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Bioengineering

Eine mikrofluidische Plattform zur Stimulierung von Chondrozyten mit dynamischer Kompression

Published: September 13, 2019 doi: 10.3791/59676
Automatic Translation
1, 2, 1, 3,4
1Department of Genetics, Cell Biology and Anatomy, University of Nebraska Medical Center, 2Department of Physiology and Pharmacology, Karolinska Institutet, 3Department of Mechanical and Materials Engineering, University of Nebraska-Lincoln, 4Nebraska Center for Materials and Nanoscience, University of Nebraska-Lincoln

Summary

Dieser Artikel enthält detaillierte Methoden zur Herstellung und Charakterisierung einer pneumatisch betätigten mikrofluidischen Vorrichtung für die Chondrozytenkompression.

Abstract

Mechanische Reize sind dafür bekannt, biologische Funktionen von Zellen und Geweben zu modulieren. Jüngste Studien haben gezeigt, dass Druckstress die Knorpelarchitektur der Wachstumsplatte verändert und zu einer Wachstumsmodulation langer Knochen von Kindern führt. Um die Rolle der Druckspannung beim Knochenwachstum zu bestimmen, haben wir ein mikrofluidisches Gerät entwickelt, das durch pneumatischen Druck betätigt wird, um Wachstumsplattenchondrozyten, die in Alginat-Hydrogel-Zylinder eingebettet sind, dynamisch (oder statisch) zu komprimieren. In diesem Artikel beschreiben wir detaillierte Methoden zum Herstellung und Charakterisieren dieses Geräts. Die Vorteile unseres Protokolls sind: 1) Fünf verschiedene Größen von Druckspannung können auf fünf technischen Replikationen in einer einzigen Plattform erzeugt werden, 2) Es ist einfach, Zellmorphologie über ein herkömmliches Lichtmikroskop zu visualisieren, 3) Zellen können schnell isoliert werden vom Gerät nach der Kompression, um nachgeschaltete Assays zu erleichtern, und 4) Die Plattform kann angewendet werden, um Mechanobiologie jeder Zellart zu studieren, die in Hydrogelen wachsen kann.

Introduction

Mikroentwickelte Plattformen sind wertvolle Werkzeuge für die Untersuchung der molekularen, zellulären und Gewebebiologie, da sie eine dynamische Steuerung sowohl der physikalischen als auch der chemischen Mikroumgebungen ermöglichen1,2,3 ,4,5,6,7,8. So können mehrere Hypothesen gleichzeitig streng kontrolliert getestet werden. Im Falle des Wachstumsplattenknorpels gibt es zunehmend Hinweise auf eine wichtige Rolle der Druckspannung bei der Modulation des Knochenwachstums durch Wirkung auf die Wachstumsplatte Knorpel9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25. Der Wirkmechanismus der Druckspannung – insbesondere, wie Stress die Bildung von Chondrozytensäulen in der Wachstumsplatte leitet – wird jedoch schlecht verstanden.

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine pneumatisch betätigende mikrofluidische Chondrozytenkompressionsvorrichtung26 zu schaffen, um Mechanismen der Mechanobiologie in Wachstumsplattenchondrozyten aufzuklären (Abbildung 1a-c). Das Gerät besteht aus zwei Teilen: der pneumatischen Betätigungseinheit und dem Alginat-Gel-Konstrukt. Die mikrofluidische pneumatische Betätigungseinheit wird aus Polydimethylsiloxan (PDMS) auf Basis der Photo- und Softlithographie hergestellt. Diese Einheit enthält ein 5 x 5 Array von dünnen PDMS-Membranballons, die je nach Durchmesser unterschiedlich aufgeblasen werden können. Das Alginat-Gel-Konstrukt besteht aus den Chondrozyten, die in ein 5 x 5-Array von Alginat-Gel-Zylindern eingebettet sind, und die gesamten Alginat-Chondrozyten-Konstrukte werden mit der Betätigungseinheit zusammengesetzt. Die Alginat-Gel-Konstrukte werden durch die pneumatisch aufgeblasenen PDMS-Ballons komprimiert (Abbildung 1b). Das mikrofluidische Gerät kann auf der Grundlage von Unterschieden im PDMS-Ballondurchmesser fünf verschiedene Druckstufen gleichzeitig in einer einzigen Plattform erzeugen. Somit ist ein Hochdurchsatztest der Chondrozytenmechanobiologie unter mehrfachen Kompressionsbedingungen möglich.

Das in diesem Protokoll beschriebene mikrofluidische Gerät hat gegenüber dem herkömmlichen Kompressionsgerät viele Vorteile, wie z. B. externe Fixatoren14,21,23 und makroskopische Kompressionsgeräte16, 19 , 27 , 28 für das Studium der Chondrozyten-Mechanobiologie: 1) Das mikrofluidische Gerät ist kostengünstig, da es ein geringeres Volumen an Proben verbraucht als das makroskopische Kompressionsgerät, 2) Das mikrofluidische Gerät ist zeiteffektiv, da es mehrere Kompressionsbedingungen gleichzeitig, 3) Das mikrofluidische Gerät kann mechanische und chemische Reize kombinieren, indem es einen Konzentrationsgradienten von Chemikalien bildet, der auf der begrenzten Vermischung in Mikrokanälen basiert, und 4) Verschiedene Mikroskopietechniken (Zeitraffer Mikroskopie und Fluoreszenzkonfokalmikroskopie) kann mit dem mikrofluidischen Gerät aus transparentem PDMS aufgetragen werden.

Wir übernahmen und modifizierten die Methode von Moraes et al.7,29, um verschiedene Druckspannungsniveaus in einem einzigen Gerät zu schaffen, um hochdurchsatz-mechanobiologische Studien der Chondrozytenkompression zu ermöglichen. Unser Ansatz eignet sich für Zellen (z.B. Chondrozyten), die eine dreidimensionale (3D) Kulturumgebung benötigen, und für biologische Tests nach dem Komprimieren von Zellen. Obwohl einige mikrofluidische Zellkompressionsgeräte Zellen komprimieren können, die auf zweidimensionalen (2D) Substraten kultiviert sind30,31,32, können sie nicht für Chondrozyten verwendet werden, da 2D-kultivierte Chondrozyten dedifferenziert. Es gibt mikrofluidische Plattformen zum Komprimieren von 3D-kultivierten Zellen in photopolymerisierten Hydrogelen7,33, aber sie sind in der Isolierung von Zellen nach Kompressionsexperimenten begrenzt, da die Isolierung von Zellen von photopolymerisierten Hydrogel ist nicht einfach. Darüber hinaus müssen die Auswirkungen der UV-Exposition (UV) und der Photovernetzung von Initiatoren auf Zellen möglicherweise bewertet werden. Im Gegensatz dazu ermöglicht unsere Methode eine schnelle Isolierung von Zellen nach Kompressionsexperimenten für postbiologische Assays, da Alginathydrogele schnell durch Kalziumchelatoren depolymerisiert werden können. Die detaillierten Methoden zur Geräteherstellung und -charakterisierung werden in diesem Protokoll beschrieben. Abbildung 2zeigt ein kurzes Verfahren zur Herstellung des mikrofluidischen Chondrozyten-Kompressionsgeräts .

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Protocol

HINWEIS: Tragen Sie persönliche Schutzausrüstung (PSA) wie Handschuhe und Labormantel für jeden Schritt in diesem Protokoll.

1. Meister formherstellung

HINWEIS: Führen Sie Schritt 1.1 - 1.3 in einer Dunstabzugshaube aus.

  1. Glasbehandlung
    HINWEIS: Tragen Sie einen Gesichtsschutz, Handschuhe und einen Labormantel für Schritt 1.1.
    1. Machen Sie Piranha-Lösung (60 ml) durch Mischen von Schwefelsäure(H2SO4) und Wasserstoffperoxid (H2O2) mit einem Volumenverhältnis von 3:1.
      VORSICHT: Verwenden Sie piranha-Lösung und Aceton aufgrund der Explosionsgefahr nicht in derselben Dunstabzugshaube.
    2. Legen Sie eine Glasplatte (50,8 mm x 76,2 mm x 1,2 mm) in Piranha-Lösung für 30 min bei 40 °C.
    3. Spülen Sie die Glasplatte mit entionisiertem Wasser (diH2O).
    4. Legen Sie die Glasplatte in Aceton bei Raumtemperatur für 10 min.
    5. Spülen Sie die Glasplatte mit Isopropanol und trocknen Sie sie mit Stickstoff (N2) Gas.
    6. Backen Sie die Glasplatte bei 200 °C für 20 min auf einer Kochplatte. Alle nachfolgenden Backschritte verwenden eine Kochplatte.
  2. SU-8 Samenschichtbildung auf der Glasplatte
    1. SU-8 5 mit einer Einwegpipette auf die Glasplatte verteilen, um etwa 2/3 der Plattenoberfläche abzudecken.
    2. Drehen Sie die Glasplatte mit SU-8 5 Photoresists bei 500 U/min für 35 s (Anfangsspinnzyklus) und dann 2.500 U/min für 40 s (letzter Spinnzyklus) mit einem Spincoater. Alle nachfolgenden Spinbeschichtungsschritte umfassen den gleichen anfänglichen Spinnzyklus.
    3. Die SU-8 5-beschichtete Glasplatte bei 65 °C für 2 min und dann bei 95 °C 5 min backen.
    4. Setzen Sie die SU-8 5 beschichtete Glasplatte UV-Licht (60 mW/cm2, Abstand zwischen UV-Lampe und Fotomaske beträgt 20 cm, Gesamtmenge an UV-Lichtenergie = 60 mJ/cm2) für 1 s aus.
      HINWEIS: Die UV-Belichtungszeit sollte entsprechend der Leistung eines verwendeten UV-Lichts eingestellt werden.
    5. Backen Sie die SU-8 5 beschichtete Glasplatte bei 65 °C für 2 min und bei 95 °C für 5 min.
    6. Legen Sie die gebackene Glasplatte für 2 min in den SU-8 Entwickler.
    7. Das SU-8 5 beschichtete Glas bei 180 °C 20 min backen.
  3. SU-8 KanalmusterFertigung mit Photolithographie (Abbildung 2a Schritt 1-3)
    1. Gießen Sie SU-8 100 auf die SU-8 5 gesäte Glasplatte, um etwa 2/3 der Oberfläche der Platte zu bedecken.
    2. Drehen Sie die Glasplatte mit SU-8 100 bei 3.000 U/min für 38 s (ca. 90 x m dick).
    3. Die SU-8 100 beschichtete Glasplatte bei 65 °C 10 min und dann bei 95 °C 30 min backen. Wenn SU-8 100 nach diesem Eingriff noch klebrig ist, backen Sie die Glasplatte länger bei 95 °C, bis SU-8 100 nicht klebrig wird.
    4. Legen Sie eine hochauflösende Mikrokanal-Fotomaske (25.400 dpi, siehe Zusatzabbildung 1) auf die SU-8 100 beschichtete Glasplatte und setzen Sie die fotomaskenbedeckte Glasplatte für 4 s UV-Licht (Gesamtmenge uv-Lichtenergie = 240 mJ/cm2) UV-Licht ein.
      HINWEIS: Die UV-Belichtungszeit sollte entsprechend der Leistung eines verwendeten UV-Lichts eingestellt werden.
    5. Die Fotomaske von der Glasplatte nehmen und die Glasplatte bei 65 °C für 2 min und dann 95 °C für 20 min backen.
    6. Bewahren Sie die gebackene Glasplatte in einem Behälter auf, der mit Aluminiumfolie umwickelt ist, um jedes Licht zu blockieren, für die aushärtende Nacht.
    7. Entwickeln Sie SU-8 100 Kanalmuster auf der Glasplatte im SU-8 Entwickler für 15 min.
    8. Waschen Sie die SU-8 gemusterte Glasplatte (Masterform) mit Isopropylalkohol und trocknen Sie sie mitN2-Gas. Wenn während dieses Vorgangs weiße Partikel verbleiben, wiederholen Sie Schritt 7 für 5 min.

2. Pneumatische Betätigungseinheit

  1. Mikrokanalschicht (Layer 1)
    HINWEIS: Führen Sie Schritt 2.1.1 - 2.1.2 in einer Dunstabzugshaube aus.
    1. 200 l (Tridecafluor-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorsilan auf einen Deckelschlupf legen und in eine Vakuumkammer mit der Masterform legen.
    2. Vakuum für 2 min in der Kammer auftragen und 6 h (oder über Nacht) auf die Silanisierung der Form warten.
    3. Mischen Sie PDMS mit einem Gewichtsverhältnis von 10:1 (Prepolymer:Härtungsmittel) für 5 min.
      HINWEIS: Alle nachfolgenden PDMS-Gießschritte enthalten das gleiche Gewichtverhältnis von Prepolymer und Härtungsmittel (10:1).
    4. PDMS auf die Masterform gießen und PDMS 30 min in einer Vakuumkammer entgasen.
    5. Sandwich PDMS mit einem Stück Transparenzfolie.
    6. Klemmen Sie die obige Sandwich-Baugruppe mit einer Glasplatte, Schaumstoffpolstern und Plexiglasplatten (Abbildung 2a Schritt 4).
    7. PDMS im Ofen bei 80 °C 6 h aushärten.
    8. Isolieren Sie die PDMS-Schicht (Schicht 1) mit dem Transparenzfilm von der Sandwichstruktur (Abbildung 2a Schritt 5).
    9. Aktivieren Sie Oberflächen der Schicht 1 und einer sauberen Glasplatte (Glasplatte 1; 50,8 mm x 76,2 mm x 1,2 mm) mit einem Plasmareiniger für 1 min.
      HINWEIS: Die Plasmareinigungszeit kann je nach Leistung eines verwendeten Plasmareinigers variieren.
    10. Schicht 1 auf Glasplatte 1 kleben und 30 min bei 80 °C in den Ofen stellen.
    11. Entfernen Sie den Transparenzfilm aus Layer 1.
  2. Dünne PDMS-Membran (Schicht 2)
    1. Spin Mantel ungehärtetes PDMS auf einer Transparenzfolie bei 1.000 U/min für 1 min, um eine 60 m dicke PDMS-Schicht zu erhalten.
    2. Teilweise spinbeschichtetes PDMS (Schicht 2) im Ofen bei 80 °C für 20-30 min aushärten.
    3. Aktivieren Sie Schicht 1 auf Glasplatte 1 und Schicht 2 mit dem Plasmareiniger für 1 min.
      HINWEIS: Die Plasmareinigungszeit kann je nach Leistung eines verwendeten Plasmareinigers variieren.
    4. Die Schicht 2 auf Schicht 1 kleben und über Nacht bei 80 °C in den Ofen stellen.
  3. Schlauchblock
    1. Metallrohre vertikal auf eine Petrischale legen.
    2. Gießen Sie PDMS vorsichtig in die Schale, um etwa 3/4 der Metallrohre zu untertauchen.
    3. PDMS im Ofen bei 60 °C 6 h (oder über Nacht) aushärten.
    4. Schneiden Sie ein Stück PDMS-Block mit einem Metallrohr.
    5. Schlagen Sie ein Loch auf Layer 2 für den Einlass.
    6. Aktivieren Sie den PDMS-Block und Layer 2 mit dem Plasmareiniger für 1 min.
    7. Befestigen Sie den PDMS-Block am Einlassteil von Layer 2 und legen Sie die gesamte Betätigungseinheit über Nacht bei 80 °C in den Ofen.

