Summary
מודל פיזיולוגי in vivo של α-סינוקלאין נדרש כדי לחקור ולהבין את הפתוגנזה של מחלת פרקינסון. אנו מתארים שיטה לניטור ציטוטוקסיות והיווצרות אגרגטים של α-סינוקלאין באמצעות מודל שמרים אנושי.
Abstract
מחלת פרקינסון היא ההפרעה הנוירודגנרטיבית השנייה בשכיחותה ומאופיינת במוות תאי מתקדם הנגרם על ידי היווצרות גופי לוי המכילים α-סינוקלאין מקופלים ומצטברים. α-סינוקלאין הוא חלבון קדם-סינפטי בשפע המווסת את הסחר בשלפוחית הסינפטית, אך הצטברות התכלילים החלבניים שלו גורמת לרעילות עצבית. מחקרים אחרונים גילו כי גורמים גנטיים שונים, כולל מלווים חיידקיים, עשויים להפחית את היווצרותם של אגרגטים α-סינוקלאין במבחנה. עם זאת, חשוב גם לעקוב אחר אפקט אנטי צבירה בתא כדי ליישם את זה כטיפול פוטנציאלי עבור החולים. זה יהיה אידיאלי להשתמש בתאים עצביים, אבל תאים אלה קשה לטפל ולוקח הרבה זמן להציג את הפנוטיפ נגד צבירה. לכן, נדרש כלי in vivo מהיר ויעיל להערכה נוספת של פעילות אנטי-צבירה in vivo . השיטה המתוארת כאן שימשה לניטור וניתוח הפנוטיפ האנטי-צבירה בשמרים האנושיים Saccharomyces cerevisiae, שביטאו α-סינוקלאין אנושיים. פרוטוקול זה מדגים כלי in vivo שיכולים לשמש לניטור רעילות תאית הנגרמת על-ידי α-סינוקלאין, כמו גם להיווצרות אגרגטים α-סינוקלאין בתאים.
Introduction
מחלת פרקינסון (PD) היא בעיה רצינית עבור חברות מזדקנות ברחבי העולם. הצבירה של α-סינוקלאין קשורה קשר הדוק למחלת פרקינסון, ואגרגטים חלבוניים של α-סינוקלאין נמצאים בשימוש נרחב כסמן ביולוגי מולקולרי לאבחון המחלה1. α-סינוקלאין הוא חלבון חומצי קטן (140 חומצות אמינו באורך) בעל שלושה תחומים, כלומר סליל α קושר שומנים N, התחום המרכזי קושר עמילואיד (NAC) והזנב החומצי C-terminal2. קיפול שגוי של α-סינוקלאין יכול להתרחש באופן ספונטני ובסופו של דבר מוביל להיווצרות של אגרגטים עמילואידים הנקראים גופי לוי3. α-סינוקלאין עשוי לתרום לפתוגנזה של מחלת פרקינסון במספר דרכים. באופן כללי, הוא חשב כי צורות אוליגומריות חריגות ומסיסות הנקראות פרוטופיברילים הן מינים רעילים הגורמים למוות של תאי עצב על ידי השפעה על מטרות תאיות שונות, כולל תפקוד סינפטי3.
המודלים הביולוגיים המשמשים לחקר מחלות נוירודגנרטיביות חייבים להיות רלוונטיים לבני אדם ביחס לגנום ולביולוגיה התאית שלהם. המודלים הטובים ביותר יהיו קווי תאים עצביים אנושיים. עם זאת, קווי תאים אלה קשורים למספר בעיות טכניות, כגון קשיים בתחזוקת תרביות, יעילות נמוכה של טרנספקציה והוצאות גבוהות4. מסיבות אלה נדרש כלי קל ואמין להאצת ההתקדמות בתחום מחקר זה. חשוב לציין, הכלי צריך להיות קל לשימוש לניתוח הנתונים שנאספו. מנקודות מבט אלה, אורגניזמי מודל שונים היו בשימוש נרחב, כולל דרוזופילה, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, שמרים ומכרסמים5. ביניהם, שמרים הוא אורגניזם המודל הטוב ביותר כי מניפולציה גנטית היא קלה, וזה זול יותר מאשר אורגניזמים מודל אחרים. והכי חשוב, לשמרים יש קווי דמיון גבוהים לתאים אנושיים, כגון 60% הומולוגיה של רצף לאורתולוגים אנושיים ו-25% הומולוגיה קרובה עם גנים הקשורים למחלות אנושיות6, והם גם חולקים ביולוגיה בסיסית של התא האאוקריוטי. שמרים מכילים חלבונים רבים בעלי רצפים דומים ותפקודים מקבילים לאלה שבתאים אנושיים7. ואכן, שמרים המבטאים גנים אנושיים נמצאים בשימוש נרחב כמערכת מודל להבהרת תהליכים תאיים8. זן שמרים זה נקרא שמרים אנושיים והוא כלי שימושי לחקר תפקודם של גנים אנושיים9. לשמרים אנושיים יש יתרון בחקר אינטראקציות גנטיות מכיוון שמניפולציה גנטית מבוססת היטב בשמרים.
