Summary
Un modèle physiologique in vivo de la α-synucléine est nécessaire pour étudier et comprendre la pathogenèse de la maladie de Parkinson. Nous décrivons une méthode pour surveiller la cytotoxicité et la formation agrégée de α-synucléine à l’aide d’un modèle de levure humanisé.
Abstract
La maladie de Parkinson est la deuxième maladie neurodégénérative la plus fréquente et se caractérise par une mort cellulaire progressive causée par la formation de corps de Lewy contenant de la α-synucléine mal repliée et agrégée. α-synucléine est une protéine présynaptique abondante qui régule le trafic des vésicules synaptiques, mais l’accumulation de ses inclusions protéiques entraîne une neurotoxicité. Des études récentes ont révélé que divers facteurs génétiques, y compris les chaperons bactériens, pourraient réduire la formation d’agrégats de α-synucléine in vitro. Cependant, il est également important de surveiller l’effet anti-agrégation dans la cellule pour l’appliquer comme traitement potentiel pour les patients. Il serait idéal d’utiliser des cellules neuronales, mais ces cellules sont difficiles à manipuler et prennent beaucoup de temps à présenter le phénotype anti-agrégation. Par conséquent, un outil in vivo rapide et efficace est nécessaire pour une évaluation plus approfondie de l’activité anti-agrégation in vivo. La méthode décrite ici a été utilisée pour surveiller et analyser le phénotype anti-agrégation de la levure humanisée Saccharomyces cerevisiae, qui exprimait la α-synucléine humaine. Ce protocole démontre des outils in vivo qui pourraient être utilisés pour surveiller la toxicité cellulaire induite par la α-synucléine, ainsi que la formation d’agrégats de α-synucléine dans les cellules.
Introduction
La maladie de Parkinson (MP) est un problème grave pour les sociétés vieillissantes du monde entier. L’agrégation de la α-synucléine est étroitement associée à la MP, et les agrégats protéiques de α-synucléine sont largement utilisés comme biomarqueur moléculaire pour diagnostiquer la maladie1. α-synucléine est une petite protéine acide (140 acides aminés de longueur) avec trois domaines, à savoir la α-hélice de liaison lipidique N-terminale, le domaine central de liaison amyloïde (NAC) et la queue acide C-terminale2. Le mauvais repliement de la α-synucléine peut se produire spontanément et conduit éventuellement à la formation d’agrégats amyloïdes appelés corps de Lewy3. α-synucléine peut contribuer à la pathogenèse de la MP de plusieurs façons. En général, on pense que ses formes oligomères anormales et solubles appelées protofibrilles sont des espèces toxiques qui provoquent la mort des cellules neuronales en affectant diverses cibles cellulaires, y compris la fonction synaptique3.
Les modèles biologiques utilisés pour étudier les maladies neurodégénératives doivent être pertinents pour les humains en ce qui concerne leur génome et leur biologie cellulaire. Les meilleurs modèles seraient des lignées cellulaires neuronales humaines. Cependant, ces lignées cellulaires sont associées à plusieurs problèmes techniques, tels que des difficultés dans le maintien des cultures, une faible efficacité de la transfection et des dépenses élevées4. Pour ces raisons, un outil simple et fiable est nécessaire pour accélérer les progrès dans ce domaine de recherche. Il est important de noter que l’outil doit être facile à utiliser pour analyser les données collectées. De ce point de vue, divers organismes modèles ont été largement utilisés, notamment la drosophile, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, la levure et les rongeurs5. Parmi eux, la levure est le meilleur organisme modèle car la manipulation génétique est facile et moins chère que les autres organismes modèles. Plus important encore, la levure présente de grandes similitudes avec les cellules humaines, telles que 60% d’homologie de séquence avec les orthologues humains et 25% d’homologie étroite avec les gènes liés à la maladie humaine6, et elles partagent également la biologie fondamentale des cellules eucaryotes. La levure contient de nombreuses protéines avec des séquences similaires et des fonctions analogues à celles des cellules humaines7. En effet, la levure exprimant des gènes humains a été largement utilisée comme système modèle pour élucider les processus cellulaires8. Cette souche de levure est appelée levure humanisée et est un outil utile pour explorer la fonction des gènes humains9. La levure humanisée a le mérite d’étudier les interactions génétiques parce que la manipulation génétique est bien établie dans la levure.