3. Alginat-Chondrozyten (oder Perle) konstruiert

  1. Aminosilanisierte Glasplatte
    1. Schneiden Sie eine Glasplatte (50,8 mm x 76,2 mm x 1,2 mm) mit einem Diamantschreiber in zwei halbgroße Glasplatten (50,8 mm x 38,1 mm x 1,2 mm).
    2. Die Glasplatten in 0,2 M Chlorwasserstoff (HCl) geben und über Nacht sanft (z.B. 55 Umdrehungen pro Minute) schütteln.
    3. Spülen Sie die Glasplatten mit diH2O.
    4. Die Glasplatten in 0,1 M Natriumhydroxid (NaOH) 1 h bei 55 Umdrehungen pro Minute schütteln und mit diH2O abspülen.
    5. Die Glasplatten in 1% (v/v) 3-Aminopropyltrimethoxysilan (APTES) 1 h bei 55 Rpm schütteln und mit diH2O abspülen.
    6. Trocknen Sie die amino-silanisierten Glasplatten über Nacht in einer Dunstabzugshaube.
  2. Agarose-Gelform für Alginat-Gel-Konstrukte
    1. 5% (w/v) Agarose und 200 mM Calciumchlorid (CaCl2) in diH2O mischen.
    2. Kochen Sie die Agarose-Gel-Lösung mit einem Mikrowellenherd (oder einer Kochplatte). Die Siedezeit variiert je nach volumender Agarose-Gel-Lösung und der Leistung des Mikrowellenherds (oder der Temperatur der Kochplatte).
    3. Gießen Sie die gekochte Agarose-Gel-Lösung auf eine Aluminiumform (siehe Zusatzfigur S2), und verschütten Sie sie mit einer Glasplatte.
    4. Warten Sie 5 min und entbleben Sie das erstarrte Agarose-Gel aus der Aluminiumform.
  3. Wachstumsplatte Chondrozyten Ernte
    1. Isolieren Sie Wachstumsplatten von den Hinterbeinen von neonatalen Mäusen.
    2. Legen Sie die Wachstumsplatten in 1 ml 0,25% Kollagennase für 3 h in einem Inkubator bei 37 °C und 8% Kohlendioxid(CO2), um die extrazelluläre Matrix (ECM) zu entfernen.
    3. Zentrifugieren Sie die verdaute Probe für 5 min bei 125 x g, um ein Chondrozytenpellet zu machen und Überstand aus der Probe zu entfernen. Hier ist 1 x g die Beschleunigung der Schwerkraft.
    4. Setzen Sie das Chondrozytenpellet in 1 ml des modifizierten Eagle-Mediums (DMEM) von Dulbecco aus.
    5. Zählen Sie die Anzahl der Chondrozyten in DMEM mithilfe eines Zellenzählers.
    6. Zentrifugieren Sie die Chondrozyten in DMEM für 5 min bei 125 x g, um ein Chondrozytenpellet wieder herzustellen und Überstand aus der Probe zu entfernen.
    7. Optional können Sie das Chondrozytenpellet in den Chondrozytenkulturmedien (CCM)34, das 2 M Calcein AM enthält, wieder anhalten und die Probe 30 min bei 37 °C inkubieren. Schritt 3.3.6 wiederholen und auf Schritt 3.3.8 verschieben.
    8. Setzen Sie das Chondrozytenpellet in einem gewünschten CCM-Volumen aus und halten Sie es vor Gebrauch im Inkubator bei 37 °C und 8%CO2 auf.
  4. Alginat-Chondrozytenkonstrukte (oder Perlen) (Abbildung 2c)
    1. Mischen Sie 1,5% (w/v) Alginat in phosphatgepufferter Salzsäure (PBS) mit 5 mg/ml Sulfo-NHS, 10 mg/ml 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-Carbodiimidhydrochlorid (EDC).
    2. Fügen Sie 8 x 106 Chondrozyten in die 1 ml Alginat-Gel-Lösung [oder fügen Sie 3 l von 1 'm-Durchmesser fluoreszierende Perlen (542/612 nm) in 1 ml Alginat-Gel-Lösung (0,3% (v/v))].
    3. Legen Sie 150 l der Alginat-Chondrozyten-Lösung (oder Perle) auf die in Schritt 3.1 hergestellte aminosilanisierte Glasplatte.
    4. Bedecken Sie die Alginat-Gel-Lösung mit der Agarose-Gelform für 3 min.
    5. Entfernen Sie übermäßige Alginat-Gel-Lösung überfließend aus der Agarose-Gel-Form mit einer Rasierklinge und entfernen Sie die Agarose-Gel-Form. Dann werden zylindrische Alginat-Chondrozyten-Konstrukte (oder Perlen) auf der aminosilanisierten Glasplatte erhalten.
    6. Die Alginat-Chondrozyten-Konstrukte in Vernetzungslösung (50 mM CaCl2 / 140 mM NaCl in diH2O) für 1 min für weitere Polymerisation platzieren.

4. Gerätebaugruppe (Abbildung 2d)

HINWEIS: PDMS-Abstandshalter und 3D-gedruckte Klemmen müssen separat vorbereitet werden.

  1. Suchen Sie vier 1 mm dicke PDMS-Abstandshalter an den vier Ecken der Schicht 2 der Betätigungseinheit.
  2. Platzieren Sie 700 L CCM, um die Luftkammern von Layer 2 abzudecken.
  3. Platzieren Sie die Alginat-Chondrozyten-Konstrukte (oder Perlen) auf Layer 2, während Sie die Konstrukte sorgfältig mit den Luftkammern ausrichten.
  4. Klemmen Sie das Gerät mit 3D-gedruckten Klemmen (Abbildung 1c).

5. Betätigung des Geräts

  1. Schließen Sie den Auslass einer Luftpumpe (siehe Materialtabelle)mit dem Einlass eines Magnetventils mit einem Siliziumschlauch an.
  2. Verbinden Sie den Auslass des Magnetventils mit dem Einlass des montierten Geräts mit einem Siliziumschlauch.
  3. Schließen Sie das Magnetventil mit einem Funktionsgenerator an.
  4. Manipulieren Sie das Magnetventil mit einer vom Funktionsgenerator erzeugten Rechteckwelle (z.B. 1 Hz).
  5. Schalten Sie die Luftpumpe ein, um das Gerät pneumatisch zu betätigen.

6. Bildgebung von Chondrozyten im Gerät

HINWEIS: Um eine gute Bildqualität zu erhalten, können Bildchondrozyten (oder fluoreszierende Perlen) in Alginat-Gel durch Glasplatte 2, weil erweiterte PDMS-Ballons und Luftkammern optische Bilder verzerren können. Wenn ein invertiertes Mikroskop für die Bildgebung verwendet wird, muss das Gerät so eingerichtet werden, dass Glasplatte 2 nach unten zeigt.