במחקר זה השתמשנו בשמרים Saccharomyces cerevisiae כאורגניזם מודל לחקר הפתוגנזה של מחלת פרקינסון, במיוחד לחקר היווצרות אגרגטים α-סינוקלאין וציטוטוקסיות10. לביטוי של α-סינוקלאין בשמרים הניצנים, זן W303a שימש לטרנספורמציה עם קידוד פלסמידים עבור גרסאות PD מסוג בר ומשפחתיות של α-סינוקלאין. מכיוון שלזן W303a יש מוטציה אוקסוטרופית ב-URA3, הוא ישים לבחירת תאים המכילים פלסמידים עם URA3. הביטוי של α-סינוקלאין המקודד בפלסמיד מוסדר תחת מקדם GAL1. לפיכך, ניתן לשלוט ברמת הביטוי של α-סינוקלאין. בנוסף, היתוך של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) באזור C-terminal של α-סינוקלאין מאפשר ניטור של היווצרות מוקדי α-סינוקלאין. כדי להבין את המאפיינים של הווריאנטים המשפחתיים הקשורים ל-PD של α-סינוקלאין, ביטאנו את הווריאנטים האלה גם בשמרים ובחנו את ההשפעות התאיות שלהם. מערכת זו היא כלי פשוט לסינון תרכובות או גנים המציגים תפקידי הגנה מפני ציטוטוקסיות של α-סינוקלאין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת מדיה ופתרונות
- היערכות למדיה
- כדי להכין מדיום YPD, יש להמיס 50 גרם של אבקת YPD ב-dH2O כדי ליצור נפח סופי של 1 ליטר. יש לאחסן בטמפרטורת החדר (RT).
- כדי להפוך את האגר של YPD לבינוני, יש להמיס 50 גרם אבקת YPD ו-20 גרם אגר ב-1 ליטר של dH2O. Autoclave לעיקור. לאחר שהתקרר, יוצקים על צלחות פטרי. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
- כדי ליצור SC עם רפינוז (SRd)-Ura בינוני, להמיס 6.7 גרם של בסיס חנקן שמרים עם אמוניום סולפט וללא חומצות אמינו ב 795 מ"ל של dH2O. Autoclave לעיקור. לפני השימוש יש להוסיף 100 מ"ל של 20% רפינוז, 5 מ"ל של 20% גלוקוז ו-100 מ"ל של 10x -Ura לפני השימוש.
- כדי להפוך את SD-Ura אגר למדיום, להמיס 6.7 גרם של בסיס חנקן שמרים עם אמוניום גופרתי וללא חומצות אמינו ו 20 גרם של אגר ב 800 מ"ל של dH 2 O. Autoclave בבקבוק עם נפח מעל2L. להוסיף 100 מ"ל של 20% גלוקוז ו 100 מ"ל של 10x -Ura נשירה. מערבבים היטב ויוצקים על צלחות פטרי. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
- כדי ליצור SC עם מדיום גלקטוז (SG)-Ura agar, יש להמיס 6.7 גרם של בסיס חנקן שמרים עם אמוניום גופרתי וללא חומצות אמינו ו-20 גרם אגר ב-800 מ"ל של dH 2 O. Autoclave בבקבוק עם נפח מעל2L. הוסף 100 מ"ל של 20% גלקטוז ו-100 מ"ל של 10x -Ura נשירה. מערבבים היטב ויוצקים על צלחות פטרי. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
- מלאי פתרונות לשימוש עם מדיית SD
- כדי ליצור מקור פחמן של 20% (גלוקוז, גלקטוז ורפינוז), יש להמיס 100 גרם של גלוקוז, גלקטוז או רפינוז ב-dH2O כדי ליצור נפח סופי של 500 מ"ל. אוטוקלאב וחנות ב-RT.
