för cell kompressions stam, och de totala cellerna komprimerades mer av större PDMS-ballonger. Därför kontrollerades mängden alginatgel och Chondrocyte-kompression av diametern hos PDMS-ballonger (figur 3 och figur 4) med ett konstant tryck på 14 kPa.

Figure 1
Figur 1. Microfluidic Chondrocyte komprimerings enhet.
(a) schematiskt för den monterade anordningen. En 5 × 5 matris av alginat-Chondrocyte konstruktioner är inriktade på PDMS ballonger med 5 olika diametrar (D = 1,2, 1,4, 1,6, 1,8 och 2,0 mm), där D är diametern på PDMS ballong (eller luftkammare). b) Schematisk användning av anordningen. Anordningen aktiveras av pneumatiskt tryck som expanderar PDMS ballonger. (c) bild av en faktisk anordning (myntdiameter = 19 mm). dvertikala tvärsnitt av ett kondrocyte före (vänster) och under (höger) kompression på den största PDMS-ballongen (d = 2,0 mm) (cell tryck stam, ε-cell = | cell höjdförändring/initial cell höjd | x 100 = 16%). Denna siffra återges från 26.

Figure 2
Figur 2. Detaljerade steg av mikroflödessystem Chondrocyte komprimering enhet tillverkning.
(a) Photolithography för att generera en SU-8 Master mögel och efter mjuk litografi för att skapa PDMS skikt med pneumatiska mikrokanaler (Layer 1). (b) tunt PDMS-membran (Layer 2) på en OH-film som genereras av spinn beläggning. c) cylindrisk alginatgel gjutnings metod på glas (glasplatta 2). d) montering av mikrofluidic Chondrocyte-komprimeringsenhet. Denna siffra återges från 26. Vänligen klicka här för att ladda ner en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3. Mätning av alginatgel deformation under statisk kompression.
a) 5 x 5 matriser av cylindriska alginatgelkonstruktioner (diameter: ~ 800 μm, höjd: ~ 1 mm). balginatgel som komprimerats med den största PDMS-ballongen (D = 2,0 mm). Den tryckhållfasthet stammen av alginat gel är 33,8%. (c) Tryck stam av alginatgel (ε-gel) ökar ca 5% per 0,2 mm ökning av PDMS ballong diameter (D). Felstapel: standardavvikelse. Röd linje: linjär passande linje denna siffra återges från 26.

Figure 4
Figur 4. Mätning av kondrocytdeformation under statisk kompression.
a) en z-stack-bild [613 μm × 613 μm × 40 – 55 μm (x × y × z)] erhölls i mitten av gel konstruktionen, 300 – 400 μm från Gelens botten. bolika magnituder av kondrocytkompressiv stam (ε-cell) resulterade som en funktion av PDMS ballong diameter (D). Icon : medelvärden. Icon : varje datapunkt. Rutans övre (eller nedre) och mellersta rader är standardavvikelsen respektive medianvärdet. Denna siffra återges från 26.

Figur S1. MicroChannel photomasken-design för steg 1.3.4 (enhet = mm). Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.

Bild S2. Aluminium mögel design för steg 3.2.3 (enhet = mm). Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.

Figur S3. Permanent deformation av alginatgelen (1,5%, w/v) under 1 h-lång dynamisk (1 Hz) och statisk kompression. Denna siffra återges från 26. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

För att testa effekterna av tryckhållfasthet på tillväxtplattan chondrocyter, utvecklade vi mikroflödessystem Chondrocyte komprimerings enhet (figur 1) för att tillämpa olika nivåer av tryckhållfasthet på chondrocyter i alginat hydrogel ställningen för 3D kultur i högt genomflöde sätt. För att hjälpa andra forskare att anta vår enhet eller utveckla liknande enheter, tillhandahöll vi Detaljer om enhetens tillverkningssteg i denna protokoll artikel.

