Summary
需要α-突触核蛋白的 体内 生理模型来研究和了解帕金森病的发病机制。我们描述了一种使用人源化酵母模型监测α-突触核蛋白的细胞毒性和聚集体形成的方法。
Abstract
帕金森病是第二常见的神经退行性疾病，其特征是由含有错误折叠和聚集的α突触核蛋白的路易体的形成引起的进行性细胞死亡。α-突触核蛋白是一种丰富的突触前蛋白，可调节突触囊泡运输，但其蛋白质内含物的积累会导致神经毒性。最近的研究表明，包括细菌伴侣在内的各种遗传因素可以在体外减少α-突触核蛋白聚集体的形成。然而，监测细胞中的抗聚集作用也很重要，以将其作为患者的潜在治疗方法。使用神经元细胞是理想的，但这些细胞难以处理，需要很长时间才能表现出抗聚集表型。因此，需要一种快速有效的体内工具进一步评估体内抗聚集活性。此处描述的方法用于监测和分析表达人α突触核蛋白的人源化酵母酿酒酵母中的抗聚集表型。该协议展示了可用于监测α-突触核蛋白诱导的细胞毒性以及细胞中α-突触核蛋白聚集体形成的体内工具。
Introduction
帕金森病（PD）是全球老龄化社会的一个严重问题。α-突触核蛋白的聚集与PD密切相关，α-突触核蛋白的蛋白质聚集体被广泛用作诊断疾病的分子生物标志物1。α-突触核蛋白是一种小的酸性蛋白质（长度为 140 个氨基酸），具有三个结构域，即 N 端脂质结合α螺旋、淀粉样蛋白结合中心结构域 （NAC） 和 C 端酸性尾部2。α-突触核蛋白的错误折叠可以自发发生，并最终导致淀粉样蛋白聚集体的形成，称为路易体3。α-突触核蛋白可能以多种方式促进PD的发病机制。一般来说，人们认为其异常的可溶性低聚形式称为原纤维是有毒物种，通过影响各种细胞靶标（包括突触功能）导致神经元细胞死亡3。
用于研究神经退行性疾病的生物学模型必须在基因组和细胞生物学方面与人类相关。最好的模型是人类神经元细胞系。然而，这些细胞系与一些技术问题有关，例如培养物维护困难，转染效率低以及费用高4。由于这些原因，需要一个简单可靠的工具来加速这一研究领域的进展。重要的是，该工具应该易于用于分析收集的数据。从这些角度来看，各种模式生物已被广泛使用，包括 果蝇、 秀丽隐杆线虫、 Danio rerio、酵母和啮齿动物5。其中，酵母是最好的模式生物，因为基因操作很容易，而且比其他模式生物便宜。最重要的是，酵母与人类细胞具有高度相似性，例如与人类直系同源物有60%的序列同源性，与人类疾病相关基因6的近源性为25%，并且它们还共享基本的真核细胞生物学。酵母含有许多蛋白质，其序列和功能与人体细胞相似7。事实上，表达人类基因的酵母已被广泛用作阐明细胞过程的模型系统8。这种酵母菌株被称为人源酵母，是探索人类基因功能的有用工具9。人源化酵母在研究遗传相互作用方面具有优点，因为遗传操作在酵母中已经建立起来。
本研究以酿酒酵母为模式生物研究PD的发病机制，特别是研究α-突触核蛋白聚集体形成和细胞毒性10。为了在出芽酵母中表达α-突触核蛋白，使用W303a菌株进行质粒转化，质粒编码α-突触核蛋白的野生型和家族性PD相关变体。由于W303a菌株在URA3上具有营养突变，因此适用于选择含有URA3质粒的细胞。质粒中编码的α-突触核蛋白的表达在GAL1启动子下调节。因此，可以控制α-突触核蛋白的表达水平。此外，绿色荧光蛋白（GFP）在α-突触核蛋白C末端区域的融合可以监测α-突触核蛋白病灶的形成。为了了解α-突触核蛋白家族性PD相关变异的特征，我们还在酵母中表达这些变异并检查了它们的细胞效应。该系统是筛选具有保护作用的化合物或基因的简单工具，可防止α-突触核蛋白的细胞毒性。
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Protocol
1. 培养基和溶液的制备
- 培养基制备
- 要制备YPD培养基，将50gYPD粉末溶解在dH2O中，使最终体积为1L.高压灭菌器。在室温 （RT） 下储存。
- 要制作YPD琼脂培养基，将50gYPD粉末和20g琼脂溶解在1L dH2O.高压灭菌器中。冷却后，倒入培养皿上。储存在4°C。
- 要用棉子糖（SRd）-Ura培养基制备SC，将6.7g酵母氮碱与硫酸铵溶解在795mL的dH2O.高压灭菌器中。使用前加入 100 mL 20% 棉子糖、5 mL 20% 葡萄糖和 100 mL 10x -Ura 脱落剂。