Dans cette étude, nous avons utilisé la levure Saccharomyces cerevisiae comme organisme modèle pour étudier la pathogenèse de la MP, en particulier pour étudier la formation d’agrégats de α-synucléine et la cytotoxicité10. Pour l’expression de la α-synucléine dans la levure bourgeonnante, la souche W303a a été utilisée pour la transformation avec des plasmides codant pour les variantes de type sauvage et familiales associées à la de la α-synucléine. Comme la souche W303a a une mutation auxotrophe sur URA3, elle est applicable pour la sélection de cellules contenant des plasmides avec URA3. L’expression de la α-synucléine codée dans un plasmide est régulée par le promoteur GAL1. Ainsi, le niveau d’expression de la α-synucléine peut être contrôlé. De plus, la fusion de la protéine fluorescente verte (GFP) dans la région C-terminale de la α-synucléine permet de surveiller la formation de foyers de α-synucléine. Pour comprendre les caractéristiques des variantes familiales associées à la MP de la α-synucléine, nous avons également exprimé ces variantes chez la levure et examiné leurs effets cellulaires. Ce système est un outil simple pour le criblage de composés ou de gènes présentant des rôles protecteurs contre la cytotoxicité de la α-synucléine.
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Protocol
1. Préparation des supports et des solutions
- Préparation des médias
- Pour préparer le milieu YPD, dissoudre 50 g de poudre YPD dansdH2Opour obtenir un volume final de 1 L. Autoclave pour stérilisation. Conserver à température ambiante (RT).
- Pour fabriquer un milieu gélosé YPD, dissoudre 50 g de poudre YPD et 20 g de gélose dans 1 L dedH2O. Autoclave pour stérilisation. Après refroidissement, verser sur des boîtes de Petri. Conserver à 4 °C.
- Pour faire SC avec un milieu raffinose (SRd)-Ura, dissoudre 6,7 g de levure azotée base avec du sulfate d’ammonium et sans acides aminés dans 795 mL dedH2O. Autoclave pour stérilisation. Ajouter 100 mL de raffinose à 20 %, 5 mL de glucose à 20 % et 100 mL de goutte 10x -Ura avant utilisation.
- Pour fabriquer le milieu gélose SD-Ura, dissoudre 6,7 g de levure azotée base avec du sulfate d’ammonium et sans acides aminés et 20 g de gélose dans 800 mL dedH2O. Autoclave dans une fiole d’un volume supérieur à 2 L. Ajouter 100 mL de glucose à 20 % et 100 mL de goutte 10x -Ura. Bien mélanger et verser sur les boîtes de Petri. Conserver à 4 °C.
- Pour faire SC avec un milieu gélosé galactose (SG)-Ura, dissoudre 6,7 g de levure azotée base avec du sulfate d’ammonium et sans acides aminés et 20 g de gélose dans 800 mL dedH2O. Autoclave dans une fiole d’un volume supérieur à 2 L. Ajouter 100 mL de galactose à 20 % et 100 mL de goutte 10x -Ura. Bien mélanger et verser sur les boîtes de Petri. Conserver à 4 °C.
- Solutions de stock à utiliser avec les supports SD
- Pour obtenir une source de carbone à 20 % (glucose, galactose et raffinose), dissoudre 100 g de glucose, de galactose ou de raffinose dans du dH2O pour obtenir un volume final de 500 mL. Autoclave et stockage chez RT.
