Ein stabil etabliertes Zwei-Punkt-Injektionsmodell für Lysophosphatidylcholin-induziertes fokales Demyelin-Modell bei Mäusen
May 11th, 2022
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Zwei-Punkt-Injektion von Lysophosphatidylcholin über einen stereotaktischen Rahmen, um ein stabiles und reproduzierbares Demyelinmodell in Mäusen zu erzeugen.
Unser Modell ist von hoher Relevanz für Demyelinisierungserkrankungen, insbesondere für Multiple Sklerose. Und es kann dazu beitragen, die damit verbundene klinisch relevante Forschung voranzutreiben. Es ist ein detailliertes Protokoll, das bei Mäusen durch einen chirurgischen Eingriff schnell und stabil eine schwere Demyelinisierung verursachen könnte.
Wenn Sie diese Technik zum ersten Mal ausprobieren, seien Sie geduldig und stellen Sie sicher, dass die Koordinaten genau sind. Beginnen Sie mit dem Anschließen einer 32-Gauge-Nadel an eine 5-Mikroliter-Spritze. Nehmen Sie 5 Mikroliter LPC-Lösung zur Vorbereitung der Injektion ab.
Als nächstes bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie der Maus durch das Fehlen eines Zehenklemmreflexes, während die Atmung glatt ist. Positionieren Sie die Maus im stereotaktischen Rahmen mit der Rückenseite nach oben und sichern Sie den Kopf mit einem Nasenkegel und einer Zahnklemme. Befestigen Sie die Maus mit beidseitigen Ohrbügeln am stereotaktischen Gerät.
Stellen Sie sicher, dass die Ohrbügel eben sind und der Kopf horizontal und stabil ist. Desinfizieren Sie die Kopfhaut durch Abwischen mit Jodophor. Verwenden Sie dann ein Skalpell, um einen kleinen Schnitt auf etwa 1,5 Zentimeter entlang der Mittellinie der Kopfhaut zu schneiden, um den Schädel freizulegen.
Wischen Sie die Fertigkeit mit einem Wattestäbchen ab, das in 1% Wasserstoffperoxid getaucht ist, bis Bregma, Lambda und hintere Fontanelle freigelegt sind. Legen Sie die Spritze auf den stereotaktischen Apparat. Stellen Sie die horizontale Positionierung des Kopfes des Tieres sicher und lokalisieren Sie das Corpus callosum.
Sobald die Injektionsstelle bestimmt ist, notieren Sie die Koordinaten und markieren Sie sie mit einer Markierung auf dem Schädel. Bohren Sie die markierte Stelle vorsichtig mit einem Schädelbohrer ab. Achten Sie darauf, Blutungen zu vermeiden.
Bewegen Sie die Nadel langsam zu den angegebenen Koordinaten. Um die Demyelinisierung des Corpus callosum zu induzieren, injizieren Sie 2 Mikroliter LPC-Lösung an jeder Injektionsstelle mit einer Rate von 0,4 Mikrolitern pro Minute. Halten Sie die Nadel nach der Injektion für weitere 10 Minuten in jeder Stelle.
Vernähen Sie schließlich die Haut mit einer 4-0-Naht und warten Sie, bis das Tier innerhalb von 10 Minuten aufwacht. Das repräsentative Bild zeigt den Nachweis der Legionen der weißen Substanz mittels Luxol schneller blauer Färbung. Aus den Ergebnissen ist eine stabile Demyelinisierung des Corpus callosum 10 und 28 Tage nach der Injektion zu sehen.
Die Quantifizierung des Demyelinisierungsbereichs zu verschiedenen Zeitpunkten ist hier dargestellt. Durch Immunfluoreszenzfärbung des abgebauten Myelin-Basisproteins wurde in der LPC-injizierten Gruppe 10 Tage nach der Injektion ein bemerkenswerter Anstieg des dMBP beobachtet, was einen Myelinverlust im Corpus callosum darstellt. Die Western-Blot-Analyse der Expression des Myelin-Basisproteins (MBP) zeigte einen signifikanten Verlust von MBP nach Injektion von LPC.
Beta-Aktin wurde als Ladekontrolle verwendet, um den Baseline-Ausdruck zu messen. Elektronenmikroskopische Bilder bestätigen die myelinisierte Ultrastruktur im Corpus callosum der Scheingruppe und der LPC-injizierten Gruppe. GST-pi ist der Marker der Oligodendrozyten-Vorläuferzelle oder OPC, Differenzierungsreifung.