- 要制作SD-Ura琼脂培养基，将6.7g酵母氮碱与不含氨基酸的硫酸铵和20g琼脂溶解在800mL的dH2O.高压灭菌器中，体积超过2L.加入100mL的20%葡萄糖和100mL的10x -Ura脱落。搅拌均匀，倒在培养皿上。储存在4°C。
- 为了用半乳糖（SG）-Ura琼脂培养基制备SC，将6.7g酵母氮碱与不含氨基酸的硫酸铵和20g琼脂溶解在800mL的dH2O.高压灭菌器中体积超过2L的烧瓶中加入100mL的20%半乳糖和100mL的10x -Ura脱落。搅拌均匀，倒在培养皿上。储存在4°C。
- 用于标清介质的库存解决方案
- 要制备 20% 的碳源（葡萄糖、半乳糖和棉子糖），请将 100 g 葡萄糖、半乳糖或棉子糖溶解在 dH2O 中，使最终体积为 500 mL。高压灭菌并储存在室温下。
- 要制作不含尿嘧啶的 10x 酵母合成脱落培养基补充剂（10x-Ura 脱落），将 19.2 g “不含尿嘧啶的酵母合成脱落培养基补充剂”溶解在 dH2O 中以制成 1 L 的最终体积。 高压灭菌器并储存在室温中。
注意：为了制备含有琼脂的培养基，在倒入培养皿之前，向烧瓶中加入磁力搅拌棒以充分混合所有溶液。
2. 酵母转化
注意：pRS426质粒用于克隆 α-突触核蛋白 基因，并包含 URA3 基因作为可选标记。α-突触核蛋白的家族性PD相关变异具有严重的疾病表型（例如细胞毒性）。这些变异也用于监测它们的细胞毒性和聚集灶的形成。在所有实验中使用相同的酵母转化体菌落以获得一致的结果。
- 对于酵母表达质粒的转化，使用空载体（pRS426）作为对照，并α含突触核蛋白的质粒。参考标准乙酸锂（LiAc）方法11，制备六个感受态细胞和0.5μg每个质粒，并进行转化。
- 要选择含有质粒的酵母转化体，请使用不含尿嘧啶（SD-Ura）的合成定义培养基（SD培养基），并将板在30°C孵育2-3天。
- 将三个单菌落贴在SD-Ura琼脂平板上，以选择含有质粒的细胞以进行进一步实验。
注意：为了产生准确可靠的结果，我们检查了每种菌株至少三个生物学重复。
3. 点样测定
注意：已知GFP标记的α-突触核蛋白在高拷贝数质粒中的表达与酵母10中的细胞毒性有关。
- 将每个菌株的三个贴片酵母转化体接种到 3 mL SRd-Ura 中，用于用 2% 棉子糖选择性生长含有质粒的酵母，以抑制 GAL1 启动子和 0.1% 葡萄糖下α-突触核蛋白的诱导。在30°C下以200rpm搅拌孵育细胞培养物。
注意：用不同的菌落重复所有实验很重要。从三个以上的独立菌落获得相同的结果意味着结果是可靠的。 - 第二天，将过夜培养的细胞接种到3mL新鲜SRd-Ura中至OD600 为0.2，并在30°C下以200rpm搅拌孵育6小时。
- 当OD600 达到0.6-0.8时，将细胞稀释在96孔板中以进行点样测定，如下所示。
- 测量所有样品的OD 600，并在96孔板的泳道1中用无菌dH2O（混合体积为100μL）将样品稀释至OD600为0.5，以平衡每个培养物中的细胞数。
- 通过向接下来的五个泳道中加入 160 μL 无菌 dH2O 对酵母细胞进行五倍连续稀释。连续稀释每个泳道中的细胞时，确保总体积为 40 μL。
注意：低稀释因子会在样品之间产生较大的差异。在进行连续稀释时，需要足够的移液以确保均匀混合。每个稀释点都应更换移液器吸头。否则，附着在尖端表面的细胞可能会转移到下一个孔并影响细胞数量。
- 使用多通道移液器从每个孔转移 10 μL，以在 SD-Ura 琼脂平板上发现样品以进行对照，并使用 SG-Ura 琼脂平板监测毒性。
注意：应干燥板，直到斑点样品完全吸收到板上。 - 将斑点板在30°C下倒置孵育4天。
- 每24小时拍摄一次板的图像，直到第4天，然后通过比较肉眼发现的菌株之间的生长差异来分析数据。计数稀释度最高的样品中的单个菌落，计算每种菌株的原始培养物中活细胞的数量，或比较单个菌落的大小。
4. 使用酶标仪测量酵母生长
- 将每个菌株的三个修补的酵母转化体接种到3mL的SRd-Ura中，并在30°C下以200rpm搅拌孵育过夜。
注意：要了解表达α-突触核蛋白的人源化酵母菌株的每个菌落表型，请在所有实验中使用相同的转化体。 - 第二天，将过夜培养的细胞接种到96孔板中总共200μL新鲜SD-Ura和SG-Ura中。将包括细胞在内的最终体积调整至 200 μL，并将初始细胞 OD600 调整至 0.05。
