Summary
Este artigo fornece métodos detalhados para fabricar e caracterizar um dispositivo microfluídicos de actuação pneumaticamente para a compressão do condrócitos.
Abstract
Estímulos mecânicos são conhecidos por modulam funções biológicas de células e tecidos. Estudos recentes sugerem que o estresse compressivo altera a arquitetura da cartilagem da placa de crescimento e resulta na modulação do crescimento de ossos longos de crianças. Para determinar o papel do stress compressivo no crescimento ósseo, criamos um dispositivo microfluídico acionado por pressão pneumática, para dinamicamente (ou estaticamente) comprimir condrócitos de placa de crescimento embutidos em cilindros de hidrogel de alginato. Neste artigo, descrevemos métodos detalhados para fabricar e caracterizar este dispositivo. As vantagens de nosso protocolo são: 1) cinco magnitudes diferentes do esforço compressivo podem ser gerados em cinco repetições técnicas em uma única plataforma, 2) é fácil visualizar a morfologia da pilha através de um microscópio de luz convencional, 3) as pilhas podem ràpida ser isoladas a partir do dispositivo após a compressão para facilitar os ensaios a jusante, e 4) a plataforma pode ser aplicada para estudar mecanobiologia de qualquer tipo de célula que pode crescer em hidrogéis.
Introduction
As plataformas micro-projetadas são ferramentas valiosas para estudar a biologia molecular, celular, e do nível de tecido porque permitem o controle dinâmico dos microambientes físicose químicos1,2,3 ,4,5,6,7,8. Assim, as hipóteses múltiplas podem simultaneamente ser testadas em uma maneira firmemente controlada. No caso da cartilagem da placa de crescimento, há evidências crescentes de um importante papel do estresse compressivo na modulação do crescimento ósseo através da ação sobre a cartilagem da placa de crescimento9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25. No entanto, o mecanismo de ação do estresse compressivo – em particular, como o estresse orienta a formação de colunas de condrócitos na placa de crescimento – é pouco compreendido.
O objetivo deste protocolo é criar um dispositivo de compressão de condrócitos microfluídico de acionamento pneumaticamente26 para elucidar mecanismos de mecanobiologia em condrócitos de placa de crescimento (Figura 1a-c). O dispositivo consiste em duas porções: a unidade pneumática da atuação e a construção do gel do alginato. A unidade de acionamento pneumático microfluídico é fabricada com polidimetilsiloxano (PDMS) com base na foto e na Soft-litografia. Esta unidade contem uma disposição 5 x 5 de balões finos da membrana de PDMS que podem ser inflados diferentemente baseados em seus diâmetros. A construção do gel do alginato consiste nos condrócitos encaixados em uma disposição 5 x 5 de cilindros do gel do alginato, e os constructos inteiros do alginato-chondrocyte são montados com a unidade da atuação. As construções de gel de alginato são compactadas pelos balões PDMS inflacionados pneumaticamente (Figura 1b). O dispositivo microfluídico pode gerar cinco níveis diferentes de estresse compressivo simultaneamente em uma única plataforma baseada em diferenças no diâmetro do balão PDMS. Assim, um teste da elevado-taxa de transferência do mechanobiology do condrócitos circunstâncias múltiplas da compressão é possível.
O dispositivo microfluídico descrito neste protocolo tem muitas vantagens sobre o dispositivo de compressão convencional, tais como fixadores externos14,21,23 e dispositivos de compressão macroscópica16, 19 anos de , 27 anos de , 28 para estudar a mecanobiologia do condrócitos: 1) o dispositivo microfluídicos é cost-effective porque consome o volume menor das amostras do que o dispositivo macroscópico da compressão, 2) o dispositivo microfluídicos é tempo eficaz porque pode testar o múltiplo condições de compressão simultaneamente, 3) o dispositivo microfluídico pode combinar estímulos mecânicos e químicos, formando um gradiente de concentração de produtos químicos com base na mistura limitada em microcanais, e 4) várias técnicas de microscopia (lapso de tempo microscopia e microscopia confocal da fluorescência) podem ser aplicados com o dispositivo microfluídicos feito de PDMS transparente.