- כדי להכין 10x שמרים סינתטיים שנשרו תוספים בינוניים ללא אורציל (נשירה של 10x-Ura), יש להמיס 19.2 גרם של "שמרים סינתטיים שנשרים מתוספי תזונה בינוניים ללא אורציל" ב-dH2O כדי ליצור נפח סופי של 1 ל' אוטוקלאב ולאחסן ב-RT.
הערה: להכנת אגר בינוני, הוסיפו לבקבוקון מוט ערבוב מגנטי כדי לערבב את כל התמיסות היטב לפני שאתם מוזגים על צלחות פטרי.
2. טרנספורמציה של שמרים
הערה: פלסמיד pRS426 שימש לשכפול הגן α-סינוקלאין והכיל את הגן URA3 כסמן הניתן לבחירה. ישנן גרסאות משפחתיות הקשורות ל-PD של α-סינוקלאין שיש להן פנוטיפים של מחלות קשות (למשל, ציטוטוקסיות). גרסאות אלה שימשו כאן גם כדי לעקוב אחר הציטוטוקסיות שלהם והיווצרות מוקדים מצטברים. השתמש באותה מושבה של טרנספורמנטים של שמרים עבור כל הניסויים כדי לקבל תוצאות עקביות.
- לטרנספורמציה של פלסמידי ביטוי השמרים, השתמש בווקטור ריק (pRS426) כבקרה ופלסמידים המכילים α סינוקלאין. בהתייחס לשיטת ליתיום אצטט סטנדרטית (LiAc)11, הכינו שישה תאים מוכשרים ו-0.5 מיקרוגרם מכל פלסמיד, ובצעו את הטרנספורמציה.
- כדי לבחור עבור טרנספורמנטים של שמרים המכילים פלסמידים, השתמש במדיום המוגדר הסינתטי (מדיום SD) ללא אורציל (SD-Ura), ודגר את הצלחות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 2-3 ימים.
- תיקון שלוש מושבות בודדות על צלחת אגר SD-Ura לבחירת תאים המכילים פלסמידים לניסויים נוספים.
הערה: כדי להפיק תוצאות מדויקות ואמינות, בחנו לפחות שלושה שכפולים ביולוגיים לכל זן.
3. בדיקת איתור
הערה: הביטוי של α-סינוקלאין המתויג כ-GFP בפלסמידים בעלי מספר עותקים גבוה ידוע כקשור לציטוטוקסיות בשמרים10.
- יש לחסן את שלושת הטרנספורמנטים המתוקנים של שמרים לכל זן ל-3 מ"ל של SRd-Ura לצמיחה סלקטיבית של שמרים המכילים את הפלסמידים עם 2% רפינוז לעיכוב השראת α-סינוקלאין תחת מקדם GAL1 ו-0.1% גלוקוז. לדגום את תרבית התאים ב-30 מעלות צלזיוס תחת תסיסה ב-200 סל"ד.
הערה: חשוב לחזור על כל הניסויים עם מושבות שונות. קבלת אותן תוצאות מיותר משלוש מושבות עצמאיות פירושה שהתוצאה אמינה. - למחרת, יש לחסן את התאים בתרבית לילה ל-3 מ"ל של SRd-Ura טריל-OD 600 של 0.2, ולדגירה במשך 6 שעות ב-30 מעלות צלזיוס תחת תסיסה ב-200 סל"ד.
- כאשר OD600 מגיע ל-0.6-0.8, דילל את התאים בלוחות 96-well לצורך בדיקת התצפית באופן הבא.
- מדוד את OD 600 של כל הדגימות, ודלל את הדגימות ל- OD 600 של 0.5 עם dH2O סטרילי (הנפח המעורב הוא100 μL) בנתיב 1 של צלחת 96 באר כדי להשוות את מספר התאים בכל תרבית.