- 调整微量滴定板中的程序设置如下：将目标温度设置为30°C，将振荡（线性）持续时间设置为890秒，将振荡（线性）幅度设置为5 mm，将间隔时间设置为00：15：00，并将测量设置为600nm处的吸光度。
- 将板孵育2-3天，以使所有菌株在酶标仪中到达固定相。
- 通过绘制增长曲线（例如，使用工作簿）来分析数据。通过平均三个生物学重复的吸光度值来获取数据点，并指示误差线。仅使用来自培养基的吸光度值作为对照，并从培养细胞的值中减去该值（可选）。
5. 荧光显微镜
- 将修补的酵母转化体接种到3mL的SRd-Ura中，并在30°C下以200rpm搅拌培养过夜。
注意：要确定表型与细胞毒性和病灶形成的相关性，请使用相同的菌落进行实验。 - 第二天，将过夜培养的细胞重新接种到 3 mL 新鲜 SRd-Ura 中，OD600 为 0.003 。孵育培养物，直到OD600 在30°C下以200rpm（~18小时）搅拌达到0.2。
- 当OD 600达到0.2时，加入300μL的20%半乳糖，然后在30°C下以200rpm 搅拌再孵育6小时。
- 通过以800× g 离心5分钟收集细胞，并弃去上清液。
- 将细胞沉淀轻轻重悬于 30 μL 蒸馏水中。
- 将 5 μL 重悬的细胞加载到载玻片上。准备琼脂糖凝胶垫12 并将其放在加载的细胞上，使其均匀扩散。
- 使用明场和GFP荧光滤光片使用100倍物镜进行显微成像。
- 首先，使用明场使用浸油用100倍物镜聚焦细胞。使用屏幕捕获选项使用程序生成图像。
- 切换到GFP荧光滤光片。将图像曝光时间调整为 50 ms 到 300 ms 之间，通过平衡信噪比获得清晰的图像。使用程序截屏图像。
- 从多个点而不是一个点对多个单元格进行成像。
- 通过使用分析软件计数含有α-突触核蛋白聚集体病灶的细胞百分比来分析图像。观察可溶性GFP蛋白信号和病灶形成的GFP信号之间的差异，以及GFP与A30P变体形式的α-突触核蛋白的扩散。
注意：α-突触核蛋白的野生型、E46K 和 A53T 变体将观察到病灶形成。
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Representative Results
已知α-突触核蛋白的高表达与PD模型系统中的神经元细胞死亡和PD有关。本研究描述了三种监测α-突触核蛋白细胞毒性和酵母中聚集α-突触核蛋白病灶形成的方法。在这里，α-突触核蛋白在酵母中过表达，并检查了野生型α突触核蛋白和三种被称为PD家族突变体的α-突触核蛋白变体的表型（图1 和 材料表）。
pRS426载体中 GAL1 启动子下的α-突触核蛋白表达在含有半乳糖作为诱导剂的琼脂平板上显示出显着的生长迟缓（图2）。在液体培养物中也观察到α-突触核蛋白表达的生长差异（图3）。在两种培养条件下，野生型α-突触核蛋白和具有E46K或A53T突变的变体由于α-突触核蛋白毒性而显示出生长缺陷。然而，不形成聚集体的α-突触核蛋白A30P变体显示出无毒表型。
为了了解细胞毒性与α-突触核蛋白聚集之间的关系，需要一种监测酵母中α-突触核蛋白状态的方法。α-突触核蛋白在C末端被GFP蛋白标记，通过使用荧光显微镜检测GFP信号来监测活酵母细胞中α-突触核蛋白的状态。表现出严重细胞毒性的菌株显示出α-突触核蛋白聚集体的病灶，但在A30P变体中，毒性较小的α-突触核蛋白形式扩散到整个细胞中（图4）。
图1：本研究中使用的α-突触核蛋白结构域和构建体 。 （A）人α突触核蛋白的结构与三个不同的结构域 - N端结构域，NAC结构域和C端结构域。氨基酸残基在底部表示。橙色线表示突变位点。（B）本研究中使用的重组质粒构建体。使用pRS426质粒作为骨架。α-突触核蛋白在C末端与GFP标签融合，其表达由 GAL1 启动子控制。缩写：NAC = 非淀粉样蛋白β成分;GFP = 绿色荧光蛋白。 请点击此处查看此图的大图。
图2：由于酵母中高拷贝数质粒的表达，琼脂上α-突触核蛋白的细胞毒性。 在含有2%葡萄糖或2%半乳糖的选择性酵母培养基上以五倍稀释度点样在pRS426质粒中表达 GAL1驱动的α-突触核蛋白-GFP变体的酵母细胞。将细胞在30°C下孵育3天，并对平板拍照。缩写：GFP = 绿色荧光蛋白;EV = 空向量;WT = 野生型;α-合成 = α-突触核蛋白。 请点击此处查看此图的大图。