- Pour faire 10x suppléments de milieu de goutte synthétique de levure sans uracile (10x-Ura drop-out), dissoudre 19,2 g de « levure synthétique drop-out medium supplements sans uracile » dansdH2Opour faire un volume final de 1 L. Autoclave et conserver chez RT.
NOTE: Pour la préparation d’un milieu contenant de l’agar, ajouter une barre d’agitation magnétique dans la fiole pour bien mélanger toutes les solutions avant de les verser sur des boîtes de Pétri.
2. Transformation de la levure
REMARQUE: Le plasmide pRS426 a été utilisé pour cloner le gène de la α-synucléine et contenait le gène URA3 comme marqueur sélectionnable. Il existe des variantes familiales de la α-synucléine associées à la MP qui ont des phénotypes de maladie graves (p. ex. cytotoxicité). Ces variantes ont également été utilisées ici pour surveiller leur cytotoxicité et la formation de foyers agrégés. Utilisez la même colonie de transformants de levure pour toutes les expériences afin d’obtenir des résultats cohérents.
- Pour la transformation des plasmides d’expression de levure, utilisez un vecteur vide (pRS426) comme témoin et des plasmides contenant de la α-synucléine. En se référant à la méthode standard de l’acétate de lithium (LiAc)11, préparer six cellules compétentes et 0,5 μg de chaque plasmide, et effectuer la transformation.
- Pour sélectionner des transformants de levure contenant des plasmides, utilisez le milieu défini synthétique (milieu SD) sans uracile (SD-Ura) et incuber les plaques à 30 °C pendant 2-3 jours.
- Patcher trois colonies simples sur une plaque de gélose SD-Ura pour la sélection de cellules contenant des plasmides pour d’autres expériences.
REMARQUE : Pour générer des résultats précis et fiables, nous avons examiné au moins trois réplications biologiques par souche.
3. Dosage de repérage
REMARQUE : On sait que l’expression de la α-synucléine marquée GFP dans les plasmides à nombre élevé de copies est associée à la cytotoxicité chez la levure10.
- Inoculer les trois transformants de levure patchés par souche dans 3 mL de SRd-Ura pour la croissance sélective de levures contenant les plasmides avec 2% de raffinose pour l’inhibition de l’induction de la α-synucléine sous le promoteur GAL1 et 0,1% de glucose. Incuber la culture cellulaire à 30 °C sous agitation à 200 rpm.
NOTE: Il est important de répéter toutes les expériences avec différentes colonies. L’obtention des mêmes résultats de plus de trois colonies indépendantes signifie que le résultat est fiable. - Le lendemain, inoculer les cellules cultivées pendant la nuit dans 3 mL de SRd-Ura frais à une DO600 de 0,2 et incuber pendant 6 h à 30 °C sous agitation à 200 tr/min.
- Lorsque le OD600 atteint 0,6-0,8, diluer les cellules dans des plaques de 96 puits pour le test de repérage comme suit.
- Mesurer la DO 600 de tous les échantillons et diluer les échantillons à une DO 600 de 0,5 avec un dH2O stérile (le volume mélangé est de100 μL) dans la voie 1 d’une plaque de 96 puits pour égaliser le nombre de cellules dans chaque culture.
- Effectuer cinq dilutions en série des cellules de levure en ajoutant 160 μL dedH2Ostérile aux cinq voies suivantes. Assurer un volume total de 40 μL lors de la dilution en série des cellules dans chaque voie.
NOTE: De faibles facteurs de dilution peuvent produire des différences plus importantes entre les échantillons. Un pipetage suffisant est nécessaire pour assurer un mélange uniforme lors de l’exécution des dilutions en série. L’embout de la pipette doit être remplacé à chaque point de dilution. Sinon, les cellules attachées à la surface de la pointe pourraient être transférées au puits suivant et affecter le numéro de cellule.
- Utiliser une pipette multicanal pour transférer 10 μL de chaque puits afin de repérer les échantillons sur les plaques de gélose SD-Ura pour les témoins et les plaques de gélose SG-Ura pour surveiller la toxicité.