- בצע דילול סדרתי של פי חמישה של תאי השמרים על ידי הוספת 160 μL של dH2O סטרילי לחמשת הנתיבים הבאים. ודא נפח כולל של 40 μL בעת דילול סדרתי של התאים בכל נתיב.
הערה: גורמי דילול נמוכים יכולים ליצור הבדלים גדולים יותר בין הדגימות. נדרש פיפטינג מספיק כדי להבטיח ערבוב אחיד בעת ביצוע דילולים סדרתיים. יש להחליף את קצה הפיפטה בכל נקודת דילול. אחרת, התאים המחוברים לפני השטח של הקצה יכולים להיות מועברים לבאר הבאה ולהשפיע על מספר התא.
- השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להעביר 10 μL מכל באר כדי לאתר את הדגימות על לוחות אגר SD-Ura עבור הבקרות ולוחות אגר SG-Ura כדי לנטר רעילות.
הערה: יש לייבש את הצלחות עד שהדגימות המנומרות נספגות במלואן על הצלחות. - לדגום את הלוחות המנומרים הפוך ב 30 מעלות צלזיוס במשך 4 ימים.
- צלם תמונות של הצלחות כל 24 שעות עד יום 4, ולאחר מכן נתח את הנתונים על ידי השוואת הבדלי הצמיחה בין זנים שזוהו על ידי העין. ספרו את המושבות הבודדות בדגימה המדוללת ביותר, חשבו את מספר התאים בני הקיימא בתרבית המקורית עבור כל זן, או השוו את גודל המושבות הבודדות.
4. מדידת צמיחת שמרים באמצעות קורא מיקרו-פלטות
- יש לחסן את שלושת הטרנספורמטורים של השמרים המתוקנים לכל זן ל-3 מ"ל של SRd-Ura, ולדגור בטמפרטורה של 30°C תחת תסיסה ב-200 סל"ד למשך הלילה.
הערה: כדי להבין כל פנוטיפ מושבה של זן השמרים האנושי המבטא α-סינוקלאין, השתמש באותם טרנספורמנטים עבור כל הניסויים. - למחרת, יש לחסן את התאים בתרבית לילה ל-200 מיקרו-ליטר של SD-Ura ו-SG-Ura טריים ב-96 צלחות באר. התאם את עוצמת הקול הסופית, כולל התאים, ל- 200 μL, וכוונן את OD600 של התא הראשוני ל- 0.05.
- התאם את הגדרות התוכנית בלוח המיקרוטיטר באופן הבא: הגדר את טמפרטורת היעד ל -30 ° צלזיוס, הגדר את משך הניעודה (ליניארי) ל -890 שניות, הגדר את משרעת הרעד (ליניארית) ל -5 מ"מ, הגדר את זמן המרווח ל- 00:15:00 והגדר את המדידה כספיגה ב- 600 ננומטר.
- דגירה של הצלחת במשך 2-3 ימים כדי שכל הזנים יגיעו לשלב הנייח בקורא מיקרו-לוחות.
- נתח את הנתונים על-ידי התוויית עקומת הצמיחה (לדוגמה, באמצעות חוברת עבודה). השג את נקודות הנתונים על ידי ממוצע ערכי הספיגה משלושת המשכפלים הביולוגיים, וציין את פסי השגיאה. השתמש בערך הספיגה ממדיה בלבד כפקד, והפחת זאת מהערכים מתאים בתרבית (אופציונלי).
5. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית
- לחסן את השמרים המתוקנים ל-3 מ"ל של SRd-Ura, ולתרבת אותם במשך הלילה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס תחת תסיסה ב-200 סל"ד.
הערה: כדי לקבוע את המתאם של הפנוטיפ עם ציטוטוקסיות והיווצרות מוקדים, השתמש באותן מושבות לניסוי. - למחרת, יש לחסן מחדש את התאים בתרבית לילה ל-3 מ"ל של SRd-Ura טרי ל-OD600 של 0.003 . לדגור את התרבות עד OD 600 מגיע 0.2 ב 30 מעלות צלזיוס תחת תסיסה ב200 סל"ד (~ 18 שעות).
- כאשר OD 600 של 0.2 מושגת, להוסיף 300 μL של 20% גלקטוז, ולאחר מכן דגירה במשך 6 שעות נוספות ב 30 °C תחת תסיסה ב200 סל"ד.
- לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 5 דקות, ולהשליך את supernatant.
- יש למרוח את כדור התא בעדינות ב-30 μL של מים מזוקקים.
- טען 5 μL של התאים המחיים על זכוכית שקופית. הכינו פד ג'ל אגרוז12 והניחו אותו על התאים הטעונים כדי לגרום לו להתפשט באופן שווה.
- בצע הדמיה מיקרוסקופית עם מטרה של פי 100 באמצעות מסנני שדה בהיר ו-GFP-פלואורסצנטי.
- ראשית, השתמש ב-brightfield כדי למקד את התא עם מטרה של פי 100 באמצעות שמן טבילה. השתמש באפשרות לכידת המסך ליצירת התמונות באמצעות התוכנית.
- עבור למסנן GFP-פלואורסצנציה. התאם את זמן החשיפה של התמונה ל-50 אלפיות השנייה עד 300 אלפיות השנייה כדי להשיג תמונה ברורה על-ידי איזון יחס האות לרעש. לכידת מסך את התמונה באמצעות התוכנית.
- צלם תאים רבים מנקודות מרובות ולא רק מנקודה אחת.
- נתח את התמונות על ידי ספירת אחוז התאים המכילים מוקדים של אגרגטים α-סינוקלאין באמצעות תוכנה אנליטית. שימו לב להבדלים בין אות החלבון המסיס של GFP לבין אות ה-GFP שנוצר על ידי מוקדים, כמו גם את הדיפוזיה של GFP עם הצורה של גרסת A30P של α-סינוקלאין.
הערה: היווצרות מוקדים תיצפה עם גרסאות מסוג בר, E46K ו-A53T של α-סינוקלאין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הביטוי הגבוה של α-סינוקלאין ידוע כקשור למוות תאי עצב ולפרקינסון במערכות מודל של מחלת פרקינסון. מחקר זה מתאר שלוש שיטות לניטור ציטוטוקסיות של α-סינוקלאין והיווצרות מוקדים של α-סינוקלאין מצטברים בשמרים. כאן, הסינוקלאין α התבטא יתר על המידה בשמרים, ונבחנו הפנוטיפים של α-סינוקלאין מסוג בר ושלוש גרסאות של α-סינוקלאין הידועות כמוטנטים משפחתיים של PD (איור 1 וטבלת החומרים).
הביטוי α-סינוקלאין תחת מקדם GAL1 בווקטור pRS426 הראה פיגור גדילה משמעותי על לוחית האגר המכילה גלקטוז כגורם משרה (איור 2). ההבדל בצמיחה בביטוי α-סינוקלאין נצפה גם בתרביות נוזליות (איור 3). בשני תנאי התרבית, α-סינוקלאין מסוג בר וריאנטים עם מוטציות E46K או A53T הראו פגמי גדילה עקב רעילות α-סינוקלאין. עם זאת, גרסת α-סינוקלאין A30P, שאינה יוצרת אגרגטים, הראתה פנוטיפ לא רעיל.
כדי להבין את הקשר בין ציטוטוקסיות לבין צבירה של α-סינוקלאין, יש צורך בשיטה לניטור מצב α-סינוקלאין בשמרים. הסינוקלאין α תויג על-ידי חלבון GFP ב-C-terminus כדי לנטר את המצב של α-סינוקלאין בתאי שמרים חיים על-ידי זיהוי אות ה-GFP באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. הזנים שהפגינו ציטוטוקסיות חמורה הראו מוקדים של אגרגטים α-סינוקלאין, אבל בגרסת A30P התפזרה צורה פחות רעילה של α-סינוקלאין בכל התאים (איור 4).
איור 1: תחומים ומבנים α-סינוקלאין ששימשו במחקר זה . (A) המבנה של α-סינוקלאין אנושיים עם שלושת התחומים הנפרדים - תחום N-terminal, תחום NAC ותחום מסוף C. שאריות חומצות האמינו מסומנות בתחתית. הקווים הכתומים מציינים את האתרים שעברו מוטציה. (B) מבני הפלסמיד הרקומביננטיים ששימשו במחקר זה. פלסמיד pRS426 שימש כעמוד שדרה. α-סינוקלאין התמזג עם תג GFP במסוף C, והביטוי שלו נשלט על ידי מקדם GAL1 . קיצורים: NAC = רכיב שאינו עמילואיד-β; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: ציטוטוקסיות של α-סינוקלאין על אגר עקב ביטוי של פלסמידים בעלי מספר עותקים גבוה בשמרים. תאי שמרים המבטאים גרסאות α-סינוקלאין-GFP מונעות GAL1 בפלסמידים pRS426 זוהו בדילולים של פי חמישה על מדיום שמרים סלקטיבי המכיל 2% גלוקוז או 2% גלקטוז. התאים דוגרו במשך 3 ימים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס, והלוחות צולמו. קיצורים: GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; EV = וקטור ריק; WT = סוג פראי; α-Syn = α-סינוקלאין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: ציטוטוקסיות של α-סינוקלאין במדיה נוזלית עקב ביטוי של פלסמידים בעלי מספר עותקים גבוה בשמרים. תאי שמרים המבטאים גרסאות α-סינוקלאין-GFP מונעות GAL1 גודלו בתרבית במדיה נוזלית בצלחת של 96 מעלות צלזיוס בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך יומיים, והגידול היה מנוטר באמצעות קורא microplate. קיצורים: GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; EV = וקטור ריק; WT = סוג פראי; α-Syn = α-סינוקלאין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: ניתוח של תאי שמרים המבטאים α-סינוקלאין-GFP על-ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. גרסאות α-סינוקלאין-GFP הושרו על-ידי הוספת גלקטוז ודגירה במשך 6 שעות. האישור של α-סינוקלאין-GFP נעשה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. קיצורים: GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; EV = וקטור ריק; WT = סוג פראי; α-Syn = α-סינוקלאין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: סיכום שיטה זו למדידת ציטוטוקסיות והיווצרות אגרגטים של α-סינוקלאין באמצעות שמרים אנושיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בהתחשב במורכבות של מערכות תאיות שונות בבני אדם, כדאי להשתמש בשמרים כמודל לחקר מחלות נוירודגנרטיביות אנושיות. למרות שכמעט בלתי אפשרי לחקור את האינטראקציות התאיות המורכבות של המוח האנושי באמצעות שמרים, מנקודת מבט של תא בודד, לתאי שמרים יש רמה גבוהה של דמיון לתאים אנושיים במונחים של הומולוגיה של רצף גנומי ותהליכים תאיים אאוקריוטים בסיסיים 8,13. יתר על כן, בהתחשב בקלות של מניפולציה גנטית, שמרים יכולים להקל על המחקר של מערכות אנושיות מורכבות ותובעניות. לכן, שמרים כבר בשימוש נרחב כמערכת מודל להבנת תהליכים תאיים אאוקריוטים ואת הפתוגנזה של מחלות שונות14,15,16. בפרט, ישנם פערים בין תכונות הצבירה in silico, in vitro ו- in vivo של חלבונים עמילואידוגניים, כולל α-סינוקלאין17. אם ניקח בחשבון את המורכבות והבלתי צפויות של התנהגות החלבון בתא, חשוב לחקור את תכונות החלבון in vivo. לכן, כדי להבין מה קורה בתא עם α-סינוקלאין, יש צורך לחקור אותו בתנאי in vivo, ושמרים נחשבים למערכת מודל שימושית וחזקה לכך.
במחקר זה נותחו התכונות של α-סינוקלאין בשמרים במצב של ביטוי יתר גבוה באמצעות פלסמיד של 2 מיקרון. רמת הסינוקלאין α נשלטה על ידי מקדם GAL1 בלתי ניתן להשראה. מקדם זה מופעל כאשר גלקטוז זמין כחומר מזין, ולכן, מערכת זו מאפשרת לנו לחקור פנוטיפים הנגזרים מרמות ספציפיות של ביטוי חלבון α-סינוקלאין. ביטוי היתר של גרסאות ה-wild-type וה-α-synuclein, למעט A30P, גרם לרעילות בבדיקת התצפית, כמו גם בניתוח עקומת הגדילה. גרסאות אלה מסוג בר ו-α-סינוקלאין נבדקו באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לנטר את אגרגטים החלבונים של α-סינוקלאין בתאים. מניסויים אלה נצפתה היווצרות מוקדים שמקורם בצבירת α-סינוקלאין בסוג הבר α-סינוקלאין ובווריאנטים המציגים ציטוטוקסיות. תוצאות אלה מאשרות כי הרעילות התאית והיווצרות המוקדים הנובעים מצבירה שגויה של חלבון α-סינוקלאין קשורים לאחד הפנוטיפים המייצגים של מחלת פרקינסון בתאי עצב18,19.