图3：由于酵母中高拷贝数质粒的表达，液体培养基中α-突触核蛋白的细胞毒性。 将表达 GAL1驱动的α-突触核蛋白-GFP变体的酵母细胞在30°C的96孔板中的液体培养基中培养2天，并使用酶标仪监测生长。缩写：GFP = 绿色荧光蛋白;EV = 空向量;WT = 野生型;α-合成 = α-突触核蛋白。 请点击此处查看此图的大图。
图4：通过荧光显微镜分析表达α-突触核蛋白-GFP的酵母细胞 。 通过加入半乳糖并孵育6小时诱导α-突触核蛋白-GFP变体。α-突触核蛋白-GFP的确认是通过荧光显微镜完成的。比例尺 = 10 μm。缩写：GFP = 绿色荧光蛋白;EV = 空向量;WT = 野生型;α-合成 = α-突触核蛋白。 请点击此处查看此图的大图。
图5：使用人源酵母测量α-突触核蛋白的细胞毒性和聚集体形成的方法摘要。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
鉴于人类各种细胞系统的复杂性，使用酵母作为研究人类神经退行性疾病的模型是有利的。虽然使用酵母研究人脑的复杂细胞相互作用几乎是不可能的，但从单细胞的角度来看，酵母细胞在基因组序列同源性和基本的真核细胞过程方面与人类细胞具有高度的相似性8，13。此外，鉴于遗传操作的便利性，酵母可以促进复杂和苛刻的人类系统的研究。因此，酵母被广泛用作了解真核细胞过程和各种疾病发病机制的模型系统14，15，16。特别是，淀粉样蛋白（包括α-突触核蛋白17）的机中、体外和体内聚集特性之间存在差异。考虑到细胞中蛋白质行为的复杂性和不可预测性，研究体内蛋白质特性非常重要。因此，要了解具有α-突触核蛋白的细胞中发生了什么，有必要在体内条件下对其进行研究，酵母被认为是一种有用且强大的模型系统。
在这项研究中，使用2微米质粒分析了酵母中α-突触核蛋白在高度过表达条件下的特性。α-突触核蛋白水平由可诱导的 GAL1 启动子控制。当半乳糖作为营养素可用时，该启动子被激活，因此，该系统使我们能够研究源自特定水平的α-突触核蛋白表达的表型。除A30P外，野生型和α-突触核蛋白变体的过表达在点样测定以及生长曲线分析中引起毒性。使用荧光显微镜检查这些野生型和α-突触核蛋白变体，以监测细胞中α-突触核蛋白的蛋白质聚集体。从这些实验中，在α-突触核蛋白野生型和表现出细胞毒性的变体中观察到源自α-突触核蛋白聚集的病灶的形成。这些结果证实，由错误折叠的α-突触核蛋白聚集引起的细胞毒性和病灶形成与神经元细胞中PD的代表表型之一有关18，19。
重要的是将转化体孵育3天，并选择大的红色菌落进行进一步的实验。W303a菌株具有腺嘌呤突变，使细胞变红20。因此，选择白色菌落会导致使用错误的污染物。通过添加半乳糖选择合适的细胞阶段来诱导α-突触核蛋白对于观察可重复的表型很重要。为了测试特定蛋白质对α-突触核蛋白细胞毒性的影响，其他蛋白质可以通过共转化共表达。然而，必须避免使用带有Ura标记物的质粒，因为α-突触核蛋白质粒由Ura维持。
该方法不仅限于研究α-突触核蛋白本身的细胞特征，并且可以成为验证可能影响α-突触核蛋白聚集的候选基因的有用工具。有趣的是，最近报道了各种细菌蛋白（例如伴侣蛋白和curli）在体外影响α-突触核蛋白的形成21，22。候选基因对α-突触核蛋白衍生毒性或聚集体形成的影响可以通过共表达来监测。例如，由URA3标记基因维持的α突触核蛋白在细胞中与来自pRS425质粒的候选基因共表达，该候选基因含有半乳糖诱导的启动子和LEU2标记物。此外，该系统可用于使用酵母23中的基因缺失或过表达文库以及化学文库进行遗传筛选。然而，在旨在揭示遗传相互作用的全基因组筛选测定中，在转化效率方面，与质粒中其他蛋白质的共过表达并不容易实现。在这种情况下，最好在基因组中以多个拷贝表达α-突触核蛋白以操纵毒性形式20。总之，该酵母模型系统和协议为了解α-突触核蛋白的生理学和评估具有调节α-突触核蛋白毒性和聚集的潜在能力的基因提供了一个简单而全面的平台（图5）。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