De avgörande stegen i detta protokoll är 1) fabricera PDMS skikt med pneumatiska mikrokanaler (Layer 1) utan några luftbubblor eftersom luftbubblor i lager 1 kan skada pneumatiska mikrokanaler medan backning OH-film är skalade av, 2) upprätthålla en konstant temperatur (e.g., 80 ° c) för härdning PDMS ballonger (Layer 2) eftersom elasticiteten i PDMS är kända för att bero på härdningstemperaturen36, 3) justera natriumalginat gel konstruktioner med PDMS ballonger, och 4) med hjälp av färska amino-silanized glas tallrik (glasplatta 2) för limning av alginatgelkolonnerna på glasplattan 2 inom två dagar efter saliniseringsbehandlingen.

Den största begränsningen av detta protokoll är att det är relativt arbetsintensiva att fabricera enheten eftersom processen innebär Photolithography och flera steg i mjuk litografi. Dessutom måste prestandan hos de mikrofluidiska cell komprimerings enheter som tillverkas baserat på vårt protokoll utvärderas när olika typer av hydrogeler och celler används. Detta beror på att eventuella skillnader i de mekaniska egenskaperna hos hydrogeler och celler kommer att påverka enhetens prestanda.

Även om vår mikroflödessystem cell komprimerings enhet är för att tillämpa dynamisk komprimering till chondrocyter, dess prestanda utvärderades genom avbildning statiskt komprimerade natriumalginat geler och celler. Detta beror på att det var svårt att bilden geler och celler under dynamisk komprimering med konventionell konfokal mikroskopi. Vi jämförde statisk (14 kPa, 1 h) och dynamisk kompression (14 kPa, 1 Hz, 1 h) när det gäller den permanenta deformationen av alginatgel och fann att den permanenta deformationen av gelen under den dynamiska komprimeringen var försumbar jämfört med den statiska kompressionen (se Kompletterande figur S3).

En fördel med vår metod är att den kan användas för andra celltyper som behöver 3D-kulturmiljö. Den resulterande komprimeringen av enheten kan moduleras beroende på applikationer genom att ändra diametern och tjockleken på PDMS ballonger och/eller trycket i ballongen. Det är också möjligt att ändra elasticiteten i PDMS ballong genom att justera blandningsförhållandet mellan prepolymer och härdnings medlet. Celler i denna enhet kan avbildas i realtid med hjälp av ljus/fluorescens mikroskopi, och enheten kan snabbt demonteras för cell skörd för att möjliggöra nedströms analys. En annan fördel är möjligheten att generera fem distinkta mekaniska stressnivåer med fem tekniska replikat per varje stressnivå med hjälp av en enda enhet. Kombinationen replikering och en dos-responsanalys säkerställer en hög grad av noggrannhet och reproducerbarhet i resultaten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar DRS. Christopher Moraes och Stephen A. Morin för deras stöd för enheten design och tillverkning. Denna studie stöddes av bio Engineering för Human Health Grant från University of Nebraska-Lincoln (UNL) och University of Nebraska Medical Center (UNMC), och Grant AR070242 från NIH/NIAMS. Vi tackar Janice A. Taylor och James R. Talaska av den avancerade mikroskopi Core Facility vid University of Nebraska Medical Center för att ge hjälp med konfokalmikroskopi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-Aminopropyl)triethoxysilane (ATPES) Sigma-Aldrich 741442-100ML
(Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane United Chemical Technologies T2492-KG
Acrylic sheet McMaster-Carr 8560K354
Air pump Schwarzer Precision SP 500 EC-LC4.5V DC We used the model purchased in 2015. The internal design and performance of air pump (SP 500 EC-LC) changed in early 2016. Also, air pump performance has changed in the course of time. Thus, air pressure generated by an SP 500 EC-LC air pump should be calibrated before use.
Alginate powder FMC Corporation Pronova UP MVG
Barb Straight Connectors (Metal tube) Pneumadyne EB40-250
Calcein AM Invitrogen C3100MP
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11960-044
Dyed red aqueous fluorescent particles Thermo Fisher Scientific R0100
EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) Thermo Fisher Scientific 22980
Foam pad GRAINGER Item # 5GCE8
Function / Arbitrary Waveform Generator Keysight Technologies 33210A
Hydrochloric acid Fisher Chemical A144-500
Hydrogen peroxide Fisher BioReagents BP2633500
Isopropyl alcohol BDH1174-4LP VWR
Microscope slides Thermo Fisher Scientific 22-267-013
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-001
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Power supply Keysight Technologies E3630A
SeaKem LE Agarose Lonza 50004
Sodium hydroxide Fisher Chemical S318-1
Solenoid manifold Pneumadyne MSV10-1
Solenoid valve Pneumadyne S10MM-30-12-3
Spin coater Laurell Technologies WS-650Mz-23NPPB
SU8 Developer MicroChem Corp. Y020100 4000L1PE
SU8-100 MicroChem Corp. Y131273 0500L1GL
SU8-5 MicroChem Corp. Y131252 0500L1GL
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) Thermo Fisher Scientific 24510
Sulfuric acid EMD Millipore MSX12445

