Summary
En in vivo fysiologisk model af α-synuclein er nødvendig for at studere og forstå patogenesen af Parkinsons sygdom. Vi beskriver en metode til overvågning af cytotoksicitet og samlet dannelse af α-synuclein ved hjælp af en humaniseret gærmodel.
Abstract
Parkinsons sygdom er den næstmest almindelige neurodegenerative lidelse og er karakteriseret ved progressiv celledød forårsaget af dannelsen af Lewy-kroppe, der indeholder forkert foldede og aggregerede α-synuclein. α-synuclein er et rigeligt præsynaptisk protein, der regulerer synaptisk vesikelhandel, men akkumuleringen af dets proteinholdige indeslutninger resulterer i neurotoksicitet. Nylige undersøgelser har vist, at forskellige genetiske faktorer, herunder bakterielle chaperoner, kan reducere dannelsen af α-synucleinaggregater in vitro. Det er dog også vigtigt at overvåge antiaggregeringseffekten i cellen for at anvende dette som en potentiel behandling for patienterne. Det ville være ideelt at bruge neuronale celler, men disse celler er vanskelige at håndtere og tager lang tid at udvise anti-aggregeringsfænotypen. Der er derfor behov for et hurtigt og effektivt in vivo-værktøj til yderligere evaluering af in vivo-antiaggregeringsaktivitet. Metoden beskrevet her blev brugt til at overvåge og analysere anti-aggregeringsfænotypen i den humaniserede gær Saccharomyces cerevisiae, som udtrykte humant α-synuclein. Denne protokol demonstrerer in vivo-værktøjer, der kan bruges til overvågning af α-synuclein-induceret cellulær toksicitet samt dannelsen af α-synucleinaggregater i celler.
Introduction
Parkinsons sygdom (PD) er et alvorligt problem for aldrende samfund over hele verden. Aggregeringen af α-synuclein er tæt forbundet med PD, og proteinaggregater af α-synuclein anvendes i vid udstrækning som en molekylær biomarkør til diagnosticering af sygdommen1. α-synuclein er et lille surt protein (140 aminosyrer i længden) med tre domæner, nemlig det N-terminale lipidbindende α-helix, det amyloidbindende centrale domæne (NAC) og den C-terminale sure hale2. Fejlfoldningen af α-synuclein kan forekomme spontant og fører til sidst til dannelsen af amyloidaggregater kaldet Lewy-legemer3. α-synuclein kan bidrage til patogenesen af PD på flere måder. Generelt menes det, at dets unormale, opløselige oligomere former kaldet protofibriller er giftige arter, der forårsager neuronal celledød ved at påvirke forskellige cellulære mål, herunder synaptisk funktion3.
De biologiske modeller, der anvendes til at studere neurodegenerative sygdomme, skal være relevante for mennesker med hensyn til deres genom og cellulære biologi. De bedste modeller ville være menneskelige neuronale cellelinjer. Disse cellelinjer er imidlertid forbundet med flere tekniske problemer, såsom vanskeligheder med vedligeholdelse af kulturer, lav effektivitet af transfektion og høje omkostninger4. Derfor er der behov for et let og pålideligt værktøj til at fremskynde fremskridtene på dette forskningsområde. Det er vigtigt, at værktøjet skal være let at bruge til analyse af de indsamlede data. Fra disse perspektiver er forskellige modelorganismer blevet anvendt i vid udstrækning, herunder Drosophila, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, gær og gnavere5. Blandt dem er gær den bedste modelorganisme, fordi genetisk manipulation er let, og det er billigere end de andre modelorganismer. Vigtigst er det, at gær har store ligheder med humane celler, såsom 60% sekvenshomologi til humane ortologer og 25% tæt homologi med humane sygdomsrelaterede gener6, og de deler også grundlæggende eukaryot cellebiologi. Gær indeholder mange proteiner med lignende sekvenser og analoge funktioner som dem i humane celler7. Faktisk er gær, der udtrykker menneskelige gener, blevet brugt i vid udstrækning som et modelsystem til at belyse cellulære processer8. Denne gærstamme kaldes humaniseret gær og er et nyttigt værktøj til at udforske funktionen af menneskelige gener9. Humaniseret gær har fortjeneste for at studere genetiske interaktioner, fordi genetisk manipulation er veletableret i gær.
I denne undersøgelse brugte vi gæren Saccharomyces cerevisiae som modelorganisme til at studere patogenesen af PD, især til undersøgelse af dannelse af α-synuclein aggregat og cytotoksicitet10. Til ekspression af α-synuclein i den spirende gær blev W303a-stammen anvendt til transformation med plasmider, der koder for de vildtype- og familiære PD-associerede varianter af α-synuclein. Da W303a-stammen har en auxotrofisk mutation på URA3, er den anvendelig til udvælgelse af celler indeholdende plasmider med URA3. Ekspressionen af α-synuclein kodet i et plasmid reguleres under GAL1-promotoren. Således kan ekspressionsniveauet for α-synuclein styres. Derudover tillader fusionen af grønt fluorescerende protein (GFP) i den C-terminale region af α-synuclein overvågning af dannelsen af α-synucleinfoci. For at forstå egenskaberne ved de familiære PD-associerede varianter af α-synuclein udtrykte vi også disse varianter i gær og undersøgte deres cellulære virkninger. Dette system er et ligetil værktøj til screening af forbindelser eller gener, der udviser beskyttende roller mod cytotoksiciteten af α-synuclein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af medier og opløsninger
- Forberedelse af medierne
- For at fremstille YPD-medium opløses 50 g YPD-pulver idH2O-væsketil et slutvolumen på 1 L. Autoklave til sterilisering. Opbevares ved stuetemperatur (RT).
- For at fremstille YPD-agarmedium opløses 50 g YPD-pulver og 20 g agar i 1 literdH2O. Autoklave til sterilisering. Efter afkøling hældes på petriskåle. Opbevares ved 4 °C.
- For at fremstille SC med raffinose (SRd)-Ura-medium opløses 6,7 g gærnitrogenbase med ammoniumsulfat og uden aminosyrer i 795 mldH2O. Autoklave til sterilisering. Tilsæt 100 ml 20% raffinose, 5 ml 20% glucose og 100 ml 10x -Ura drop-out før brug.
- For at fremstille SD-Ura agarmedium opløses 6,7 g gærnitrogenbase med ammoniumsulfat og uden aminosyrer og 20 g agar i 800 ml dH 2 O. Autoklave i en kolbe med et volumen over2L. Tilsæt 100 ml 20% glucose og 100 ml 10x -Ura drop-out. Bland godt og hæld på petriskåle. Opbevares ved 4 °C.
- For at fremstille SC med galactose (SG)-Ura agarmedium opløses 6,7 g gærnitrogenbase med ammoniumsulfat og uden aminosyrer og 20 g agar i 800 ml dH 2 O. Autoklave i en kolbe med et volumen over2L. Tilsæt 100 ml 20% galactose og 100 ml 10x -Ura drop-out. Bland godt og hæld petriskåle på. Opbevares ved 4 °C.
- Stock-løsninger til brug med SD-medier
- For at fremstille en 20% kulstofkilde (glucose, galactose og raffinose) opløses 100 g glucose, galactose eller raffinose i dH2O for at lave et endeligt volumen på 500 ml. Autoklave og opbevar på RT.
- For at gøre 10x gær syntetisk drop-out medium kosttilskud uden uracil (10x-Ura drop-out), opløses 19,2 g "gær syntetisk drop-out medium kosttilskud uden uracil" i dH2O for at gøre et endeligt volumen af 1 L. Autoklave og opbevares på RT.
BEMÆRK: Til fremstilling af et medium indeholdende agar tilsættes en magnetisk omrøringsstang til kolben for at blande alle opløsningerne godt, inden de hældes på petriskåle.
2. Gær transformation
BEMÆRK: pRS426-plasmidet blev brugt til at klone α-synuclein-genet og indeholdt URA3-genet som en valgbar markør. Der er familiære PD-associerede varianter af α-synuclein, der har alvorlige sygdomsfænotyper (fx cytotoksicitet). Disse varianter blev også brugt her til at overvåge deres cytotoksicitet og aggregerede focidannelse. Brug den samme koloni af gærtransformanter til alle eksperimenterne for at få ensartede resultater.
- Til transformation af gærekspressionsplasmider anvendes en tom vektor (pRS426) som kontrol- og α-synucleinholdige plasmider. Med henvisning til standard lithiumacetat (LiAc) metode11 fremstilles seks kompetente celler og 0,5 μg af hvert plasmid, og transformationen udføres.
- For at vælge gærtransformanter indeholdende plasmider skal du bruge det syntetiske definerede medium (SD-medium) uden uracil (SD-Ura) og inkubere pladerne ved 30 ° C i 2-3 dage.
- Patch tre enkeltkolonier på en SD-Ura agarplade til udvælgelse af celler indeholdende plasmider til yderligere eksperimenter.
BEMÆRK: For at generere nøjagtige og pålidelige resultater undersøgte vi mindst tre biologiske replikater pr. stamme.
3. Spotting assay
BEMÆRK: Ekspressionen af GFP-mærket α-synuclein i plasmider med højt kopinummer vides at være forbundet med cytotoksicitet i gær10.
- Pod de tre patchede gærtransformanter pr. stamme i 3 ml SRd-Ura til selektiv vækst af gær indeholdende plasmiderne med 2% raffinose til hæmning af induktionen af α-synuclein under GAL1-promotoren og 0,1% glucose. Cellekulturen inkuberes ved 30 °C under omrøring ved 200 omdr./min.
BEMÆRK: Det er vigtigt at gentage alle eksperimenter med forskellige kolonier. At opnå de samme resultater fra over tre uafhængige kolonier betyder, at resultatet er pålideligt. - Den næste dag podes de dyrkede celler natten over i 3 ml frisk SRd-Ura til en OD 600 på 0,2 og inkuberes i 6 timer ved 30 °C under omrøring ved200 o / min.
- Når OD600 når 0,6-0,8, fortyndes cellerne i 96-brøndplader til spotting-analysen som følger.
- Mål OD 600 af alle prøverne, og fortynd prøverne til en OD 600 på 0,5 med steril dH2O (det blandede volumen er100 μL) i bane 1 på en 96-brøndplade for at udligne antallet af celler i hver kultur.
- Udfør femdobbelte serielle fortyndinger af gærcellerne ved at tilsætte 160 μL steril dH2O til de næste fem baner. Sørg for et samlet volumen på 40 μL ved seriel fortynding af cellerne i hver bane.
BEMÆRK: Lave fortyndingsfaktorer kan give større forskelle mellem prøverne. Der kræves tilstrækkelig pipettering for at sikre ensartet blanding ved udførelse af seriefortyndingerne. Pipettespidsen skal udskiftes ved hvert fortyndingspunkt. Ellers kan cellerne, der er fastgjort til overfladen af spidsen, overføres til den næste brønd og påvirke cellenummeret.
- Brug en multikanalpipette til at overføre 10 μL fra hvert hul til at spotte prøverne på SD-Ura agarplader til kontrollerne og SG-Ura agarplader til overvågning af toksicitet.
BEMÆRK: Pladerne skal tørres, indtil de plettede prøver er helt absorberet på pladerne. - De plettede plader inkuberes på hovedet ved 30 °C i 4 dage.
- Tag billeder af pladerne hver 24. time indtil dag 4, og analyser derefter dataene ved at sammenligne vækstforskellene mellem stammer, der er spottet af øjet. Tæl de enkelte kolonier i den mest fortyndede prøve, beregn antallet af levedygtige celler i den oprindelige kultur for hver stamme, eller sammenlign størrelsen af de enkelte kolonier.
4. Måling af gærvækst ved hjælp af en mikropladelæser
- De tre plastrede gærtransformanter podes pr. stamme til 3 ml SRd-Ura, og de inkuberes ved 30 °C under omrøring ved 200 omdr./min. natten over.
BEMÆRK: For at forstå hver kolonifænotype af den humaniserede gærstamme, der udtrykker α-synuclein, skal du bruge de samme transformanter til alle eksperimenterne. - Den næste dag podes de dyrkede celler natten over i i alt 200 μL frisk SD-Ura og SG-Ura i plader med 96 brønde. Juster det endelige volumen, inklusive cellerne, til 200 μL, og juster den indledende celle OD600 til 0,05.