חשוב לדגור על הטרנספורמטורים במשך 3 ימים ולבחור מושבות גדולות ואדמדמות לניסויים נוספים. לזן W303a יש מוטציה של אדנין, שגורמת לתא להפוך לאדום20. לכן, בחירה במושבה לבנה גורמת לעבודה עם המזהם הלא נכון. בחירת שלב התא המתאים לאינדוקציה של α-סינוקלאין על ידי הוספת גלקטוז חשובה על מנת לבחון פנוטיפ הניתן לשחזור. לבדיקת ההשפעה של חלבון מסוים על ציטוטוקסיות של α-סינוקלאין, חלבונים אחרים יכולים להתבטא במשותף על ידי טרנספורמציה משותפת. עם זאת, יש להימנע מפלסמידים עם סמני Ura מכיוון שהפלסמיד α-סינוקלאין נשמר עם אורה.
שיטה זו אינה מוגבלת לחקר המאפיינים התאיים של α-סינוקלאין עצמו ויכולה להיות כלי שימושי לאימות גנים מועמדים שעשויים להשפיע על צבירת α-סינוקלאין. באופן מעניין, לאחרונה דווח כי חלבונים חיידקיים שונים (למשל, מלווים וסלסולים) משפיעים על היווצרות α-סינוקלאין במבחנה21,22. ההשפעה של גן מועמד על רעילות שמקורה ב-α-סינוקלאין או על היווצרות אגרגטים ניתנת לניטור על ידי ביטוי משותף. לדוגמה, α-סינוקלאין שהוחזק על ידי גן הסמן URA3 בא לידי ביטוי משותף בתאים עם גן מועמד מהפלסמיד pRS425, שהכיל מקדם גלקטוז הניתן להשרה, וסמן LEU2. יתר על כן, מערכת זו יכולה לשמש לצורך בדיקה גנטית באמצעות ספריות מחיקת גנים או ביטוי יתר, כמו גם ספריות כימיות, בשמרים23. עם זאת, בבדיקות סקר כלל-גנומיות שמטרתן לחשוף אינטראקציות גנטיות, ביטוי יתר משותף עם חלבונים אחרים בפלסמיד לא יהיה קל להשגה במונחים של יעילות טרנספורמציה. במצבים כאלה, ייתכן שעדיף לבטא α-סינוקלאין בגנום במספר עותקים כדי לתפעל את הצורה הרעילה20. לסיכום, המערכת והפרוטוקול של מודל השמרים האלה מספקים פלטפורמה פשוטה ומקיפה להבנת הפיזיולוגיה של α-סינוקלאין ולהערכת גנים עם היכולת הפוטנציאלית לווסת רעילות וצבירה של α-סינוקלאין (איור 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לג'יימס בארדוול וטיאגו פ. אוטיירו על שחלקו בחביבות את הפלסמידים המכילים α-סינוקלאין. צ'אנגהאן לי קיבל מימון מקרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) במימון ממשלת קוריאה (MSIT) (מענק 2021R1C1C1011690), תוכנית המחקר המדעית הבסיסית באמצעות NRF במימון משרד החינוך (מענק 2021R1A6A1A10044950), וקרן המחקר החדשה של אוניברסיטת אג'ו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well plate | SPL | 30096 | |
| Agarose | TAESHIN | 0158 | |
| Bacto Agar | BD Difco | 214010 | |
| Breathe-easy | diversified biotech | BEM-1 | Gas permeable sealing membrane for microtiter plates |
| cover glasses | Marienfeld | 24 x 60 mm | |
| Culture tube | SPL | 40014 | |
| Cuvette | ratiolab | 2712120 | |
| D-(+)-Galactose | sigma | G0625 | |
| D-(+)-Glucose | sigma | G8270 | |
| D-(+)-Raffinose pentahydrate | Daejung | 6638-4105 | |
| Incubator (shaking) | Labtron | model: SHI1 | |
| Incubator (static) | Vision scientific | model: VS-1203PV-O | |
| LiAc | sigma | L6883 | |
| Microplate reader | Tecan | 30050303 01 | Model: Infinite 200 pro |
| multichannel pipette 20-200 µL | gilson | FA10011 | |
| multichannel pipette 2-20 µL | gilson | FA10009 | |
| Olympus microscope | Olympus | IX-53 | |
| PEG | sigma | P4338 | average mol wt 3,350 |
| Petridish | SPL | 10090 | |
| pRS426 | Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene. 110 (1), 119-122 (1992). | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A30P | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A53T | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein E46K | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein WT | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| Reservoir | SPL | 23050 | |
| Spectrophotometer | eppendorf | 6131 05560 | |
| W303a | Present from James Bardwell | ||
| Yeast nitrogen base w/o amino acids | Difco | 291940 | |
| Yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil | sigma | Y1501 | |
| YPD | Condalab | 1547.00 |
References
- Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: Why cook with baker's yeast. Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).