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Analytical Chemistry. 76 (18), 5257-5264 (2004).
  2. Malek, A. M., Izumo, S. Mechanism of endothelial cell shape change and cytoskeletal remodeling in response to fluid shear stress. Journal of Cell Science. 109 (4), 713-726 (1996).
  3. Paguirigan, A. L., Beebe, D. J. Microfluidics meet cell biology: bridging the gap by validation and application of microscale techniques for cell biological assays. BioEssays. 30 (9), 811-821 (2008).
  4. García-Cardeña, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (8), 4478-4485 (2001).
  5. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  6. Moraes, C., Chen, J. H., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated arrays for high-throughput screening of cellular response to cyclic substrate deformation. Lab on a Chip. 10 (2), 227-234 (2010).
  7. Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays. Biomaterials. 31 (3), 577-584 (2010).
  8. Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnology and Bioengineering. 102 (2), 632-643 (2009).
  9. Bougault, C., Paumier, A., Aubert-Foucher, E., Mallein-Gerin, F. Molecular analysis of chondrocytes cultured in agarose in response to dynamic compression. BMC Biotechnology. 8 (1), 71 (2008).
  10. Kaviani, R., Londono, I., Parent, S., Moldovan, F., Villemure, I. Compressive mechanical modulation alters the viability of growth plate chondrocytes in vitro. Journal of Orthopaedic Research. 33 (11), 1587-1593 (2015).
  11. Ménard, A. L., et al. In vivo dynamic loading reduces bone growth without histomorphometric changes of the growth plate. Journal of Orthopaedic Research. 32 (9), 1129-1136 (2014).
  12. Robling, A. G., Duijvelaar, K. M., Geevers, J. V., Ohashi, N., Turner, C. H. Modulation of appositional and longitudinal bone growth in the rat ulna by applied static and dynamic force. Bone. 29 (2), 105-113 (2001).
  13. Sergerie, K., et al. Growth plate explants respond differently to in vitro static and dynamic loadings. Journal of Orthopaedic Research. 29 (4), 473-480 (2011).
  14. Valteau, B., Grimard, G., Londono, I., Moldovan, F., Villemure, I. In vivo dynamic bone growth modulation is less detrimental but as effective as static growth modulation. Bone. 49 (5), 996-1004 (2011).
  15. Walsh, A. J. L., Lotz, J. C. Biological response of the intervertebral disc to dynamic loading. Journal of Biomechanics. 37 (3), 329-337 (2004).
  16. Zimmermann, E. A., et al. In situ deformation of growth plate chondrocytes in stress-controlled static vs dynamic compression. Journal of Biomechanics. 56, 76-82 (2017).
  17. Akyuz, E., Braun, J. T., Brown, N. A. T., Bachus, K. N. Static versus dynamic loading in the mechanical modulation of vertebral growth. Spine. 31 (25), E952-E958 (2006).
  18. Alberty, A., Peltonen, J., Ritsilä, V. Effects of distraction and compression on proliferation of growth plate chondrocytes: A study in rabbits. Acta Orthopaedica Scandinavica. 64 (4), 449-455 (1993).
  19. Amini, S., Veilleux, D., Villemure, I. Tissue and cellular morphological changes in growth plate explants under compression. Journal of Biomechanics. 43 (13), 2582-2588 (2010).
  20. Aronsson, D. D., Stokes, I. A. F., Rosovsky, J., Spence, H. Mechanical modulation of calf tail vertebral growth: implications for scoliosis progression. Journal of Spinal Disorders. 12 (2), 141-146 (1999).
