Summary
Физиологическая модель in vivo α-синуклеина необходима для изучения и понимания патогенеза болезни Паркинсона. Описан метод мониторинга цитотоксичности и агрегатного образования α-синуклеина с использованием гуманизированной дрожжевой модели.
Abstract
Болезнь Паркинсона является вторым наиболее распространенным нейродегенеративным расстройством и характеризуется прогрессирующей гибелью клеток, вызванной образованием клеток Леви, содержащих неправильно свернутые и агрегированные α-синуклеин. α-синуклеин является обильным пресинаптическим белком, который регулирует торговлю синаптическими пузырьками, но накопление его белковых включений приводит к нейротоксичности. Недавние исследования показали, что различные генетические факторы, включая бактериальные шапероны, могут уменьшить образование α-синуклеиновых агрегатов in vitro. Тем не менее, также важно контролировать антиагрегационный эффект в клетке, чтобы применять его в качестве потенциального лечения для пациентов. Было бы идеально использовать нейронные клетки, но с этими клетками трудно обращаться и требуется много времени, чтобы продемонстрировать фенотип антиагрегации. Поэтому для дальнейшей оценки антиагрегационной активности in vivo требуется быстрый и эффективный инструмент in vivo . Описанный здесь метод использовался для мониторинга и анализа антиагрегационного фенотипа в гуманизированных дрожжах Saccharomyces cerevisiae, которые экспрессировали человеческий α-синуклеин. Этот протокол демонстрирует инструменты in vivo , которые могут быть использованы для мониторинга клеточной токсичности, вызванной α-синуклеином, а также образования агрегатов α-синуклеина в клетках.
Introduction
Болезнь Паркинсона (БП) является серьезной проблемой для стареющих обществ во всем мире. Агрегация α-синуклеина тесно связана с БП, а белковые агрегаты α-синуклеина широко используются в качестве молекулярного биомаркера для диагностики заболевания1. α-синуклеин представляет собой небольшой кислый белок (140 аминокислот в длину) с тремя доменами, а именно N-концевым липидсвязывающим α-спирали, амилоид-связывающим центральным доменом (NAC) и С-концевым кислотным хвостом2. Неправильное сворачивание α-синуклеина может происходить спонтанно и в конечном итоге приводит к образованию амилоидных агрегатов, называемых тельцами Леви3. α-синуклеин может способствовать патогенезу БП несколькими способами. В целом, считается, что его аномальные, растворимые олигомерные формы, называемые протофибриллами, являются токсичными видами, которые вызывают гибель нейрональных клеток, воздействуя на различные клеточные мишени, включая синаптическую функцию3.
Биологические модели, используемые для изучения нейродегенеративных заболеваний, должны иметь отношение к людям в отношении их генома и клеточной биологии. Лучшими моделями будут клеточные линии нейронов человека. Однако эти клеточные линии связаны с несколькими техническими проблемами, такими как трудности в поддержании культур, низкая эффективность трансфекции и высокие затраты4. По этим причинам требуется простой и надежный инструмент для ускорения прогресса в этой области исследований. Важно отметить, что инструмент должен быть простым в использовании для анализа собранных данных. С этой точки зрения широко используются различные модельные организмы, включая Drosophila, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, дрожжи и грызунов5. Среди них дрожжи являются лучшим модельным организмом, потому что генетические манипуляции просты, и они дешевле, чем другие модельные организмы. Самое главное, дрожжи имеют большое сходство с человеческими клетками, такие как 60% гомология последовательности для человеческих ортологов и 25% близкая гомология с генами, связанными с человеческими заболеваниями6, и они также разделяют фундаментальную эукариотическую клеточную биологию. Дрожжи содержат много белков с аналогичными последовательностями и аналогичными функциями в клетках человека7. Действительно, дрожжи, экспрессирующие человеческие гены, широко использовались в качестве модельной системы для выяснения клеточных процессов8. Этот штамм дрожжей называется гуманизированными дрожжами и является полезным инструментом для изучения функции генов человека9. Гуманизированные дрожжи имеют преимущества для изучения генетических взаимодействий, потому что генетические манипуляции хорошо известны в дрожжах.
В этом исследовании мы использовали дрожжи Saccharomyces cerevisiae в качестве модельного организма для изучения патогенеза БП, в частности, для изучения образования агрегатов α-синуклеина и цитотоксичности10. Для экспрессии α-синуклеина в почковых дрожжах штамм W303a использовался для трансформации с плазмидами, кодирующими дикий тип и семейные PD-ассоциированные варианты α-синуклеина. Поскольку штамм W303a имеет ауксотрофную мутацию на URA3, он применим для отбора клеток, содержащих плазмиды с URA3. Экспрессия α-синуклеина, закодированного в плазмиде, регулируется промотором GAL1 . Таким образом, уровень экспрессии α-синуклеина можно контролировать. Кроме того, слияние зеленого флуоресцентного белка (GFP) в С-концевой области α-синуклеина позволяет контролировать образование α-синуклеиновых очагов. Чтобы понять характеристики семейных PD-ассоциированных вариантов α-синуклеина, мы также экспрессировали эти варианты в дрожжах и изучили их клеточные эффекты. Эта система является простым инструментом для скрининга соединений или генов, проявляющих защитные роли против цитотоксичности α-синуклеина.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка носителей и решений
- Подготовка СМИ
- Для приготовления среды YPD растворите 50 г порошка YPD в dH2O, чтобы получить конечный объем 1 л. Автоклав для стерилизации. Хранить при комнатной температуре (RT).
- Чтобы сделать агар YPD средой, растворите 50 г порошка YPD и 20 г агара в 1 л dH2O. Автоклав для стерилизации. После остывания вылейте на чашку Петри. Хранить при температуре 4 °C.
- Для получения СК с рафинозной (SRd)-Ura средой растворяют 6,7 г азотистого основания дрожжей с сульфатом аммония и без аминокислот в 795 мл dH2O. Автоклав для стерилизации. Добавьте 100 мл 20% рафинозы, 5 мл 20% глюкозы и 100 мл 10x -Ura перед использованием.
- Для получения агаровой среды SD-Ura растворяют 6,7 г азотистой основы дрожжей с сульфатом аммония и без аминокислот и 20 г агара в 800 мл dH2O. Автоклав в колбе объемом свыше 2 л. Добавьте 100 мл 20% глюкозы и 100 мл 10x-ura выпадения. Хорошо перемешать и вылить на посуду Петри. Хранить при температуре 4 °C.
- Для получения СК с галактозой (СГ)-Ура агаровой средой растворяют 6,7 г основания дрожжевого азота с сульфатом аммония и без аминокислот и 20 г агара в 800 мл dH2O. Автоклав в колбе объемом свыше 2 л. Добавляют 100 мл 20% галактозы и 100 мл выпадения 10х-Ура. Хорошо перемешать и вылить на чашку Петри. Хранить при температуре 4 °C.
- Стоковые решения для использования с SD-носителями
- Чтобы получить 20% источник углерода (глюкоза, галактоза и рафиноза), растворите 100 г глюкозы, галактозы или рафинозы в dH2O, чтобы получить конечный объем 500 мл. Автоклав и магазин на RT.
- Чтобы сделать 10-кратные дрожжевые синтетические добавки без урацила (10x-Ura drop-out), растворите 19,2 г «дрожжевых синтетических добавок без урацила» в dH2O, чтобы сделать окончательный объем 1 л. Автоклав и хранить в RT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для приготовления среды, содержащей агар, добавьте магнитный перемешивание в колбу, чтобы хорошо перемешать все растворы перед выливанием на чашку Петри.
2. Трансформация дрожжей
ПРИМЕЧАНИЕ: Плазмида pRS426 использовалась для клонирования гена α-синуклеина и содержала ген URA3 в качестве выбираемого маркера. Существуют семейные PD-ассоциированные варианты α-синуклеина, которые имеют тяжелые фенотипы заболевания (например, цитотоксичность). Эти варианты также использовались здесь для мониторинга их цитотоксичности и образования агрегированных очагов. Используйте одну и ту же колонию дрожжевых трансформантов для всех экспериментов, чтобы получить последовательные результаты.
- Для трансформации плазмид экспрессии дрожжей используют пустой вектор (pRS426) в качестве контрольных и α-синуклеин-содержащих плазмид. Ссылаясь на стандартный способ11 ацетата лития (LiAc), получают шесть компетентных клеток и 0,5 мкг каждой плазмиды и выполняют трансформацию.
- Чтобы выбрать дрожжевые трансформанты, содержащие плазмиды, используйте синтетическую определенную среду (SD-среду) без урацила (SD-Ura) и инкубируйте пластины при 30 °C в течение 2-3 дней.
- Нанесите три одиночные колонии на агаровую пластину SD-Ura для отбора клеток, содержащих плазмиды, для дальнейших экспериментов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить точные и надежные результаты, мы изучили по крайней мере три биологических репликата на штамм.
3. Споттинг-анализ
ПРИМЕЧАНИЕ: Известно, что экспрессия GFP-меченого α-синуклеина в плазмидах с высоким числом копий связана с цитотоксичностью в дрожжах10.
- Инокулируют три пластырных дрожжевых трансформанта на штамм в 3 мл SRd-Ura для селективного роста дрожжей, содержащих плазмиды с 2% рафинозы для ингибирования индукции α-синуклеина под промотором GAL1 и 0,1% глюкозы. Инкубируют клеточную культуру при 30 °C при перемешивании при 200 об/мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно повторить все эксперименты с разными колониями. Получение одинаковых результатов из более чем трех независимых колоний означает, что результат является надежным. - На следующий день инокулируют культивируемые на ночь клетки в 3 мл свежего SRd-Ura до OD600 0,2 и инкубируют в течение 6 ч при 30 °C при перемешивании при 200 об/мин.
- Когда OD600 достигнет 0,6-0,8, разбавьте клетки в 96-луночных пластинах для анализа пятнистости следующим образом.
- Измерьте OD600 всех образцов и разбавьте образцы до OD600 0,5 со стерильным dH2O (смешанный объем составляет 100 мкл) в полосе 1 96-луночной пластины для выравнивания количества клеток в каждой культуре.
- Выполняют пятикратное последовательное разведение дрожжевых клеток путем добавления 160 мкл стерильного dH2Oк следующим пяти полосам. Обеспечьте общий объем 40 мкл при последовательном разбавлении ячеек в каждой полосе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Низкие коэффициенты разбавления могут привести к большим различиям между образцами. Для обеспечения равномерного перемешивания при выполнении последовательных разбавлений требуется достаточная пипетка. Наконечник пипетки должен быть заменен в каждой точке разбавления. В противном случае клетки, прикрепленные к поверхности наконечника, могут быть перенесены в следующую лунку и повлиять на номер ячейки.
- Используйте многоканальную пипетку для переноса 10 мкл из каждой скважины, чтобы обнаружить образцы на агаровых пластинах SD-Ura для контроля и агаровых пластинах SG-Ura для мониторинга токсичности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины следует сушить до тех пор, пока пятнистые образцы не будут полностью поглощены пластинами. - Инкубируйте пятнистые пластины вверх ногами при 30 °C в течение 4 дней.
- Делайте снимки пластин каждые 24 часа до 4-го дня, а затем анализируйте данные, сравнивая различия в росте между штаммами, замеченными глазом. Подсчитайте отдельные колонии в наиболее разбавленной пробе, рассчитайте количество жизнеспособных клеток в исходной культуре для каждого штамма или сравните размер отдельных колоний.
4. Измерение роста дрожжей с помощью микропластичного считывателя
- Инокулируют три пластырных дрожжевых трансформанта на штамм в 3 мл SRd-Ura и инкубируют при 30 °C при перемешивании при 200 об/мин в течение ночи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы понять каждый колониальный фенотип гуманизированного штамма дрожжей, экспрессирующего α-синуклеин, используйте одни и те же трансформанты для всех экспериментов. - На следующий день привите культивируемые на ночь клетки в общей сложности 200 мкл свежих SD-Ura и SG-Ura в 96-луночных пластинах. Отрегулируйте конечный объем, включая ячейки, до 200 мкл, а начальную ячейку OD600 до 0,05.
- Отрегулируйте настройки программы в микротитровой пластине следующим образом: установите целевую температуру на 30°С, установите длительность встряхивания (линейной) на 890 с, установите амплитуду встряхивания (линейной) на 5 мм, установите интервальное время на 00:15:00, а измерение как поглощение на 600 нм.
- Инкубируйте пластину в течение 2-3 дней, чтобы все штаммы достигли стационарной фазы в считывателе микропластин.
- Проанализируйте данные, построив кривую роста (например, с помощью Workbook). Получите точки данных путем усреднения значений поглощения от трех биологических реплик и укажите полосы ошибок. Используйте значение поглощения только из среды в качестве элемента управления и вычтите его из значений из культивируемых ячеек (необязательно).
5. Флуоресцентная микроскопия
- Инокулируют пластырные дрожжевые трансформанты в 3 мл SRd-Ura и культивируют их в течение ночи при 30 °C при перемешивании при 200 об/мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для определения корреляции фенотипа с цитотоксичностью и образованием очагов используют для эксперимента те же колонии. - На следующий день реиртулируйте ночные культивируемые клетки в 3 мл свежего SRd-Ura до OD600 0,003. Инкубируют культуру до тех пор, пока OD600 не достигнет 0,2 при 30 °C при перемешивании при 200 об/мин (~18 ч).
- Когда достигается OD600 0,2, добавляют 300 мкл 20% галактозы, а затем инкубируют еще 6 ч при 30 °C при перемешивании при 200 об/мин.
- Соберите клетки путем центрифугирования при 800 х г в течение 5 мин и выбросьте супернатант.
- Осторожно повторно суспендировать гранулу ячейки в 30 мкл дистиллированной воды.
- Загрузите 5 мкл повторно суспендированных ячеек на скользящее стекло. Приготовьте агарозную гелевую прокладку12 и нанесите ее на нагруженные ячейки, чтобы она равномерно распределялась.
- Выполняйте микроскопическую визуализацию со 100-кратным объективом, используя как ярко-полевые, так и GFP-флуоресцентные фильтры.
- Во-первых, используйте brightfield для фокусировки ячейки со 100-кратным объективом с помощью погружного масла. Используйте опцию захвата экрана для создания изображений с помощью программы.
- Переключитесь на GFP-флуоресцентный фильтр. Отрегулируйте время экспозиции изображения от 50 до 300 мс для получения четкого изображения путем балансировки отношения сигнал/шум. Захват экрана изображения с помощью программы.
- Визуализируйте много ячеек из нескольких точек, а не только из одной.
- Анализируйте изображения, подсчитывая процент клеток, содержащих очаги агрегатов α-синуклеина с помощью аналитического программного обеспечения. Наблюдать различия между сигналом растворимого белка GFP и сигналом GFP, образованным фокусами, а также диффузию GFP с вариантной формой A30P α-синуклеина.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образование очагов будет наблюдаться с дикими типами E46K и A53T α-синуклеина.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Известно, что высокая экспрессия α-синуклеина связана с гибелью нейрональных клеток и БП в модельных системах БП. В данном исследовании описаны три метода мониторинга цитотоксичности α-синуклеина и образования очагов агрегированного α-синуклеина в дрожжах. Здесь α-синуклеин был чрезмерно экспрессирован в дрожжах, и были исследованы фенотипы α-синуклеина дикого типа и трех вариантов α-синуклеина, известных как семейные мутанты БП (рисунок 1 и Таблица материалов).
Экспрессия α-синуклеина под промотором GAL1 в векторе pRS426 показала значительную задержку роста на агаровой пластине, содержащей галактозу в качестве индуктора (рисунок 2). Разница в росте экспрессии α-синуклеина наблюдалась также в жидких культурах (рисунок 3). В обоих условиях культивирования α-синуклеин дикого типа и варианты с мутациями E46K или A53T показали дефекты роста из-за токсичности α-синуклеина. Однако вариант α-синуклеина A30P, который не образует агрегатов, показал нетоксичный фенотип.
Чтобы понять взаимосвязь между цитотоксичностью и агрегацией α-синуклеина, необходим метод мониторинга состояния α-синуклеина в дрожжах. Α-синуклеин был помечен белком GFP на С-конце для мониторинга состояния α-синуклеина в живых дрожжевых клетках путем обнаружения сигнала GFP с использованием флуоресцентной микроскопии. Штаммы, проявляющие выраженную цитотоксичность, показали очаги агрегатов α-синуклеина, но в варианте A30P менее токсичная форма α-синуклеина была рассеяна по клеткам (рисунок 4).
Рисунок 1: α-синуклеиновые домены и конструкции, используемые в этом исследовании. (A) Структура человеческого α-синуклеина с тремя различными доменами - N-концевым доменом, доменом NAC и доменом C-терминала. Аминокислотные остатки указаны внизу. Оранжевые линии обозначают мутировавшие сайты. (B) Конструкции рекомбинантных плазмид, используемые в данном исследовании. Плазмида pRS426 использовалась в качестве основы. α-синуклеин был слит с меткой GFP на C-конце, и его экспрессия контролировалась промотором GAL1 . Сокращения: NAC = неамилоидно-β компонент; GFP = зеленый флуоресцентный белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Цитотоксичность α-синуклеина на агаре из-за экспрессии плазмид с высоким числом копий в дрожжах. Дрожжевые клетки, экспрессирующие GAL1-управляемые варианты α-синуклеин-GFP в плазмидах pRS426, были обнаружены в пятикратных разведениях на селективной дрожжевой среде, содержащей 2% глюкозы или 2% галактозы. Клетки инкубировали в течение 3 дней при 30 °C, а пластины фотографировали. Сокращения: GFP = зеленый флуоресцентный белок; EV = пустой вектор; WT = дикий тип; α-Syn = α-синуклеин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Цитотоксичность α-синуклеина в жидких средах из-за экспрессии плазмид с высоким числом копий в дрожжах. Дрожжевые клетки, экспрессирующие GAL1-управляемые варианты α-синуклеин-GFP, культивировали в жидкой среде в 96-луночной пластине при 30 °C в течение 2 дней, и рост контролировали с помощью считывателя микропластин. Сокращения: GFP = зеленый флуоресцентный белок; EV = пустой вектор; WT = дикий тип; α-Syn = α-синуклеин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Анализ дрожжевых клеток, экспрессирующих α-синуклеин-GFP методом флуоресцентной микроскопии. варианты α-синуклеин-GFP индуцировали добавлением галактозы и инкубацией в течение 6 ч. Подтверждение α-синуклеин-GFP было сделано с помощью флуоресцентной микроскопии. Шкала шкалы = 10 мкм. Сокращения: GFP = зеленый флуоресцентный белок; EV = пустой вектор; WT = дикий тип; α-Syn = α-синуклеин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Краткое изложение этого метода измерения цитотоксичности и агрегированного образования α-синуклеина с использованием гуманизированных дрожжей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Учитывая сложность различных клеточных систем у человека, выгодно использовать дрожжи в качестве модели для изучения нейродегенеративных заболеваний человека. Хотя почти невозможно исследовать сложные клеточные взаимодействия человеческого мозга с использованием дрожжей, с точки зрения одноклеточных клеток дрожжевые клетки имеют высокий уровень сходства с клетками человека с точки зрения гомологии геномной последовательности и фундаментальных эукариотических клеточных процессов 8,13. Более того, учитывая легкость генетических манипуляций, дрожжи могут облегчить изучение сложных и требовательных человеческих систем. Поэтому дрожжи широко используются в качестве модельной системы для понимания эукариотических клеточных процессов и патогенеза различных заболеваний 14,15,16. В частности, существуют расхождения между свойствами агрегации in silico, in vitro и in vivo амилоидогенных белков, включая α-синуклеин17. Учитывая сложность и непредсказуемость поведения белка в клетке, важно изучать свойства белка in vivo. Таким образом, чтобы понять, что происходит в клетке с α-синуклеином, необходимо исследовать ее в условиях in vivo, и дрожжи считаются полезной и мощной модельной системой для этого.
В этом исследовании были проанализированы свойства α-синуклеина в дрожжах в сильно сверхэкспрессированном состоянии с использованием плазмиды 2 микрона. Уровень α-синуклеина контролировался индуцируемым промотором GAL1. Этот промотор активируется, когда галактоза доступна в качестве питательного вещества, и, таким образом, эта система позволяет нам изучать фенотипы, полученные из определенных уровней экспрессии белка α-синуклеина. Сверхэкспрессия вариантов дикого типа и α-синуклеина, за исключением A30P, вызвала токсичность в анализе пятнистости, а также в анализе кривой роста. Эти варианты дикого типа и α-синуклеина были исследованы с использованием флуоресцентной микроскопии для мониторинга белковых агрегатов α-синуклеина в клетках. Из этих экспериментов наблюдалось образование очагов, полученных в результате агрегации α-синуклеина в α-синуклеинов дикого типа и вариантах, проявляющих цитотоксичность. Эти результаты подтверждают, что клеточная токсичность и образование очагов в результате неправильной агрегации белка α-синуклеина связаны с одним из репрезентативных фенотипов БП в нейрональных клетках18,19.
Важно инкубировать трансформанты в течение 3 дней и выбирать большие и красноватые колонии для дальнейших экспериментов. Штамм W303a имеет мутацию аденина, которая заставляет клетку краснеть20. Поэтому выбор белой колонии приводит к работе с неправильным загрязнителем. Выбор подходящей клеточной стадии для индукции α-синуклеина путем добавления галактозы важен для того, чтобы наблюдать воспроизводимый фенотип. Для проверки влияния специфического белка на цитотоксичность α-синуклеина другие белки могут быть совместно экспрессированы путем котрансформации. Тем не менее, плазмиды с маркерами Ura следует избегать, так как плазмида α-синуклеина поддерживается с Ura.
Этот метод не ограничивается изучением клеточных характеристик самого α-синуклеина и может быть полезным инструментом для проверки генов-кандидатов, которые могут влиять на агрегацию α-синуклеина. Интересно, что недавно сообщалось, что различные бактериальные белки (например, шапероны и курки) влияют на образование α-синуклеина in vitro 21,22. Влияние гена-кандидата на токсичность или образование агрегатов, полученных из α-синуклеина, можно контролировать путем коэкспрессии. Например, α-синуклеин, поддерживаемый геном маркера URA3, был совместно экспрессирован в клетках с геном-кандидатом из плазмиды pRS425, который содержал галактозно-индуцируемый промотор и маркер LEU2. Кроме того, эта система может быть использована для целей генетического скрининга с использованием библиотек делеции генов или гиперэкспрессии, а также химических библиотек в дрожжах23. Однако в общегеномных скрининговых анализах, направленных на выявление генетических взаимодействий, ко-сверхэкспрессию с другими белками в плазмиде будет нелегко достичь с точки зрения эффективности трансформации. В таких ситуациях может быть лучше экспрессировать α-синуклеин в геноме в нескольких копиях, чтобы манипулировать токсичной формой20. В заключение, эта система и протокол дрожжевой модели обеспечивают простую и всеобъемлющую платформу для понимания физиологии α-синуклеина и оценки генов с потенциальной способностью модулировать токсичность и агрегацию α-синуклеина (рисунок 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Мы благодарим Джеймса Бардуэлла и Тьяго Ф. Аутейро за любезное распространение плазмид, содержащих α-синуклеин. Чанхан Ли получил финансирование от Национального исследовательского фонда Кореи (NRF), финансируемого корейским правительством (MSIT) (грант 2021R1C1C1C1011690), Программы фундаментальных научных исследований через NRF, финансируемой Министерством образования (грант 2021R1A6A1A10044950), и нового исследовательского фонда факультета Университета Аджу.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well plate | SPL | 30096 | |
| Agarose | TAESHIN | 0158 | |
| Bacto Agar | BD Difco | 214010 | |
| Breathe-easy | diversified biotech | BEM-1 | Gas permeable sealing membrane for microtiter plates |
| cover glasses | Marienfeld | 24 x 60 mm | |
| Culture tube | SPL | 40014 | |
| Cuvette | ratiolab | 2712120 | |
| D-(+)-Galactose | sigma | G0625 | |
| D-(+)-Glucose | sigma | G8270 | |
| D-(+)-Raffinose pentahydrate | Daejung | 6638-4105 | |
| Incubator (shaking) | Labtron | model: SHI1 | |
| Incubator (static) | Vision scientific | model: VS-1203PV-O | |
| LiAc | sigma | L6883 | |
| Microplate reader | Tecan | 30050303 01 | Model: Infinite 200 pro |
| multichannel pipette 20-200 µL | gilson | FA10011 | |
| multichannel pipette 2-20 µL | gilson | FA10009 | |
| Olympus microscope | Olympus | IX-53 | |
| PEG | sigma | P4338 | average mol wt 3,350 |
| Petridish | SPL | 10090 | |
| pRS426 | Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene. 110 (1), 119-122 (1992). | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A30P | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A53T | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein E46K | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein WT | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| Reservoir | SPL | 23050 | |
| Spectrophotometer | eppendorf | 6131 05560 | |
| W303a | Present from James Bardwell | ||
| Yeast nitrogen base w/o amino acids | Difco | 291940 | |
| Yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil | sigma | Y1501 | |
| YPD | Condalab | 1547.00 |
References
- Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: Why cook with baker's yeast. Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).
- Surguchov, A. Intracellular dynamics of synucleins: "Here, there and everywhere". International Review of Cell and Molecular Biology. 320, 103-169 (2015).
- Soto, C., Pritzkow, S. Protein misfolding, aggregation, and conformational strains in neurodegenerative diseases. Nature Neuroscience. 21 (10), 1332-1340 (2018).
- Gordon, J., Amini, S. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 2311, 1-8 (2021).
- Dawson, T. M., Golde, T. E., Lagier-Tourenne, C.
- Bassett, D. E., Boguski, M. S., Hieter, P. Yeast genes and human disease. Nature. 379 (6566), 589-590 (1996).
- Koteliansky, V., Glukhova, M., Bejanian, M., Surguchov, A., Smirnov, V. Isolation and characterization of actin-like protein from yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS Letters. 102 (1), 55-58 (1979).
- Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).
- Kachroo, A. H., Vandeloo, M., Greco, B. M., Abdullah, M. Humanized yeast to model human biology, disease and evolution. Disease Models & Mechanisms. 15 (6), (2022).
- Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).
- Dunham, M., Gartenberg, M., Brown, G. Methods in Yeast Genetics and Genomics. , Cold Spring Harbour Laboratory Press. Woodbury, New York. (2015).
- Skinner, S. O., Sepúlveda, L. A., Xu, H., Golding, I. Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization. Nature Protocols. 8 (6), 1100-1113 (2013).
- Tenreiro, S., Munder, M. C., Alberti, S., Outeiro, T. F. Harnessing the power of yeast to unravel the molecular basis of neurodegeneration. Journal of Neurochemistry. 127 (4), 438-452 (2013).
- Nielsen, J. Yeast systems biology: Model organism and cell factory. Biotechnology Journal. 14 (9), 1800421 (2019).
- Eleutherio, E., et al. Oxidative stress and aging: learning from yeast lessons. Fungal Biology. 122 (6), 514-525 (2018).
- Rencus-Lazar, S., DeRowe, Y., Adsi, H., Gazit, E., Laor, D. Yeast models for the study of amyloid-associated disorders and development of future therapy. Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 15 (2019).
- Franco, R., Rivas-Santisteban, R., Navarro, G., Pinna, A., Reyes-Resina, I. Genes implicated in familial Parkinson's disease provide a dual picture of nigral dopaminergic neurodegeneration with mitochondria taking center stage. International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4643 (2021).
- Wan, O. W., Chung, K. K. The role of alpha-synuclein oligomerization and aggregation in cellular and animal models of Parkinson's disease. PLoS One. 7 (6), 38545 (2012).
- Xu, L., Pu, J. Alpha-synuclein in Parkinson's disease: From pathogenetic dysfunction to potential clinical application. Parkinson's Disease. 2016, 1720621 (2016).
- Gitler, A. D., et al. The Parkinson's disease protein α-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).
- Sampson, T. R., et al. A gut bacterial amyloid promotes α-synuclein aggregation and motor impairment in mice. Elife. 9, 53111 (2020).
- Evans, M. L., et al. The bacterial curli system possesses a potent and selective inhibitor of amyloid formation. Molecular Cell. 57 (3), 445-455 (2015).
- Su, L. J., et al. Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models. Disease Models & Mechanisms. 3 (3-4), 194-208 (2010).