- Surguchov, A. Intracellular dynamics of synucleins: "Here, there and everywhere". International Review of Cell and Molecular Biology. 320, 103-169 (2015).
- Soto, C., Pritzkow, S. Protein misfolding, aggregation, and conformational strains in neurodegenerative diseases. Nature Neuroscience. 21 (10), 1332-1340 (2018).
- Gordon, J., Amini, S. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 2311, 1-8 (2021).
- Dawson, T. M., Golde, T. E., Lagier-Tourenne, C.
- Bassett, D. E., Boguski, M. S., Hieter, P. Yeast genes and human disease. Nature. 379 (6566), 589-590 (1996).
- Koteliansky, V., Glukhova, M., Bejanian, M., Surguchov, A., Smirnov, V. Isolation and characterization of actin-like protein from yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS Letters. 102 (1), 55-58 (1979).
- Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).
- Kachroo, A. H., Vandeloo, M., Greco, B. M., Abdullah, M. Humanized yeast to model human biology, disease and evolution. Disease Models & Mechanisms. 15 (6), (2022).
- Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).
- Dunham, M., Gartenberg, M., Brown, G. Methods in Yeast Genetics and Genomics. , Cold Spring Harbour Laboratory Press. Woodbury, New York. (2015).
- Skinner, S. O., Sepúlveda, L. A., Xu, H., Golding, I. Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization. Nature Protocols. 8 (6), 1100-1113 (2013).
- Tenreiro, S., Munder, M. C., Alberti, S., Outeiro, T. F. Harnessing the power of yeast to unravel the molecular basis of neurodegeneration. Journal of Neurochemistry. 127 (4), 438-452 (2013).
- Nielsen, J. Yeast systems biology: Model organism and cell factory. Biotechnology Journal. 14 (9), 1800421 (2019).
- Eleutherio, E., et al. Oxidative stress and aging: learning from yeast lessons. Fungal Biology. 122 (6), 514-525 (2018).
- Rencus-Lazar, S., DeRowe, Y., Adsi, H., Gazit, E., Laor, D. Yeast models for the study of amyloid-associated disorders and development of future therapy. Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 15 (2019).
- Franco, R., Rivas-Santisteban, R., Navarro, G., Pinna, A., Reyes-Resina, I. Genes implicated in familial Parkinson's disease provide a dual picture of nigral dopaminergic neurodegeneration with mitochondria taking center stage. International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4643 (2021).
- Wan, O. W., Chung, K. K. The role of alpha-synuclein oligomerization and aggregation in cellular and animal models of Parkinson's disease. PLoS One. 7 (6), 38545 (2012).
- Xu, L., Pu, J. Alpha-synuclein in Parkinson's disease: From pathogenetic dysfunction to potential clinical application. Parkinson's Disease. 2016, 1720621 (2016).
- Gitler, A. D., et al. The Parkinson's disease protein α-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).
- Sampson, T. R., et al. A gut bacterial amyloid promotes α-synuclein aggregation and motor impairment in mice. Elife. 9, 53111 (2020).
- Evans, M. L., et al. The bacterial curli system possesses a potent and selective inhibitor of amyloid formation. Molecular Cell. 57 (3), 445-455 (2015).
- Su, L. J., et al. Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models. Disease Models & Mechanisms. 3 (3-4), 194-208 (2010).