  1. Bereiten Sie das Gerät mit Chondrozyten (oder fluoreszierenden Perlen) vor, wie in den vorherigen Abschnitten gezeigt.
  2. Nehmen Sie z-stackBilder von Chondrozyten (oder fluoreszierenden Perlen) mit einem konfokalen Mikroskop vor bzw. unter Kompression. Wählen Sie eine z-Schrittgröße basierend auf der Schärfentiefe eines verwendeten konfokalen Bildgebungssystems.
  3. Die Höhe von Chondrozyten (oder einem Alginat-Perlenkonstrukt) kann mit automatischer Bildverarbeitungsmethode gemessen werden, die in früheren Literaturen26,35gezeigt wird.

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Representative Results

Dieser Artikel zeigt detaillierte Schritte der mikrofluidischen Chondrozyten-Kompressionsgerätefertigung (Abbildung 2). Das Gerät enthält 5 x 5 Arrays von zylindrischen Alginat-Chondrozytenkonstrukten, und diese Konstrukte können mit fünf verschiedenen Komprimierungsgrößen komprimiert werden(Abbildung 1, Abbildung 3 und Abbildung 4). Die Höhe des pneumatischen Mikrokanals beträgt ca. 90 m, und die PDMS-Ballondurchmesser betragen 1,2, 1,4, 1,6, 1,8 und 2,0 mm. Die Leistung des Gerätes wurde mit konfokaler Mikroskopie mit statischen Kompressionsbedingungen und Bildverarbeitung quantifiziert. Für die mikroskopische Bildgebung wurde eine statische Kompression eingesetzt, da die z-stack-Bildgebung mit der konfokalen Mikroskopie einige Minuten dauert, so dass sie für die quantitative Bildgebung während der dynamischen Kompression zu langsam ist.

Abbildung 3a zeigt die 5 x 5 Arrays von Alginat-Hydrogelsäulen (Durchmesser: 0,8 mm, Höhe: 1 mm), die auf Glasplatte 2 gegossen werden. Diese Gelkonstrukte wurden durch Zugabe von fluoreszierenden Perlen im Gel abgebildet. Abbildung 3b zeigt ein Beispiel, in dem die Gelsäule durch die größte PDMS-Ballon um 33,8 % in der Höhe komprimiert wurde. Die resultierende Druckdehnung der Gelkonstrukte erhöhte sich um ca. 5% pro 0,2 mm Inkrement im PDMS-Ballondurchmesser, wie in Abbildung 3cdargestellt.

Die komprimive Verformung von Chondrozyten wurde durch Dieabbildung der Zellen in einem Volumen von 613 m bei 613 x 40 bis 55 m (x x x z) in der Nähe des Gelkonstruktzentrums bestimmt, wie in Abbildung 4adargestellt. Abbildung 1d zeigt ein Beispielbild einer Chondrozyten, die durch die größte PDMS-Sprechblase um 16 % komprimiert wurde. Abbildung 4b zeigt die Verteilung der gemessenen Zellkompressionsdehnungswerte, und die Gesamtzellen wurden durch größere PDMS-Ballons stärker komprimiert. Daher wurde die Menge an Alginat-Gel und Chondrozytenkompression durch den Durchmesser von PDMS-Ballons (Abbildung 3 und Abbildung 4) mit einem konstanten Druck von 14 kPa gesteuert.

Figure 1
Abbildung 1. Mikrofluidische Chondrozyten-Kompressionsvorrichtung.
(a) Schaltplan des montierten Geräts. Ein 5 x 5 Array von Alginat-Chondrozyten-Konstrukten wird auf PDMS-Ballonen mit 5 verschiedenen Durchmessern ausgerichtet(D = 1,2, 1,4, 1,6, 1,8 und 2,0 mm), wobei D der Durchmesser des PDMS-Ballons (oder der Luftkammer) ist. (b) Schematic des Gerätebetriebs. Das Gerät wird durch pneumatischen Druck betätigt, der PDMS-Ballons erweitert. (c) Bild einer tatsächlichen Vorrichtung (Münzdurchmesser = 19 mm). (d) Vertikale Querschnitte einer Chondrozyten vor (links) und unter (rechts) Kompression auf der größten PDMS-Ballon (D = 2,0 mm) (Zelldruckdehnung, Zelle= |Zellhöhenänderung/Anfangszellhöhe| x 100 = 16%). Diese Zahl wird von 26reproduziert.