NOTE: Les plaques doivent être séchées jusqu’à ce que les échantillons tachetés soient complètement absorbés sur les plaques. - Incuber les plaques tachetées à l’envers à 30 °C pendant 4 jours.
- Prenez des images des plaques toutes les 24 heures jusqu’au jour 4, puis analysez les données en comparant les différences de croissance entre les souches repérées à l’œil. Compter les colonies individuelles dans l’échantillon le plus dilué, calculer le nombre de cellules viables dans la culture originale pour chaque souche ou comparer la taille des colonies individuelles.
4. Mesure de la croissance des levures à l’aide d’un lecteur de microplaques
- Inoculer les trois transformants de levure patchés par souche dans 3 mL de SRd-Ura, et incuber à 30 °C sous agitation à 200 rpm pendant la nuit.
NOTE: Pour comprendre chaque phénotype de colonie de la souche de levure humanisée exprimant la α-synucléine, utilisez les mêmes transformants pour toutes les expériences. - Le lendemain, inoculer les cellules cultivées pendant la nuit dans un total de 200 μL de SD-Ura et SG-Ura frais dans des plaques de 96 puits. Réglez le volume final, y compris les cellules, à 200 μL et réglez la cellule initiale OD600 à 0,05.
- Ajustez les paramètres du programme dans la plaque de microtitrage comme suit: réglez la température cible à 30 ° C, réglez la durée d’agitation (linéaire) sur 890 s, réglez l’amplitude d’agitation (linéaire) sur 5 mm, réglez le temps d’intervalle sur 00:15:00 et réglez la mesure comme absorbance à 600 nm.
- Incuber la plaque pendant 2-3 jours pour que toutes les souches atteignent la phase stationnaire dans un lecteur de microplaques.
- Analysez les données en traçant la courbe de croissance (p. ex., à l’aide de Workbook). Acquérir les points de données en faisant la moyenne des valeurs d’absorbance des trois réplicas biologiques et indiquer les barres d’erreur. Utilisez la valeur d’absorbance du milieu uniquement comme témoin et soustrayez-la des valeurs des cellules cultivées (facultatif).
5. Microscopie à fluorescence
- Inoculer les transformants de levure rapiécés en 3 mL de SRd-Ura, et les cultiver pendant la nuit à 30 °C sous agitation à 200 rpm.
NOTE: Pour déterminer la corrélation du phénotype avec la cytotoxicité et la formation de foyers, utilisez les mêmes colonies pour l’expérience. - Le lendemain, réinoculer les cellules cultivées pendant la nuit dans 3 mL de SRd-Ura frais à une DO600 de 0,003 . Incuber la culture jusqu’à ce que le DO600 atteigne 0,2 à 30 °C sous agitation à 200 tr/min (~18 h).
- Lorsqu’une DO 600 de 0,2 est atteinte, ajouter300 μL de galactose à 20 %, puis incuber pendant encore 6 h à 30 °C sous agitation à 200 tr/min.
- Recueillir les cellules par centrifugation à 800 x g pendant 5 min, et jeter le surnageant.
- Remettez délicatement en suspension la pastille cellulaire dans 30 μL d’eau distillée.
- Chargez 5 μL des cellules remises en suspension sur un verre coulissant. Préparez un tampon de gel d’agarose12 et placez-le sur les cellules chargées pour le faire répartir uniformément.
- Effectuez une imagerie microscopique avec un objectif 100x à l’aide de filtres à fond clair et de fluorescence GFP.
- Tout d’abord, utilisez le fond clair pour focaliser la cellule avec un objectif 100x en utilisant de l’huile d’immersion. Utilisez l’option de capture d’écran pour générer les images à l’aide du programme.
- Passez à un filtre à fluorescence GFP. Ajustez le temps d’exposition de l’image entre 50 ms et 300 ms pour obtenir une image claire en équilibrant le rapport signal/bruit. Capture d’écran de l’image à l’aide du programme.
- Imaginez plusieurs cellules à partir de plusieurs points plutôt qu’un seul.
- Analysez les images en comptant le pourcentage de cellules contenant des foyers d’agrégats de α-synucléine à l’aide d’un logiciel d’analyse. Observez les différences entre le signal de la protéine GFP soluble et le signal GFP formé par des foyers, ainsi que la diffusion de la GFP avec la variante A30P de la α-synucléine.
NOTE: La formation de foyers sera observée avec les variantes de type sauvage, E46K et A53T de la α-synucléine.
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Representative Results
La forte expression de la α-synucléine est connue pour être liée à la mort cellulaire neuronale et à la MP dans les systèmes modèles de MP. Cette étude décrit trois méthodes pour surveiller la cytotoxicité de la α-synucléine et la formation de foyers de α-synucléine agrégée dans la levure. Ici, la α-synucléine a été surexprimée dans la levure, et les phénotypes de la α-synucléine de type sauvage et de trois variantes de la α-synucléine connues sous le nom de mutants familiaux de la MP ont été examinés (Figure 1 et le Tableau des matériaux).
L’expression de α-synucléine sous le promoteur GAL1 dans le vecteur pRS426 a montré un retard de croissance significatif sur la plaque de gélose contenant du galactose comme inducteur (Figure 2). La différence de croissance par expression de α-synucléine a également été observée dans des cultures liquides (Figure 3). Dans les deux conditions de culture, la α-synucléine de type sauvage et les variantes présentant des mutations E46K ou A53T ont présenté des défauts de croissance dus à la toxicité de la α-synucléine. Cependant, la variante de la α-synucléine A30P, qui ne forme pas d’agrégats, a montré un phénotype non toxique.
Pour comprendre la relation entre la cytotoxicité et l’agrégation de la α-synucléine, une méthode de surveillance de l’état de la α-synucléine dans la levure est nécessaire. La α-synucléine a été marquée par une protéine GFP à l’extrémité C pour surveiller l’état de la α-synucléine dans les cellules de levure vivantes en détectant le signal GFP par microscopie à fluorescence. Les souches présentant une cytotoxicité sévère présentaient des foyers d’agrégats de α-synucléine, mais dans la variante A30P, une forme moins toxique de α-synucléine était diffusée dans les cellules (Figure 4).
Figure 1 : Domaines et constructions de la α-synucléine utilisés dans cette étude. (A) La structure de la α-synucléine humaine avec les trois domaines distincts - le domaine N-terminal, le domaine NAC et le domaine C-terminal. Les résidus d’acides aminés sont indiqués en bas. Les lignes orange indiquent les sites mutés. (B) Les constructions plasmidiques recombinantes utilisées dans cette étude. Le plasmide pRS426 a été utilisé comme épine dorsale. La α-synucléine a été fusionnée avec une étiquette GFP à l’extrémité C, et son expression a été contrôlée par le promoteur GAL1. Abréviations : NAC = composant non amyloïde-β; GFP = protéine fluorescente verte. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Cytotoxicité de la α-synucléine sur gélose due à l’expression de plasmides à nombre élevé de copies dans la levure. Des cellules de levure exprimant des variantes de α-synucléine-GFP pilotées par GAL1 dans des plasmides pRS426 ont été repérées dans des dilutions quintuples sur un milieu de levure sélective contenant 2% de glucose ou 2% de galactose. Les cellules ont été incubées pendant 3 jours à 30 °C, et les plaques ont été photographiées. Abréviations : GFP = protéine fluorescente verte; EV = vecteur vide; WT = type sauvage; α-Syn = α-synucléine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Cytotoxicité de la α-synucléine en milieu liquide due à l’expression de plasmides à nombre élevé de copies dans la levure. Des cellules de levure exprimant des variantes de α-synucléine-GFP pilotées par GAL1 ont été cultivées en milieu liquide dans une plaque de 96 puits à 30 °C pendant 2 jours, et la croissance a été surveillée à l’aide d’un lecteur de microplaques. Abréviations : GFP = protéine fluorescente verte; EV = vecteur