Adotou-se e modificou o método de Moraes et al.7,29 para criar diferentes níveis de estresse compressivo em um único dispositivo para possibilitar estudos de mecanobiologia de alta produtividade de compressão de condrócitos. Nossa aproximação é apropriada para pilhas (por exemplo, chondrocytes) que precisam o ambiente tridimensional (3D) da cultura e para ensaios biológicos após ter comprimindo pilhas. Embora alguns dispositivos de compressão celular microfluídico possam comprimir células cultivadas em substratos bidimensionais (2D)30,31,32, eles não podem ser usados para condrócitos porque os condrócitos cultivados em 2D desdiferenciam-se. Existem plataformas microfluídico para comprimir células 3D cultivadas em hidrogéis fotopolimerizados7,33, mas eles são limitados em isolar as células após experimentos de compressão porque isolar as células de fotopolimerizadas hidrogel não é fácil. Adicionalmente, os efeitos da exposição ultravioleta (UV) e dos iniciadores de reticulação da foto nas pilhas podem precisar de ser avaliados. Em contraste, nosso método permite o isolamento rápido de células após experimentos de compressão para ensaios pós-biológicos, pois os hidrogéis de alginato podem ser despolimerizados rapidamente por quelantes de cálcio. Os métodos detalhados da fabricação e da caracterização do dispositivo são descritos neste protocolo. Um breve procedimento para fabricar o dispositivo de compressão microfluídico de condrócitos é mostrado na Figura 2.
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Protocol
Nota: Use equipamento de proteção individual (EPI) como luvas e jaleco para cada passo neste protocolo.
1. fabricação do molde mestre
Nota: execute a etapa 1,1-1,3 em uma capa das emanações.
- Tratamento de vidro
Nota: Use um escudo facial, luvas e um jaleco para o passo 1,1.- Faça a solução da piranha (60 mL) misturando O ácido sulfúrico (H2assim4) e O peróxido de hidrogênio (h2O2) com uma relação do volume de 3:1.
Cuidado: não use a solução de piranha e a acetona na mesma capa de fumaça devido ao risco de explosão. - Coloque uma placa de vidro (50,8 mm × 76,2 mm × 1,2 mm) em solução de piranha por 30 min a 40 ° c.
- Enxágüe a placa de vidro com água deionizada (diH2o).
- Coloque a placa de vidro em acetona à temperatura ambiente durante 10 min.
- Enxague a placa de vidro com isopropanol e seque-a com gás nitrogênio (N2).
- Asse a placa de vidro a 200 ° c por 20 min em uma placa quente. Todas as etapas subseqüentes do cozimento usam uma placa quente.
- Faça a solução da piranha (60 mL) misturando O ácido sulfúrico (H2assim4) e O peróxido de hidrogênio (h2O2) com uma relação do volume de 3:1.
- Formação da camada de semente SU-8 na placa de vidro
- Espalhe SU-8 5 na placa de vidro com uma pipeta descartável para cobrir ao redor 2/3 da área de superfície da placa.
- Gire a placa de vidro com os fotororesists SU-8 5 em 500 RPM para 35 s (ciclo de giro inicial) e então 2.500 RPM para 40 s (ciclo de giro final) usando um Coater da rotação. Todas as etapas subsequentes do revestimento da rotação incluem o mesmo ciclo de giro inicial.
- Asse a placa de vidro revestida SU-8 5 a 65 ° c durante 2 min e, em seguida, a 95 ° c durante 5 min.
- Expor a placa de vidro revestida Su-8 5 à luz UV (60 mW/cm2, distância entre a lâmpada UV e o Fotomáscara é 20 cm, quantidade total de energia luminosa UV = 60 MJ/cm2) para 1 s.
Nota: o tempo de exposição UV deve ser ajustado de acordo com o poder de uma luz UV usada. - Asse a placa de vidro revestida SU-8 5 a 65 ° c durante 2 min e a 95 ° c durante 5 min.
- Coloque a placa de vidro cozido no desenvolvedor SU-8 por 2 min.
- Asse o vidro revestido SU-8 5 a 180 ° c durante 20 min.
- Fabricação de padrão de canal SU-8 usando fotolitografia (Figura 2a etapa 1-3)
- Despeje SU-8 100 na placa de vidro semeado SU-8 5 para cobrir cerca de 2/3 da área de superfície da placa.
- Gire a placa de vidro com SU-8 100 em 3.000 rpm para 38 s (≈ 90 μm de espessura).