Figure 2
Abbildung 2. Detaillierte Schritte der mikrofluidischen Chondrozyten-Kompressionsgerätefertigung.
(a) Photolithographie zur Erzeugung einer SU-8-Masterform und nach weicher Lithographie zur Erstellung von PDMS-Schichten mit pneumatischen Mikrokanälen (Layer 1). (b) Dünne PDMS-Membran (Schicht 2) auf einem durch Spinbeschichtung erzeugten Transparenzfilm. (c) Zylindrisches Alginat-Gel-Gießverfahren auf Glas (Glasplatte 2). (d) Montage der mikrofluidischen Chondrozytenkompressionsvorrichtung. Diese Zahl wird von 26reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung herunterzuladen.

Figure 3
Abbildung 3. Messung der Alginat-Gelverformung unter statischer Kompression.
(a) 5 x 5 Arrays zylindrischer Alginat-Gel-Konstrukte (Durchmesser: 800 m, Höhe: 1 mm). (b) Alginatgel, komprimiert durch den größten PDMS-Ballon (D = 2,0 mm). Der Druckstamm des Alginatgels beträgt 33,8%. (c) Der Druckstamm des Alginatgels(Gel)nimmt um 5 % pro 0,2 mm Inkrement des PDMS-Ballondurchmessers zu (D). Fehlerleiste: Standardabweichung. Rote Linie: lineare Formlinie Diese Figur wird von 26reproduziert.

Figure 4
Abbildung 4. Messung der Chondrozytenverformung unter statischer Kompression.
(a) In der Mitte des Gelkonstrukts wurde ein z-Stack-Bild [613 'm' 613 'm' 40–55 ' m(x 'y 'z)] erhalten, das 300–400 m vom Gelboden aus erreicht wurde. (b) Unterschiedliche Größen der Chondrozyten-Druckdehnung (-Zelle) ergaben sich als Funktion des PDMS-Ballondurchmessers (D). Icon : Mittelwerte. Icon : jeden Datenpunkt. Die obere (oder untere) und die mittlere Linie des Feldes sind die Standardabweichung bzw. der Medianwert. Diese Zahl wird von 26reproduziert.

Abbildung S1. Mikrokanal-Fotomaskendesign für Schritt 1.3.4 (Einheit = mm). Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Abbildung S2. Aluminiumformkonstruktion für Schritt 3.2.3 (Einheit = mm). Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Abbildung S3. Permanente Verformung des Alginatgels (1,5%, w/v) unter 1 h-lange Dynamik (1 Hz) und statische Kompression. Diese Zahl wird von 26reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

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Discussion

Um die Auswirkungen der Druckspannung auf Wachstumsplattenchondrozyten zu testen, haben wir das mikrofluidische Chondrozytenkompressionsgerät (Abbildung 1) entwickelt, um verschiedene Druckgrade auf die Chondrozyten im Alginat-Hydrogelgerüst für 3D anzuwenden. Kultur auf hochdurchsatzweise. Um andere Forscher bei der Einführung unseres Geräts oder der Entwicklung ähnlicher Geräte zu unterstützen, haben wir in diesem Protokollartikel Details zu den Schritte zur Geräteherstellung bereitgestellt.

Die entscheidenden Schritte in diesem Protokoll sind 1) Herstellung von PDMS-Schicht mit pneumatischen Mikrokanälen (Schicht 1) ohne Luftblasen, da Luftblasen in Schicht 1 pneumatische Mikrokanäle beschädigen können, während die Hintergrundtransparenzfolie abgezogen wird, 2) konstante Temperatur (z.B. 80 °C) zur Aushärtung von PDMS-Ballons (Schicht 2), da die Elastizität von PDMS bekanntlich von der Aushärtungstemperatur36, 3) abhängt, die Alginat-Gel-Konstrukte mit den PDMS-Ballons ausrichtet, und 4) mit frischem aminosilanisiertem Glas Platte (Glasplatte 2) zum Verkleben der Alginat-Gelsäulen auf Glasplatte 2 innerhalb von zwei Tagen nach der Versalzungsbehandlung.

Die Haupteinschränkung dieses Protokolls ist, dass es relativ arbeitsintensiv ist, das Gerät herzustellen, da der Prozess Photolithographie und mehrere Schritte der weichen Lithographie beinhaltet. Darüber hinaus muss die Leistung von mikrofluidischen Zellkompressionsgeräten, die auf der Grundlage unseres Protokolls hergestellt werden, bei der Verwendung verschiedener Hydrogele und Zellen bewertet werden. Dies liegt daran, dass unterschiede in den mechanischen Eigenschaften von Hydrogelen und Zellen die Geräteleistung beeinflussen.