Nach 10 Tagen LPC-Injektion nahm die GST-pi im Vergleich zur Scheingruppe ab. Gleichzeitig kann die Proliferationsfähigkeit von Oligodendrozyten durch das Verhältnis der Oligodendrozytenproliferation und der gesamten Oligodendrozyten-Linienzellen reflektiert werden. Das höhere Verhältnis stellt eine stärkere Proliferation von Oligodendrozyten nach 10 Tagen nach der Injektion dar.
Die repräsentativen Bilder zeigen den Schwimmweg der Mäuse in jeder Gruppe, in Anwesenheit der Plattform und nach dem Entfernen der Plattform. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass das räumliche Gedächtnis von demyelinisierten Mäusen im Zweipunkt-LPC-Injektionsmodell signifikant beeinträchtigt ist. Stellen Sie bei diesem Verfahren sicher, dass die Injektionsrate genau ist, und halten Sie die Nadel für weitere 10 Minuten an jeder Stelle.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine Zwei-Punkt-Injektion von Lysophosphatidylcholin (LPC) unter Verwendung eines stereotaktischen Rahmens zur Erstellung eines stabilen Demyelinisierungsmodells bei Mäusen. Es bietet eine für die Untersuchung von Demyelinisierungskrankheiten relevante Methode, insbesondere für Multiple Sklerose, und ermöglicht die Erforschung der Mechanismen und Auswirkungen der Demyelinisierung.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Demyelinisierungsforschung
- Mausmodelle von Krankheiten
Hintergrund
- Das Verständnis der Demyelinisierung ist entscheidend für die Entwicklung von Behandlungen für Krankheiten wie Multiple Sklerose.
- Das beschriebene Verfahren soll eine schnelle und reproduzierbare Demyelinisierung in Laborumgebungen induzieren.
- Genaue chirurgische Technik ist für den Erfolg des Verfahrens wichtig.
- Histologische Analysen wie Luxol-Schnelle-Blau-Färbung werden zur Bewertung des Modells verwendet.
Zweck der Studie
- Etablierung eines zuverlässigen Modells für die Untersuchung der Mechanismen der Demyelinisierung.
- Erleichterung der Forschung zu möglichen therapeutischen Interventionen für Demyelinisierungs-bezogene Erkrankungen.
- Bereitstellung detaillierter chirurgischer Protokolle, die quantifizierbare Ergebnisse liefern.
Verwendete Methoden
- Das Modell beinhaltet einen stereotaktischen chirurgischen Ansatz für LPC-Injektionen.
- Mäuse werden mit einer LPC-Lösung an präzisen anatomischen Stellen injiziert, wobei speziell das Corpus callosum anvisiert wird.
- Jede Injektion beinhaltet 2 Mikroliter LPC, die mit einer kontrollierten Rate verabreicht werden.
- Postoperative Beurteilungen nach 10 und 28 Tagen liefern wichtige Ergebnismessungen.
- Histologische Techniken wie Immunfluoreszenz und Western Blotting werden zur Analyse des Myelinverlusts eingesetzt.
Hauptergebnisse
- Stable Demyelinisierung im Corpus callosum wurde erreicht, erkennbar durch histologische Färbungen an mehreren Zeitpunkten.
- Ein Anstieg von Markern, die auf Myelinverlust hindeuten, wurde durch verschiedene Analysen bestätigt.
- Verhaltensbeurteilungen zeigten signifikante Beeinträchtigungen des räumlichen Gedächtnisses nach der Demyelinisierung.
- Die Ergebnisse deuten auf Veränderungen in der Oligodendrozytenproliferation und -differenzierung als Reaktion auf die LPC-Behandlung hin.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie etabliert erfolgreich ein Modell zur Untersuchung der Dynamik der Demyelinisierung und potenzieller therapeutischer Strategien.
- Die Ergebnisse liefern Einblicke in die neuronalen Mechanismen, die der Demyelinisierung zugrunde liegen, und die Rolle der Oligodendrozyten.
- Dieses Modell könnte das Verständnis von Multipler Sklerose und ähnlichen Erkrankungen fördern.