  21. Cancel, M., Grimard, G., Thuillard-Crisinel, D., Moldovan, F., Villemure, I. Effects of in vivo static compressive loading on aggrecan and type II and X collagens in the rat growth plate extracellular matrix. Bone. 44 (2), 306-315 (2009).
  22. Reich, A., et al. Weight loading young chicks inhibits bone elongation and promotes growth plate ossification and vascularization. Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2381-2389 (2005).
  23. Stokes, I. A., Mente, P. L., Iatridis, J. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. Enlargement of growth plate chondrocytes modulated by sustained mechanical loading. Journal of Bone and Joint Surgery. 84 (10), 1842-1848 (2002).
  24. Stokes, I. A. F., Clark, K. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. Alterations in the growth plate associated with growth modulation by sustained compression or distraction. Bone. 41 (2), 197-205 (2007).
  25. Lee, D., Erickson, A., Dudley, A. T., Ryu, S. Mechanical stimulation of growth plate chondrocytes: previous approaches and future directions. Experimental Mechanics. , (2018).
  26. Lee, D., Erickson, A., You, T., Dudley, A. T., Ryu, S. Pneumatic microfluidic cell compression device for high-throughput study of chondrocyte mechanobiology. Lab on a Chip. 18 (14), 2077-2086 (2018).
  27. Guilak, F. Compression-induced changes in the shape and volume of the chondrocyte nucleus. Journal of Biomechanics. 28 (12), 1529-1541 (1995).
  28. Knight, M. M., Ghori, S. A., Lee, D. A., Bader, D. L. Measurement of the deformation of isolated chondrocytes in agarose subjected to cyclic compression. Medical Engineering & Physics. 20 (9), 684-688 (1998).
  29. Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated platforms for mechanically dynamic cell culture. Journal of Visualized Experiments. (46), e224 (2010).
  30. Sim, W. Y., et al. A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation. Lab on a Chip. 7 (12), 1775-1782 (2007).
  31. Hosmane, S., et al. Valve-based microfluidic compression platform: single axon injury and regrowth. Lab on a Chip. 11 (22), 3888-3895 (2011).
  32. Ho, K. K. Y., Wang, Y. L., Wu, J., Liu, A. P. Advanced microfluidic device designed for cyclic compression of single adherent cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6 (148), (2018).
  33. Seo, J., et al. Interconnectable dynamic compression bioreactors for combinatorial screening of cell mechanobiology in three dimensions. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (16), 13293-13303 (2018).
  34. Erickson, A. G., et al. A tunable, three-dimensional in Vitro culture model of growth plate cartilage using alginate hydrogel acaffolds. Tissue Engineering Part A. 24 (1-2), 94-105 (2018).
  35. Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement. Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).
  36. Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).

Tags

Bioteknik utgåva 151 mikrofluidik fotolitografi mjuk litografi tillväxtplatta kondrocyter mechanobiologi cellmekanik alginathydrogel konfokalmikroskopi bildanalys
En Mikrofluidisk plattform för att stimulera kondrocyter med dynamisk kompression
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, D., Erickson, A., Dudley, A.… More

Lee, D., Erickson, A., Dudley, A. T., Ryu, S. A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression. J. Vis. Exp. (151), e59676, doi:10.3791/59676 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter