Summary
Een in vivo fysiologisch model van α-synucleïne is nodig om de pathogenese van de ziekte van Parkinson te bestuderen en te begrijpen. We beschrijven een methode om de cytotoxiciteit en geaggregeerde vorming van α-synucleïne te monitoren met behulp van een gehumaniseerd gistmodel.
Abstract
De ziekte van Parkinson is de tweede meest voorkomende neurodegeneratieve aandoening en wordt gekenmerkt door progressieve celdood veroorzaakt door de vorming van Lewy-lichamen die verkeerd gevouwen en geaggregeerde α-synucleïne bevatten. α-synucleïne is een overvloedig presynaptisch eiwit dat de handel in synaptische blaasjes reguleert, maar de accumulatie van de eiwithoudende insluitsels resulteert in neurotoxiciteit. Recente studies hebben aangetoond dat verschillende genetische factoren, waaronder bacteriële chaperonnes, de vorming van α-synucleïneaggregaten in vitro kunnen verminderen. Het is echter ook belangrijk om het anti-aggregatie-effect in de cel te monitoren om dit toe te passen als een potentiële behandeling voor de patiënten. Het zou ideaal zijn om neuronale cellen te gebruiken, maar deze cellen zijn moeilijk te hanteren en het duurt lang om het anti-aggregatiefenotype te vertonen. Daarom is een snel en effectief in vivo instrument nodig voor de verdere evaluatie van de in vivo anti-aggregatieactiviteit. De hier beschreven methode werd gebruikt om het anti-aggregatiefenotype in de gehumaniseerde gist Saccharomyces cerevisiae, die menselijke α-synucleïne tot expressie bracht, te controleren en te analyseren. Dit protocol demonstreert in vivo hulpmiddelen die kunnen worden gebruikt voor het monitoren van α-synucleïne-geïnduceerde cellulaire toxiciteit, evenals de vorming van α-synucleïneaggregaten in cellen.
Introduction
De ziekte van Parkinson (PD) is een ernstig probleem voor vergrijzende samenlevingen wereldwijd. De aggregatie van α-synucleïne is nauw verbonden met PD en eiwitaggregaten van α-synucleïne worden veel gebruikt als moleculaire biomarker voor het diagnosticeren van de ziekte1. α-synucleïne is een klein zuur eiwit (140 aminozuren lang) met drie domeinen, namelijk de N-terminale lipide-bindende α-helix, het amyloïde-bindende centrale domein (NAC) en de C-terminale zure staart2. Het verkeerd vouwen van α-synucleïne kan spontaan optreden en leidt uiteindelijk tot de vorming van amyloïde aggregaten genaamd Lewy bodies3. α-synucleïne kan op verschillende manieren bijdragen aan de pathogenese van PD. Over het algemeen wordt gedacht dat de abnormale, oplosbare oligomere vormen die protofibrillen worden genoemd, toxische soorten zijn die neuronale celdood veroorzaken door verschillende cellulaire doelen te beïnvloeden, waaronder synaptische functie3.
De biologische modellen die worden gebruikt om neurodegeneratieve ziekten te bestuderen, moeten relevant zijn voor mensen met betrekking tot hun genoom en cellulaire biologie. De beste modellen zouden menselijke neuronale cellijnen zijn. Deze cellijnen worden echter geassocieerd met verschillende technische problemen, zoals problemen bij het onderhoud van culturen, lage efficiëntie van transfectie en hoge kosten4. Om deze redenen is een eenvoudig en betrouwbaar instrument nodig om de vooruitgang op dit onderzoeksgebied te versnellen. Belangrijk is dat de tool gemakkelijk te gebruiken moet zijn voor het analyseren van de verzamelde gegevens. Vanuit deze perspectieven zijn verschillende modelorganismen op grote schaal gebruikt, waaronder Drosophila, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, gist en knaagdieren5. Onder hen is gist het beste modelorganisme omdat genetische manipulatie gemakkelijk is en goedkoper is dan de andere modelorganismen. Het belangrijkste is dat gist hoge overeenkomsten heeft met menselijke cellen, zoals 60% sequentie homologie aan menselijke orthologen en 25% nauwe homologie met menselijke ziekte-gerelateerde genen6, en ze delen ook fundamentele eukaryote celbiologie. Gist bevat veel eiwitten met vergelijkbare sequenties en analoge functies als die in menselijke cellen7. Inderdaad, gist die menselijke genen tot expressie brengt, is op grote schaal gebruikt als een modelsysteem om cellulaire processen op tehelderen 8. Deze giststam wordt gehumaniseerde gist genoemd en is een nuttig hulpmiddel voor het onderzoeken van de functie van menselijke genen9. Gehumaniseerde gist heeft verdienste voor het bestuderen van genetische interacties omdat genetische manipulatie goed ingeburgerd is in gist.