vide; WT = type sauvage; α-Syn = α-synucléine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Analyse de cellules de levure exprimant α-synucléine-GFP par microscopie à fluorescence. Des variantes α-synucléine-GFP ont été induites par addition de galactose et incubation pendant 6 h. La confirmation de la α-synucléine-GFP a été faite par microscopie à fluorescence. Barre d’échelle = 10 μm. Abréviations : GFP = protéine fluorescente verte; EV = vecteur vide; WT = type sauvage; α-Syn = α-synucléine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Résumé de cette méthode de mesure de la cytotoxicité et de la formation agrégée de α-synucléine à l’aide de levures humanisées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Compte tenu de la complexité des différents systèmes cellulaires chez l’homme, il est avantageux d’utiliser la levure comme modèle pour étudier les maladies neurodégénératives humaines. Bien qu’il soit presque impossible d’étudier les interactions cellulaires complexes du cerveau humain à l’aide de levure, d’un point de vue unicellulaire, les cellules de levure présentent un niveau élevé de similitude avec les cellules humaines en termes d’homologie de séquence génomique et de processus cellulaires eucaryotes fondamentaux 8,13. De plus, étant donné la facilité de manipulation génétique, la levure peut faciliter l’étude de systèmes humains complexes et exigeants. Par conséquent, la levure a été largement utilisée comme système modèle pour comprendre les processus cellulaires eucaryotes et la pathogenèse de diverses maladies14,15,16. En particulier, il existe des divergences entre les propriétés d’agrégation in silico, in vitro et in vivo des protéines amyloïdogènes, y compris la α-synucléine17. Compte tenu de la complexité et de l’imprévisibilité du comportement des protéines dans la cellule, il est important d’étudier les propriétés des protéines in vivo. Ainsi, pour comprendre ce qui se passe dans une cellule avec de la α-synucléine, il est nécessaire de l’étudier dans des conditions in vivo, et la levure est considérée comme un système modèle utile et puissant pour cela.
Dans cette étude, les propriétés de la α-synucléine dans la levure dans un état fortement surexprimé en utilisant un plasmide de 2 microns ont été analysées. Le taux de α-synucléine a été contrôlé par un promoteur GAL1 inductible. Ce promoteur est activé lorsque le galactose est disponible en tant que nutriment, et ainsi, ce système nous permet d’étudier les phénotypes dérivés de niveaux spécifiques d’expression de la protéine α-synucléine. La surexpression des variantes de type sauvage et de α-synucléine, à l’exception de A30P, a provoqué une toxicité dans le test de repérage, ainsi que dans l’analyse de la courbe de croissance. Ces variantes de type sauvage et de α-synucléine ont été examinées à l’aide de la microscopie à fluorescence pour surveiller les agrégats protéiques de α-synucléine dans les cellules. À partir de ces expériences, la formation de foyers dérivés de l’agrégation de α-synucléine a été observée dans le type sauvage de α-synucléine et les variantes présentant une cytotoxicité. Ces résultats confirment que la toxicité cellulaire et la formation de foyers résultant d’une agrégation mal repliée des protéines α-synucléine sont liées à l’un des phénotypes représentatifs de la MP dans les cellules neuronales18,19.
Il est important d’incuber les transformants pendant 3 jours et de choisir de grandes colonies rougeâtres pour d’autres expériences. La souche W303a a une mutation adénine, ce qui fait que la cellule devient rouge20. Par conséquent, le choix d’une colonie blanche entraîne le mauvais contaminant. Le choix du stade cellulaire approprié pour l’induction de la α-synucléine par l’ajout de galactose est important afin d’observer un phénotype reproductible. Pour tester l’effet d’une protéine spécifique sur la cytotoxicité de la α-synucléine, d’autres protéines peuvent être co-exprimées par co-transformation. Cependant, les plasmides avec des marqueurs Ura doivent être évités car le plasmide de α-synucléine est maintenu avec Ura.
Cette méthode ne se limite pas à l’étude des caractéristiques cellulaires de la α-synucléine elle-même et peut être un outil utile pour valider les gènes candidats qui peuvent influencer l’agrégation de la α-synucléine. Fait intéressant, diverses protéines bactériennes (p. ex. chaperons et boucles) ont récemment été signalées comme affectant la formation de α-synucléine in vitro21,22. L’effet d’un gène candidat sur la toxicité dérivée de la α-synucléine ou la formation d’agrégats peut être surveillé par co-expression. Par exemple, la α-synucléine maintenue par le gène marqueur URA3 a été co-exprimée dans des cellules avec un gène candidat du plasmide pRS425, qui contenait un promoteur inductible par le galactose et un marqueur LEU2. En outre, ce système pourrait être utilisé à des fins de criblage génétique à l’aide de bibliothèques de suppression ou de surexpression de gènes, ainsi que de bibliothèques chimiques, dans la levure23. Cependant, dans les tests de criblage à l’échelle du génome qui visent à découvrir des interactions génétiques, la co-surexpression avec d’autres protéines dans un plasmide ne sera pas facile à réaliser en termes d’efficacité de transformation. Dans de telles situations, il peut être préférable d’exprimer la α-synucléine dans le génome en plusieurs copies pour manipuler la forme toxique20. En conclusion, ce système et protocole modèle de levure fournit une plate-forme simple et complète pour comprendre la physiologie de la α-synucléine et évaluer les gènes ayant la capacité potentielle de moduler la toxicité et l’agrégation de la α-synucléine (Figure 5).
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions James Bardwell et Tiago F. Outeiro d’avoir bien voulu partager les plasmides contenant de la α-synucléine. Changhan Lee a reçu un financement de la Fondation nationale de recherche de Corée (NRF) financé par le gouvernement coréen (MSIT) (subvention 2021R1C1C1011690), du Programme de recherche scientifique fondamentale par le biais de la NRF financé par le ministère de l’Éducation (subvention 2021R1A6A1A10044950) et du nouveau fonds de recherche du corps professoral de l’Université Ajou.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well plate | SPL | 30096 | |
| Agarose | TAESHIN | 0158 | |
| Bacto Agar | BD Difco | 214010 | |
| Breathe-easy | diversified biotech | BEM-1 | Gas permeable sealing membrane for microtiter plates |
| cover glasses | Marienfeld | 24 x 60 mm | |
| Culture tube | SPL | 40014 | |
| Cuvette | ratiolab | 2712120 | |
| D-(+)-Galactose | sigma | G0625 | |
| D-(+)-Glucose | sigma | G8270 | |
| D-(+)-Raffinose pentahydrate | Daejung | 6638-4105 | |
| Incubator (shaking) | Labtron | model: SHI1 | |
| Incubator (static) | Vision scientific | model: VS-1203PV-O | |
| LiAc | sigma | L6883 | |
| Microplate reader | Tecan | 30050303 01 | Model: Infinite 200 pro |
| multichannel pipette 20-200 µL | gilson | FA10011 | |
| multichannel pipette 2-20 µL | gilson | FA10009 | |
| Olympus microscope | Olympus | IX-53 | |
| PEG | sigma | P4338 | average mol wt 3,350 |
| Petridish | SPL | 10090 | |
| pRS426 | Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene. 110 (1), 119-122 (1992). | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A30P | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A53T | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein E46K | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein WT | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| Reservoir | SPL | 23050 | |
| Spectrophotometer | eppendorf | 6131 05560 | |
| W303a | Present from James Bardwell | ||
| Yeast nitrogen base w/o amino acids | Difco | 291940 | |
| Yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil | sigma | Y1501 | |
| YPD | Condalab | 1547.00 |
References
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