我们感谢James Bardwell和Tiago F. Outeiro分享含有α-突触核蛋白的质粒。李昌汉获得了韩国政府（MSIT）资助的韩国国家研究基金会（NRF）（赠款2021R1C1C1C1011690），教育部资助的NRF基础科学研究计划（赠款2021R1A6A1A1A10044950）和亚洲大学的新教师研究基金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well plate | SPL | 30096 | |
| Agarose | TAESHIN | 0158 | |
| Bacto Agar | BD Difco | 214010 | |
| Breathe-easy | diversified biotech | BEM-1 | Gas permeable sealing membrane for microtiter plates |
| cover glasses | Marienfeld | 24 x 60 mm | |
| Culture tube | SPL | 40014 | |
| Cuvette | ratiolab | 2712120 | |
| D-(+)-Galactose | sigma | G0625 | |
| D-(+)-Glucose | sigma | G8270 | |
| D-(+)-Raffinose pentahydrate | Daejung | 6638-4105 | |
| Incubator (shaking) | Labtron | model: SHI1 | |
| Incubator (static) | Vision scientific | model: VS-1203PV-O | |
| LiAc | sigma | L6883 | |
| Microplate reader | Tecan | 30050303 01 | Model: Infinite 200 pro |
| multichannel pipette 20-200 µL | gilson | FA10011 | |
| multichannel pipette 2-20 µL | gilson | FA10009 | |
| Olympus microscope | Olympus | IX-53 | |
| PEG | sigma | P4338 | average mol wt 3,350 |
| Petridish | SPL | 10090 | |
| pRS426 | Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene. 110 (1), 119-122 (1992). | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A30P | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A53T | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein E46K | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein WT | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| Reservoir | SPL | 23050 | |
| Spectrophotometer | eppendorf | 6131 05560 | |
| W303a | Present from James Bardwell | ||
| Yeast nitrogen base w/o amino acids | Difco | 291940 | |
| Yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil | sigma | Y1501 | |
| YPD | Condalab | 1547.00 |
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