- Juster programindstillingerne i mikrotiterpladen som følger: Indstil måltemperaturen til 30 ° C, indstil rystningsvarigheden (lineær) til 890 s, indstil rysteamplituden (lineær) til 5 mm, indstil intervaltiden til 00:15:00, og indstil målingen som absorbans til 600 nm.
- Inkuber pladen i 2-3 dage, så alle stammerne når den stationære fase i en mikropladelæser.
- Analysér dataene ved at plotte vækstkurven (f.eks. ved hjælp af projektmappe). Datapunkterne indsamles ved at beregne gennemsnittet af absorbansværdierne fra de tre biologiske replikater, og fejlbjælkerne angives. Brug kun absorbansværdien fra medier som kontrol, og træk den fra værdierne fra dyrkede celler (valgfrit).
5. Fluorescensmikroskopi
- Pod de plastrede gærtransformanter i 3 ml SRd-Ura, og dyrk dem natten over ved 30 °C under omrøring ved 200 omdr./min.
BEMÆRK: For at bestemme korrelationen mellem fænotypen og cytotoksiciteten og focidannelsen skal du bruge de samme kolonier til eksperimentet. - Den næste dag reinokuleres de dyrkede celler natten over i 3 ml frisk SRd-Ura til en OD600 på 0,003 . Inkuber kulturen, indtil OD 600 når 0,2 ved 30 °C under omrøring ved200 o / min (~ 18 timer).
- Når der opnås en OD 600 på 0,2, tilsættes 300 μL 20% galactose og inkuberes derefter i yderligere 6 timer ved 30 °C under omrøring ved200 omdr./min.
- Cellerne opsamles ved centrifugering ved 800 x g i 5 min, og supernatanten kasseres.
- Resuspender cellepillen forsigtigt i 30 μL destilleret vand.
- Læg 5 μL af de opslæmmede celler på et diasglas. Forbered en agarosegelpude12 og læg den på de indlæste celler for at få den til at sprede sig jævnt.
- Udfør mikroskopisk billeddannelse med et 100x mål ved hjælp af både brightfield- og GFP-fluorescensfiltre.
- Brug først brightfield til at fokusere cellen med et 100x mål ved hjælp af nedsænkningsolie. Brug skærmoptagelsesindstillingen til at generere billederne ved hjælp af programmet.
- Skift til et GFP-fluorescensfilter. Juster billedeksponeringstiden til mellem 50 ms og 300 ms for at opnå et klart billede ved at afbalancere signal-støj-forholdet. Skærmbillede billedet ved hjælp af programmet.
- Afbild mange celler fra flere punkter i stedet for kun et.
- Analyser billederne ved at tælle procentdelen af celler, der indeholder foci af α-synucleinaggregater ved hjælp af analytisk software. Overhold forskellene mellem det opløselige GFP-proteinsignal og det foci-dannede GFP-signal samt diffusionen af GFP med A30P-variantformen af α-synuclein.
BEMÆRK: Focidannelse vil blive observeret med vildtype-, E46K- og A53T-varianterne af α-synuclein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den høje ekspression af α-synuclein er kendt for at være forbundet med neuronal celledød og PD i modelsystemer af PD. Denne undersøgelse beskriver tre metoder til overvågning af cytotoksiciteten af α-synuclein og focidannelsen af aggregeret α-synuclein i gær. Her blev α-synuclein overudtrykt i gær, og fænotyperne af vildtype α-synuclein og tre varianter af α-synuclein kendt som familiære mutanter af PD blev undersøgt (figur 1 og materialetabellen).
α-synucleinekspressionen under GAL1-promotoren i pRS426-vektoren viste signifikant væksthæmning på agarpladen indeholdende galactose som inducer (figur 2). Forskellen i vækst med α-synucleinekspression blev også observeret i flydende kulturer (figur 3). Under begge dyrkningsbetingelser viste vildtype α-synuclein og varianter med E46K- eller A53T-mutationer vækstdefekter på grund af α-synucleintoksicitet. Imidlertid viste α-synuclein A30P-varianten, som ikke danner aggregater, en ikke-toksisk fænotype.
For at forstå forholdet mellem cytotoksicitet og aggregering af α-synuclein er en metode til overvågning af status for α-synuclein i gær nødvendig. α-synuclein blev mærket af et GFP-protein ved C-terminalen for at overvåge status for α-synuclein i levende gærceller ved at detektere GFP-signalet ved hjælp af fluorescensmikroskopi. De stammer, der udviste alvorlig cytotoksicitet, viste fokus på α-synucleinaggregater, men i A30P-varianten blev en mindre toksisk form af α-synuclein diffunderet gennem cellerne (figur 4).
Figur 1: α-synuclein-domæner og konstruktioner, der anvendes i denne undersøgelse . (A) Strukturen af humant α-synuclein med de tre forskellige domæner - N-terminaldomænet, NAC-domænet og C-terminaldomænet. Aminosyreresterne er angivet nederst. De orange linjer angiver de muterede steder. (B) De rekombinante plasmidkonstruktioner, der anvendes i denne undersøgelse. PRS426-plasmidet blev brugt som rygrad. α-synuclein blev smeltet sammen med et GFP-tag ved C-terminalen, og dets udtryk blev kontrolleret af GAL1-promotoren . Forkortelser: NAC = ikke-amyloid-β komponent; GFP = grønt fluorescerende protein. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Cytotoksicitet af α-synuclein på agar på grund af ekspressionen af plasmider med højt kopiantal i gær. Gærceller, der udtrykte GAL1-drevne α-synuclein-GFP-varianter i pRS426-plasmider, blev spottet i femfoldige fortyndinger på et selektivt gærmedium indeholdende 2% glucose eller 2% galactose. Cellerne blev inkuberet i 3 dage ved 30 °C, og pladerne blev fotograferet. Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; EV = tom vektor; WT = vildtype; α-Syn = α-synuclein. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Cytotoksicitet af α-synuclein i flydende medier på grund af ekspressionen af plasmider med højt kopiantal i gær. Gærceller, der udtrykte GAL1-drevne α-synuclein-GFP-varianter, blev dyrket i flydende medier i en 96-brøndplade ved 30 °C i 2 dage, og væksten blev overvåget ved hjælp af en mikropladelæser. Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; EV = tom vektor; WT = vildtype; α-Syn = α-synuclein. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Analyse af gærceller, der udtrykker α-synuclein-GFP ved fluorescensmikroskopi. α-synuclein-GFP-varianter blev induceret ved tilsætning af galactose og inkubation i 6 timer. Bekræftelsen af α-synuclein-GFP blev udført ved fluorescensmikroskopi. Skalabjælke = 10 μm. Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; EV = tom vektor; WT = vildtype; α-Syn = α-synuclein. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Resumé af denne metode til måling af cytotoksicitet og samlet dannelse af α-synuclein ved anvendelse af humaniseret gær. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I betragtning af kompleksiteten af forskellige cellulære systemer hos mennesker er det fordelagtigt at anvende gær som model til undersøgelse af humane neurodegenerative sygdomme. Selvom det er næsten umuligt at undersøge de komplekse cellulære interaktioner i den menneskelige hjerne ved hjælp af gær, har gærceller fra et enkeltcelleperspektiv et højt niveau af lighed med humane celler med hensyn til genomisk sekvenshomologi og grundlæggende eukaryote cellulære processer 8,13. I betragtning af den lette genetiske manipulation kan gær desuden lette undersøgelsen af komplekse og krævende menneskelige systemer. Derfor er gær blevet brugt i vid udstrækning som et modelsystem til forståelse af eukaryote cellulære processer og patogenesen af forskellige sygdomme14,15,16. Især er der uoverensstemmelser mellem in silico-, in vitro- og in vivo-aggregeringsegenskaberne af amyloidogene proteiner, herunder α-synuclein17. Under hensyntagen til kompleksiteten og uforudsigeligheden af proteinadfærd i cellen er det vigtigt at studere proteinegenskaber in vivo. For at forstå, hvad der sker i en celle med α-synuclein, er det således nødvendigt at undersøge det in vivo-forhold, og gær menes at være et nyttigt og kraftfuldt modelsystem til dette.