Obwohl unser mikrofluidisches Zellkompressionsgerät für die Anwendung dynamischer Kompression auf Chondrozyten ist, wurde seine Leistung durch die Abbildung statisch komprimierter Alginatgele und -zellen bewertet. Dies liegt daran, dass es schwierig war, Gele und Zellen unter dynamischer Kompression mit der herkömmlichen konfokalen Mikroskopie abzubilden. Wir verglichen statische (14 kPa, 1 h) und dynamische Kompression (14 kPa, 1 Hz, 1 h) in Bezug auf die permanente Verformung von Alginatgel und stellten fest, dass die permanente Verformung des Gels unter der dynamischen Kompression im Vergleich zur statischen Kompression vernachlässigbar war (siehe Zusatzabbildung S3).

Ein Vorteil unserer Methode ist, dass sie für andere Zelltypen verwendet werden kann, die eine 3D-Kulturumgebung benötigen. Die resultierende Kompression des Gerätes kann je nach Anwendung moduliert werden, indem der Durchmesser und die Dicke der PDMS-Ballon und/oder der Druck im Ballon geändert werden. Es ist auch möglich, die Elastizität des PDMS-Ballons zu ändern, indem das Mischungsverhältnis zwischen dem Prepolymer und dem Härtungsmittel angepasst wird. Zellen in diesem Gerät können in Echtzeit mit Licht-/Fluoreszenzmikroskopie abgebildet werden, und das Gerät kann schnell für die Zellernte demontiert werden, um eine nachgeschaltete Analyse zu ermöglichen. Ein weiterer Vorteil ist die Möglichkeit, fünf unterschiedliche mechanische Spannungsstufen mit fünf technischen Replikationen pro Spannungsstufe mit einem einzigen Gerät zu erzeugen. Die Kombination von Replikation und einer Dosis-Wirkungs-Analyse gewährleistet ein hohes Maß an Strenge und Reproduzierbarkeit in den Ergebnissen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Wir danken Drs. Christopher Moraes und Stephen A. Morin für ihre Unterstützung bei gerätedesign und -herstellung. Diese Studie wurde durch das Bioengineering for Human Health Stipendium der University of Nebraska-Lincoln (UNL) und des University of Nebraska Medical Center (UNMC) und das Stipendium AR070242 vom NIH/NIAMS unterstützt. Wir danken Janice A. Taylor und James R. Talaska von der Advanced Microscopy Core Facility am University of Nebraska Medical Center für die Unterstützung bei der konfokalen Mikroskopie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-Aminopropyl)triethoxysilane (ATPES) Sigma-Aldrich 741442-100ML
(Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane United Chemical Technologies T2492-KG
Acrylic sheet McMaster-Carr 8560K354
Air pump Schwarzer Precision SP 500 EC-LC4.5V DC We used the model purchased in 2015. The internal design and performance of air pump (SP 500 EC-LC) changed in early 2016. Also, air pump performance has changed in the course of time. Thus, air pressure generated by an SP 500 EC-LC air pump should be calibrated before use.
Alginate powder FMC Corporation Pronova UP MVG
Barb Straight Connectors (Metal tube) Pneumadyne EB40-250
Calcein AM Invitrogen C3100MP
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11960-044
Dyed red aqueous fluorescent particles Thermo Fisher Scientific R0100
EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) Thermo Fisher Scientific 22980
Foam pad GRAINGER Item # 5GCE8
Function / Arbitrary Waveform Generator Keysight Technologies 33210A
Hydrochloric acid Fisher Chemical A144-500
Hydrogen peroxide Fisher BioReagents BP2633500
Isopropyl alcohol BDH1174-4LP VWR
Microscope slides Thermo Fisher Scientific 22-267-013
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-001
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Power supply Keysight Technologies E3630A
SeaKem LE Agarose Lonza 50004
Sodium hydroxide Fisher Chemical S318-1
Solenoid manifold Pneumadyne MSV10-1
Solenoid valve Pneumadyne S10MM-30-12-3
Spin coater Laurell Technologies WS-650Mz-23NPPB
SU8 Developer MicroChem Corp. Y020100 4000L1PE
SU8-100 MicroChem Corp. Y131273 0500L1GL
SU8-5 MicroChem Corp. Y131252 0500L1GL
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) Thermo Fisher Scientific 24510
Sulfuric acid EMD Millipore MSX12445

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References

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Eine mikrofluidische Plattform zur Stimulierung von Chondrozyten mit dynamischer Kompression
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Lee, D., Erickson, A., Dudley, A. T., Ryu, S. A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression. J. Vis. Exp. (151), e59676, doi:10.3791/59676 (2019).

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