- Asse a placa de vidro revestida SU-8 100 a 65 ° c durante 10 min e, em seguida, a 95 ° c durante 30 min. Se SU-8 100 é ainda pegajoso após este procedimento, asse a placa de vidro por um tempo mais longo em 95 ° c até que SU-8 100 se torne não-pegajoso.
- Coloque uma Fotomáscara de microcanal de alta resolução (25.400 dpi, ver Figura complementar 1) na placa de vidro revestida SU-8 100 e expor a placa de vidro coberta de Fotomáscara à luz UV por 4 s (quantidade total de energia de luz uv = 240 MJ/cm2).
Nota: o tempo de exposição UV deve ser ajustado de acordo com o poder de uma luz UV usada. - Retire a máscara fotográfica da placa de vidro e asse a placa de vidro a 65 ° c durante 2 min e, em seguida, 95 ° c durante 20 min.
- Mantenha a placa de vidro cozida em um recipiente, que seja envolvida com a folha de alumínio para obstruir toda a luz, para a cura durante a noite.
- Desenvolva padrões de canal SU-8 100 na placa de vidro no desenvolvedor SU-8 por 15 min.
- Lave a placa de vidro com padrão SU-8 (molde mestre) com álcool isopropílico e seque-a com gás N2 . Se as partículas brancas permanecerem durante este processo, repita o passo 7 por 5 min.
2. unidade de acionamento pneumático
- Camada de microcanais (camada 1)
Nota: execute a etapa 2.1.1-2.1.2 em uma capa das emanações.- Gota 200 μL de (Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)- -1-Trichlorosilane em uma lamínula e coloc o em uma câmara de vácuo com o molde mestre.
- Aplique vácuo por 2 min na câmara e aguarde 6 h (ou durante a noite) para a silanização do molde.
- Misture PDMS com uma relação de peso de 10:1 (pré-polímero: agente de cura) por 5 min.
Nota: toda a etapa subseqüente da carcaça de PDMS contem a mesma relação do peso do Prepolímero e do agente de cura (10:1). - Despeje PDMS no molde mestre e Degas PDMS em uma câmara de vácuo por 30 min.
- Sanduíche PDMS com um pedaço de filme de transparência.
- Prenda o conjunto acima imprensado com uma placa de vidro, almofadas de espuma e placas de plexiglass (Figura 2a passo 4).
- Cure PDMS em forno a 80 ° c por 6 h.
- Isole a camada PDMS (camada 1) com o filme de transparência da estrutura imprensada (Figura 2a etapa 5).
- Ative as superfícies da camada 1 e uma placa de vidro limpa (placa de vidro 1; 50,8 mm × 76,2 mm × 1,2 mm) usando um limpador de plasma por 1 min.
Nota: o tempo de limpeza do plasma pode variar com base na potência de um limpador de plasma usado. - Bond Layer 1 na placa de vidro 1 e coloque-as no forno a 80 ° c durante 30 min.
- Remova o filme de transparência da camada 1.
- Membrana fina de PDMS (camada 2)
- Spin Coat não curado PDMS em um filme de transparência em 1.000 rpm por 1 min para obter uma camada PDMS de 60 μm de espessura.
- Parcialmente cura spin revestido PDMS (camada 2) no forno a 80 ° c por 20-30 min.
- Ative a camada 1 na placa de vidro 1 e na camada 2 usando o limpador de plasma por 1 min.
Nota: o tempo de limpeza do plasma pode variar com base na potência de um limpador de plasma usado. - Bond a camada 2 na camada 1 e coloque-as no forno a 80 ° c durante a noite.
- Bloco da tubulação
- Coloc os tubos do metal verticalmente em um prato de Petri.
- Delicadamente despeje PDMS no prato para submergir cerca de 3/4 dos tubos de metal.
- Cure PDMS no forno a 60 ° c por 6 h (ou durante a noite).
- Corte um pedaço de bloco PDMS contendo um tubo de metal.
- Perfure um furo na camada 2 para a entrada.
- Ative o bloco PDMS e a camada 2 usando o limpador de plasma por 1 min.
- Fixe o bloco PDMS na parte de entrada da camada 2 e coloque toda a unidade de acionamento no forno a 80 ° c durante a noite.