I denne undersøgelse blev egenskaberne af α-synuclein i gær i en stærkt overudtrykt tilstand ved anvendelse af et 2 mikron plasmid analyseret. α-synuclein-niveauet blev kontrolleret af en inducerbar GAL1-promotor. Denne promotor aktiveres, når galactose er tilgængelig som næringsstof, og dette system giver os således mulighed for at studere fænotyper afledt af specifikke niveauer af α-synucleinproteinekspression. Overekspressionen af vildtype- og α-synucleinvarianterne, bortset fra A30P, forårsagede toksicitet i spottinganalysen såvel som i vækstkurveanalysen. Disse vildtype- og α-synucleinvarianter blev undersøgt ved hjælp af fluorescensmikroskopi for at overvåge proteinaggregaterne af α-synuclein i cellerne. Fra disse eksperimenter blev dannelsen af foci afledt af α-synuclein-aggregering observeret i α-synuclein vildtype og varianter, der udviser cytotoksicitet. Disse resultater bekræfter, at cellulær toksicitet og focidannelse som følge af fejlfoldet α-synucleinproteinaggregering er knyttet til en af de repræsentative fænotyper af PD i neuronale celler18,19.
Det er vigtigt at inkubere transformanterne i 3 dage og vælge store og rødlige kolonier til yderligere forsøg. W303a-stammen har en adeninmutation, som får cellen til at blive rød20. Derfor resulterer valg af en hvid koloni i at arbejde med det forkerte forurenende stof. Valg af det passende celletrin til induktion af α-synuclein ved tilsætning af galactose er vigtigt for at observere en reproducerbar fænotype. Til test af effekten af et specifikt protein på cytotoksiciteten af α-synuclein kan andre proteiner co-udtrykkes ved co-transformation. Imidlertid skal plasmider med Ura-markører undgås, da α-synucleinplasmidet opretholdes med Ura.
Denne metode er ikke begrænset til undersøgelsen af de cellulære egenskaber ved selve α-synuclein og kan være et nyttigt værktøj til at validere kandidatgener, der kan påvirke aggregeringen af α-synuclein. Interessant nok er forskellige bakterielle proteiner (fx chaperoner og curli) for nylig blevet rapporteret at påvirke dannelsen af α-synuclein in vitro21,22. Virkningen af et kandidatgen på α-synucleinafledt toksicitet eller aggregatdannelse kan overvåges ved co-ekspression. For eksempel blev α-synuclein opretholdt af URA3-markørgenet co-udtrykt i celler med et kandidatgen fra pRS425-plasmidet, som indeholdt en galactose-inducerbar promotor og en LEU2-markør. Desuden kan dette system anvendes til genetisk screening ved hjælp af gendeletions- eller overekspressionsbiblioteker samt kemiske biblioteker i gær23. I genomdækkende screeningsassays, der sigter mod at afdække genetiske interaktioner, vil co-overekspression med andre proteiner i et plasmid imidlertid ikke være let at opnå med hensyn til transformationseffektivitet. I sådanne situationer kan det være bedre at udtrykke α-synuclein i genomet i flere kopier for at manipulere den toksiske form20. Afslutningsvis giver dette gærmodelsystem og protokol en ligetil og omfattende platform til at forstå fysiologien af α-synuclein og evaluere gener med den potentielle evne til at modulere α-synucleintoksicitet og aggregering (figur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker James Bardwell og Tiago F. Outeiro for venligt at dele plasmiderne indeholdende α-synuclein. Changhan Lee modtog finansiering fra National Research Foundation of Korea (NRF) finansieret af den koreanske regering (MSIT) (tilskud 2021R1C1C1011690), Basic Science Research Program gennem NRF finansieret af Undervisningsministeriet (tilskud 2021R1A6A1A10044950) og den nye fakultetsforskningsfond ved Ajou University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well plate | SPL | 30096 | |
| Agarose | TAESHIN | 0158 | |
| Bacto Agar | BD Difco | 214010 | |
| Breathe-easy | diversified biotech | BEM-1 | Gas permeable sealing membrane for microtiter plates |
| cover glasses | Marienfeld | 24 x 60 mm | |
| Culture tube | SPL | 40014 | |
| Cuvette | ratiolab | 2712120 | |
| D-(+)-Galactose | sigma | G0625 | |
| D-(+)-Glucose | sigma | G8270 | |
| D-(+)-Raffinose pentahydrate | Daejung | 6638-4105 | |
| Incubator (shaking) | Labtron | model: SHI1 | |
| Incubator (static) | Vision scientific | model: VS-1203PV-O | |
| LiAc | sigma | L6883 | |
| Microplate reader | Tecan | 30050303 01 | Model: Infinite 200 pro |
| multichannel pipette 20-200 µL | gilson | FA10011 | |
| multichannel pipette 2-20 µL | gilson | FA10009 | |
| Olympus microscope | Olympus | IX-53 | |
| PEG | sigma | P4338 | average mol wt 3,350 |
| Petridish | SPL | 10090 | |
| pRS426 | Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene. 110 (1), 119-122 (1992). | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A30P | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A53T | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein E46K | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein WT | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| Reservoir | SPL | 23050 | |
| Spectrophotometer | eppendorf | 6131 05560 | |
| W303a | Present from James Bardwell | ||
| Yeast nitrogen base w/o amino acids | Difco | 291940 | |
| Yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil | sigma | Y1501 | |
| YPD | Condalab | 1547.00 |
References
- Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: Why cook with baker's yeast. Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).