3. alginato-condrócitos (ou talão) construções
- Placa de vidro amino-silanized
- Corte uma placa de vidro (50,8 mm × 76,2 mm × 1,2 mm) em duas placas de vidro de tamanho médio (50,8 mm × 38,1 mm × 1,2 mm) usando um scriber diamante.
- Coloque as placas de vidro em 0,2 M de cloreto de hidrogênio (HCl) e agitar suavemente (por exemplo, 55 rpm)-los durante a noite.
- Enxágüe as placas de vidro com diH2o.
- Agitar as placas de vidro em 0,1 M de hidróxido de sódio (NaOH) por 1 h a 55 rpm e enxágüe-os com diH2O.
- Agitar as placas de vidro em 1% (v/v) 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTES) para 1 h em 55 rpm e enxágüe-os com diH2O.
- Seque as placas de vidro amino-silanized em uma capa das emanações durante a noite.
- Molde do gel do agarose para construções do gel do alginato
- Misture 5% (w/v) agarose e cloreto de cálcio 200 mM (CaCl2) em DIH2O.
- Ferva a solução de gel de agarose com um forno de microondas (ou uma placa quente). O tempo de ebulição varia com base no volume da solução de gel de agarose e a potência do forno de microondas (ou a temperatura da chapa quente).
- Despeje a solução de gel de agarose cozido em um molde de alumínio (ver Figura complementar S2), e sanduíche-lo com uma placa de vidro.
- Aguarde 5 min e desenforme o gel de agarose solidificado do molde de alumínio.
- Colheita da condrócitos da placa do crescimento
- Isole placas do crescimento dos membros traseiros de ratos neonatais.
- Coloque as placas de crescimento em 1 mL de 0,25% de colagenase por 3 h em uma incubadora a 37 ° c e 8% de dióxido de carbono (CO2), para remover a matriz extracelular (ECM).
- Centrifugue a amostra digerida por 5 min em 125 x g para fazer uma pelota do condrócitos e remova o sobrenadante da amostra. Aqui, 1 x g é a aceleração da gravidade.
- Ressuscitar a pelota do condrócitos em 1 ml de Dulbecco ' s modificou o meio da águia (DMEM).
- Conte o número de condrócitos no DMEM usando um contador de células.
- Centrifugue os condrócitos em DMEM durante 5 min a 125 x g para fazer uma pastilha de condrócitos novamente e remova o sobrenadante da amostra.
- Opcionalmente, ressuscitar a pelota do condrócitos nos meios de cultura do condrócitos (CCM)34 que contêm a calceína am de 2 μm, e incubar a amostra em 37 ° c por 30 minutos. Repita o passo 3.3.6 e mova para a etapa 3.3.8.
- Resuspend a pelota do condrócitos em um volume desejado de CCM e mantê-los na incubadora em 37 ° c e em 8% co2 antes de usar.
- Construções de alginato-condrócitos (ou talão) (Figura 2C)
- Misture 1,5% (w/v) alginato em solução salina tampão fosfato (PBS) com 5 mg/mL de sulfo-NHS, 10 mg/mL de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) cloridrato de carbodiimida (EDC).
- Adicione 8 x 106 condrócitos no 1 ml de solução de gel de alginato [ou adicione 3 μL de grânulos fluorescentes de 1 μm de diâmetro (542/612 nm) em 1 ml de solução de gel de alginato (0,3% (v/v))].
- Colocar 150 μL da solução de alginato-condrócitos (ou talão) na placa de vidro amino-silanized fabricada no passo 3,1.
- Cubra a solução de gel de alginato com o molde de gel de agarose por 3 min.
- Remova a solução excessiva do gel do alginato que transborda do molde do gel do agarose com uma lâmina de lâmina e remova o molde do gel do agarose. Então, as construções cilíndricas do alginato-chondrocyte (ou grânulo) são obtidas na placa de vidro amino-silanized.
- Coloc os constructos do alginato-chondrocyte na solução cross-linking (50 de milímetro CaCl2 /140 milímetro NaCl em DIH2O) por 1 minuto para uma polimerização mais adicional.
4. montagem do dispositivo (Figura 2D)
Nota: os espaçadores PDMS e os grampos impressos em 3D precisam ser preparados separadamente.
- Localize quatro espaçadores PDMS de 1 mm de espessura nos quatro cantos da camada 2 da unidade de acionamento.
- Coloque 700 μL de CCM para cobrir as câmaras de ar da camada 2.
- Coloque as construções de alginato-condrócitos (ou talão) na camada 2 enquanto alinha cuidadosamente as construções com as câmaras de ar.
- Fixe o dispositivo com grampos impressos em 3D (Figura 1C).
5. accionamento do dispositivo
- Conecte a tomada de uma bomba de ar (veja a tabela de materiais) com a entrada de uma válvula de solenóide com uma tubulação do silicone.
- Conecte a tomada da válvula de solenóide com a entrada do dispositivo montado com uma tubulação do silicone.
- Ligue a válvula solenóide com um gerador de função.
- Manipule a válvula solenóide com uma onda quadrada (por exemplo, 1 Hz) gerada pelo gerador de função.
- Ligue a bomba de ar para accionar o dispositivo pneumaticamente.
6. imagem latente dos condrócitos no dispositivo
Nota: para obter uma boa qualidade de imagem, condrócitos de imagem (ou grânulos fluorescentes) em gel de alginato através de placa de vidro 2 porque expandido balões PDMS e câmaras de ar pode distorcer imagens ópticas. Se um microscópio invertido é usado para a imagem latente, o dispositivo precisa de ser instalação de modo que a placa de vidro 2 enfrenta para baixo.
- Prepare o dispositivo com condrócitos (ou grânulos fluorescentes) como mostrado nas secções anteriores.
- Tome imagens z-Stack de condrócitos (ou grânulos fluorescentes) com um microscópio confocal antes e compressão, respectivamente. Escolha um tamanho z-Step com base na profundidade de campo de um sistema de imagem confocal usado.
- A altura dos condrócitos (ou uma construção de alginato-talão) pode ser medida com o método de processamento automático de imagem mostrado em literaturas anteriores26,35.
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Representative Results
Este artigo mostra etapas detalhadas da fabricação do dispositivo de compressão de condrócitos microfluídico (Figura 2). O dispositivo contém uma matriz de 5 x 5 de construções cilíndricas de alginato-condrócito, e essas construções podem ser compactadas com cinco magnitudes diferentes de compressão (Figura 1, figura 3 e Figura 4). A altura do Microchannel pneumático é ao redor 90 μm, e os diâmetros do balão de PDMS são 1,2, 1,4, 1,6, 1,8 e 2,0 milímetros, respectivamente. O desempenho do dispositivo foi quantificado com microscopia confocal com condições de compressão estática e processamento de imagem. A compressão estática foi empregada para a imagem latente microscópica porque a imagem latente da z-pilha com a microscopia confocal toma alguns minutos, assim que é demasiado lenta para a imagem latente quantitativa durante a compressão dinâmica.
A Figura 3a mostra as matrizes 5 × 5 de colunas de hidrogel de alginato (diâmetro: ~ 0,8 mm, altura: ~ 1 mm) fundido na chapa de vidro 2. Estas construções do gel foram imaged adicionando grânulos fluorescentes no gel. A Figura 3B mostra um exemplo caso que a coluna do gel estêve comprimida por 33,8% na altura pelo balão o maior de PDMS. A cepa compressiva resultante das construções de gel aumentou em aproximadamente 5% por incremento de 0,2 mm no diâmetro do balão PDMS, como mostrado na Figura 3C.
A deformação compressiva dos condrócitos foi determinada pela imagem das células em um volume de 613 μm × 613 μm × 40 – 55 μm (x × y × z) próximo ao centro de construção de gel, como mostrado na figura 4a. A Figura 1D mostra uma imagem de exemplo de um condrócitos que foi comprimido por 16% pelo maior balão PDMS. A Figura 4B mostra a distribuição dos valores de deformação da compressão celular medida, e as células totais foram compactadas mais por balões PDMS maiores. Portanto, a quantidade de gel de alginato e compressão de condrócitos foram controladas pelo diâmetro dos balões PDMS (Figura 3 e Figura 4) com pressão constante de 14 kPa.
Figura 1. Dispositivo de compressão microfluídico de condrócitos.
(a) esquemático do dispositivo montado. Uma matriz de 5 × 5 de alginato – construções de condrócitos são alinhadas em balões PDMS com 5 diâmetros diferentes (d = 1,2, 1,4, 1,6, 1,8 e 2,0 mm), onde D é o diâmetro do balão PDMS (ou câmara de ar). (b) esquemático da operação do dispositivo. O dispositivo é accionado pela pressão pneumática que expande balões de PDMS. (c) imagem de um dispositivo real (diâmetro da moeda = 19 mm). (d) secções transversais verticais de um condrócitos antes (à esquerda) e compressão (direita) no maior balão PDMS (d = 2,0 mm) (estirpe compressiva celular, célula ε = | alteração da altura da célula/altura da célula inicial | x 100 = 16%). Este número é reproduzido a partir de 26.
Figura 2. Etapas detalhadas da fabricação microfluídicos do dispositivo da compressão do condrócitos.
(a) fotolitografia para a geração de um molde mestre Su-8 e a seguir litografia macia para a criação de camada PDMS com microcanais pneumáticos (camada 1). (b) membrana fina do PDMS (camada 2) em um filme da transparência gerado pelo revestimento da rotação. (c) método de fundição de gel de alginato cilíndrico em vidro (placa de vidro 2). (d) montagem do dispositivo de compressão microfluídico de condrócitos. Este número é reproduzido a partir de 26. Por favor clique aqui para baixar uma versão maior desta figura.
Figura 3. Medição da deformação do gel de alginato compressão estática.
(a) 5 x 5 matrizes de construções cilíndricas do gel do alginato (diâmetro: ~ 800 μm, altura: ~ 1 milímetro). (b) gel de alginato comprimido pelo maior balão PDMS (D = 2,0 mm). A estirpe compressiva do gel de alginato é de 33,8%. (c) a estirpe compressiva de gel de alginato (εgel) aumenta em torno de 5% por incremento de 0,2 mm de diâmetro do balão de PDMS (D). Barra de erro: desvio padrão. Linha vermelha: linha de encaixe linear esta figura é reproduzida a partir de 26.
Figura 4. Medida da deformação do condrócitos a compressão estática.
(a) uma imagem z-Stack [613 μm × 613 μm × 40 – 55 μm (x × y × z)] foi obtida no meio da construção do gel, 300 – 400 μm da parte inferior do gel. (b) diferentes magnitudes de estirpe compressiva de condrócitos (célulaε) resultaram em função do diâmetro do balão PDMS (D). 
: valores médios. 
: cada pontos de dados. As linhas superior (ou inferior) e média da caixa são o desvio padrão e o valor mediano, respectivamente. Este número é reproduzido a partir de 26.
Figura S1. Projeto do Fotomáscara do Microchannel para a etapa 1.3.4 (unidade = milímetro). Por favor clique aqui para baixar esta figura.
Figura S2. Projeto de molde de alumínio para a etapa 3.2.3 (unidade = milímetro). Por favor clique aqui para baixar esta figura.
Figura S3. Deformação permanente do gel de alginato (1,5%, w/v) 1 h-longa dinâmica (1 Hz) e compressão estática. Este número é reproduzido a partir de 26. Por favor clique aqui para baixar esta figura.
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Discussion
Para testar os efeitos do estresse compressivo nos condrócitos da placa de crescimento, desenvolvemos o dispositivo de compressão microfluídico do condrócito (Figura 1) para aplicar vários níveis de estresse compressivo aos condrócitos no andaime de hidrogel de alginato para 3D cultura em formas de alta taxa de transferência. Para ajudar outros pesquisadores a adotar nosso dispositivo ou desenvolver dispositivos semelhantes, fornecemos detalhes das etapas de fabricação do dispositivo neste artigo de protocolo.
As etapas cruciais neste protocolo são 1) fabricando a camada de PDMS com microcanais pneumáticos (camada 1) sem nenhumas bolhas de ar desde que as bolhas de ar na camada 1 podem danificar microcanais pneumáticos quando o filme da transparência do revestimento protetor for descascado fora, 2) mantendo um temperatura constante (por exemplo, 80 ° c) para curar balões de PDMS (camada 2) porque a elasticidade de PDMS é sabido para depender da temperatura de cura36, 3) alinhando as construções do gel do alginato com os balões de PDMS, e 4) usando o vidro amino-silanized fresco placa (placa de vidro 2) para a colagem das colunas do gel do alginato na placa de vidro 2 dentro de dois dias após o tratamento da salinização.