- Surguchov, A. Intracellular dynamics of synucleins: "Here, there and everywhere". International Review of Cell and Molecular Biology. 320, 103-169 (2015).
- Soto, C., Pritzkow, S. Protein misfolding, aggregation, and conformational strains in neurodegenerative diseases. Nature Neuroscience. 21 (10), 1332-1340 (2018).
- Gordon, J., Amini, S. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 2311, 1-8 (2021).
- Dawson, T. M., Golde, T. E., Lagier-Tourenne, C.
- Bassett, D. E., Boguski, M. S., Hieter, P. Yeast genes and human disease. Nature. 379 (6566), 589-590 (1996).
- Koteliansky, V., Glukhova, M., Bejanian, M., Surguchov, A., Smirnov, V. Isolation and characterization of actin-like protein from yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS Letters. 102 (1), 55-58 (1979).
- Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).
- Kachroo, A. H., Vandeloo, M., Greco, B. M., Abdullah, M. Humanized yeast to model human biology, disease and evolution. Disease Models & Mechanisms. 15 (6), (2022).
- Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).
- Dunham, M., Gartenberg, M., Brown, G. Methods in Yeast Genetics and Genomics. , Cold Spring Harbour Laboratory Press. Woodbury, New York. (2015).
- Skinner, S. O., Sepúlveda, L. A., Xu, H., Golding, I. Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization. Nature Protocols. 8 (6), 1100-1113 (2013).
- Tenreiro, S., Munder, M. C., Alberti, S., Outeiro, T. F. Harnessing the power of yeast to unravel the molecular basis of neurodegeneration. Journal of Neurochemistry. 127 (4), 438-452 (2013).
- Nielsen, J. Yeast systems biology: Model organism and cell factory. Biotechnology Journal. 14 (9), 1800421 (2019).
- Eleutherio, E., et al. Oxidative stress and aging: learning from yeast lessons. Fungal Biology. 122 (6), 514-525 (2018).
- Rencus-Lazar, S., DeRowe, Y., Adsi, H., Gazit, E., Laor, D. Yeast models for the study of amyloid-associated disorders and development of future therapy. Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 15 (2019).
- Franco, R., Rivas-Santisteban, R., Navarro, G., Pinna, A., Reyes-Resina, I. Genes implicated in familial Parkinson's disease provide a dual picture of nigral dopaminergic neurodegeneration with mitochondria taking center stage. International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4643 (2021).
- Wan, O. W., Chung, K. K. The role of alpha-synuclein oligomerization and aggregation in cellular and animal models of Parkinson's disease. PLoS One. 7 (6), 38545 (2012).
- Xu, L., Pu, J. Alpha-synuclein in Parkinson's disease: From pathogenetic dysfunction to potential clinical application. Parkinson's Disease. 2016, 1720621 (2016).
- Gitler, A. D., et al. The Parkinson's disease protein α-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).
- Sampson, T. R., et al. A gut bacterial amyloid promotes α-synuclein aggregation and motor impairment in mice. Elife. 9, 53111 (2020).
- Evans, M. L., et al. The bacterial curli system possesses a potent and selective inhibitor of amyloid formation. Molecular Cell. 57 (3), 445-455 (2015).
- Su, L. J., et al. Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models. Disease Models & Mechanisms. 3 (3-4), 194-208 (2010).