A limitação principal deste protocolo é que é relativamente labor intensivo fabricar o dispositivo porque o processo envolve o photolithography e as etapas múltiplas da litografia macia. Adicionalmente, o desempenho de dispositivos de compressão celular microfluídico fabricados com base em nosso protocolo precisa ser avaliado sempre que diferentes tipos de hidrogéis e células são usados. Isso porque qualquer diferença nas propriedades mecânicas de hidrogéis e células afetará o desempenho do dispositivo.
Embora nosso dispositivo microfluídicos da compressão da pilha seja aplicando a compressão dinâmica aos condrócitos, seu desempenho foi avaliado pelo géis e pelas pilhas estaticamente comprimidas da imagem latente do alginato. Isto é porque era duro aos géis e às pilhas da imagem a compressão dinâmica com a microscopia confocal convencional. Nós comparamos a estática (14 kPa, 1 h) e a compressão dinâmica (14 kPa, 1 hertz, 1 h) nos termos da deformação permanente do gel do alginato e descobrimos que a deformação permanente do gel a compressão dinâmica era insignificante comparada à compressão estática (veja Figura complementar S3).
Uma vantagem do nosso método é que ele pode ser usado para outros tipos de células que precisam de ambiente de cultura 3D. A compressão resultante do dispositivo pode ser modulada dependendo das aplicações, alterando o diâmetro e a espessura dos balões PDMS e/ou a pressão no balão. Também é possível modificar a elasticidade do balão PDMS ajustando a relação de mistura entre o pré-polímero e o agente de cura. As pilhas neste dispositivo podem ser imaged no tempo real usando a microscopia da luz/fluorescência, e o dispositivo pode ràpida ser desmontado para que a colheita da pilha permita a análise a jusante. Outra vantagem é a capacidade de gerar cinco níveis distintos de estresse mecânico com cinco repetições técnicas por cada nível de estresse usando um único dispositivo. A combinação de replicação e uma análise dose-resposta assegura um alto grau de rigor e reprodutibilidade nos resultados.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos aos Drs. Christopher Moraes e Stephen A. Morin por seu suporte para design e fabricação de dispositivos. Este estudo foi apoiado pela bioengenharia para subsídio de saúde humana da Universidade de Nebraska-Lincoln (UNL) e da Universidade de Nebraska Medical Center (UNMC), e Grant AR070242 da NIH/NIAMS. Agradecemos a Janice A. Taylor e James R. talaska, da central de microscopia avançada do centro médico da Universidade de Nebraska, por fornecer assistência com microscopia confocal.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (ATPES) | Sigma-Aldrich | 741442-100ML | |
| (Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane | United Chemical Technologies | T2492-KG | |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K354 | |
| Air pump | Schwarzer Precision | SP 500 EC-LC4.5V DC | We used the model purchased in 2015. The internal design and performance of air pump (SP 500 EC-LC) changed in early 2016. Also, air pump performance has changed in the course of time. Thus, air pressure generated by an SP 500 EC-LC air pump should be calibrated before use. |
| Alginate powder | FMC Corporation | Pronova UP MVG | |
| Barb Straight Connectors (Metal tube) | Pneumadyne | EB40-250 | |
| Calcein AM | Invitrogen | C3100MP | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| Dyed red aqueous fluorescent particles | Thermo Fisher Scientific | R0100 | |
| EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | 22980 | |
| Foam pad | GRAINGER | Item # 5GCE8 | |
| Function / Arbitrary Waveform Generator | Keysight Technologies | 33210A | |
| Hydrochloric acid | Fisher Chemical | A144-500 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher BioReagents | BP2633500 | |
| Isopropyl alcohol | BDH1174-4LP | VWR | |
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 22-267-013 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Power supply | Keysight Technologies | E3630A | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S318-1 | |
| Solenoid manifold | Pneumadyne | MSV10-1 | |
| Solenoid valve | Pneumadyne | S10MM-30-12-3 | |
| Spin coater | Laurell Technologies | WS-650Mz-23NPPB | |
| SU8 Developer | MicroChem Corp. | Y020100 4000L1PE | |
| SU8-100 | MicroChem Corp. | Y131273 0500L1GL | |
| SU8-5 | MicroChem Corp. | Y131252 0500L1GL | |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Thermo Fisher Scientific | 24510 | |
| Sulfuric acid | EMD Millipore | MSX12445 |
References
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