In deze studie gebruikten we de gist Saccharomyces cerevisiae als modelorganisme om de pathogenese van PD te bestuderen, met name voor het onderzoeken van α-synucleïne aggregaatvorming en cytotoxiciteit10. Voor de expressie van α-synucleïne in de ontluikende gist, werd de W303a-stam gebruikt voor transformatie met plasmiden die coderen voor de wild-type en familiale PD-geassocieerde varianten van α-synucleïne. Aangezien de W303a-stam een auxotrofe mutatie op URA3 heeft, is deze van toepassing op de selectie van cellen die plasmiden met URA3 bevatten. De expressie van α-synucleïne gecodeerd in een plasmide wordt gereguleerd onder de GAL1 promotor. Zo kan het expressieniveau van α-synucleïne worden gecontroleerd. Bovendien maakt de fusie van groen fluorescerend eiwit (GFP) in het C-terminale gebied van α-synucleïne de monitoring van α-synucleïne foci-vorming mogelijk. Om de kenmerken van de familiale PD-geassocieerde varianten van α-synucleïne te begrijpen, drukten we deze varianten ook uit in gist en onderzochten we hun cellulaire effecten. Dit systeem is een eenvoudig hulpmiddel voor het screenen van verbindingen of genen die beschermende rollen vertonen tegen de cytotoxiciteit van α-synucleïne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van media en oplossingen
- Media voorbereiding
- Om YPD-medium te bereiden, lost u 50 g YPD-poeder op in dH2O om een laatste volume van 1 L. Autoclaaf voor sterilisatie te maken. Bewaren bij kamertemperatuur (RT).
- Om YPD agar medium te maken, lost u 50 g YPD-poeder en 20 g agar op in 1 L dH2O. Autoclaaf voor sterilisatie. Na het afkoelen op petrischalen gieten. Bewaren bij 4 °C.
- Om SC te maken met raffinose (SRd)-Ura medium, los 6,7 g giststikstofbase op met ammoniumsulfaat en zonder aminozuren in 795 ml dH2O. Autoclaaf voor sterilisatie. Voeg voor gebruik 100 ml 20% raffinose, 5 ml 20% glucose en 100 ml 10x-Ura drop-out toe.
- Om SD-Ura agar medium te maken, lost u 6,7 g giststikstofbase op met ammoniumsulfaat en zonder aminozuren en 20 g agar in 800 ml dH2O. Autoclaaf in een kolf met een volume van meer dan 2 l. Voeg 100 ml 20% glucose en 100 ml 10x -Ura drop-out toe. Meng goed en giet op petrischaaltjes. Bewaren bij 4 °C.
- Om SC te maken met galactose (SG)-Ura agar medium, los 6,7 g giststikstofbase op met ammoniumsulfaat en zonder aminozuren en 20 g agar in 800 ml dH2O. Autoclaaf in een kolf met een volume van meer dan 2 l. Voeg 100 ml galactose en 100 ml 10x -Ura drop-out toe. Meng goed en giet op petrischaaltjes. Bewaren bij 4 °C.
- Stockoplossingen voor gebruik met SD-media
- Om een koolstofbron van 20% (glucose, galactose en raffinose) te maken, lost u 100 g glucose, galactose of raffinose op in dH2O om een eindvolume van 500 ml te maken. Autoclaaf en winkel bij RT.
- Om 10x gist synthetische drop-out medium supplementen zonder uracil (10x-Ura drop-out) te maken, los 19,2 g "gist synthetische drop-out medium supplementen zonder uracil" op in dH2O om een eindvolume van 1 L. Autoclaaf te maken en op te slaan bij RT.
OPMERKING: Voeg voor de bereiding van een medium met agar een magnetische roerstaaf toe aan de kolf om alle oplossingen goed te mengen voordat u het op petrischalen giet.
2. Gisttransformatie
OPMERKING: Het pRS426-plasmide werd gebruikt om het α-synucleïnegen te klonen en bevatte het URA3-gen als een selecteerbare marker. Er zijn familiale PD-geassocieerde varianten van α-synucleïne die ernstige ziektefenotypen hebben (bijv. Cytotoxiciteit). Deze varianten werden hier ook gebruikt om hun cytotoxiciteit en geaggregeerde focivorming te monitoren. Gebruik dezelfde kolonie gisttransformatoren voor alle experimenten om consistente resultaten te krijgen.
- Gebruik voor de transformatie van de gistexpressieplasmiden een lege vector (pRS426) als controle- en α-synucleïne-bevattende plasmiden. Verwijzend naar de standaard lithiumacetaat (LiAc) methode11, bereid zes competente cellen en 0,5 μg van elk plasmide en voer de transformatie uit.
- Om te selecteren op gisttransformatoren die plasmiden bevatten, gebruikt u het synthetische gedefinieerde medium (SD-medium) zonder uracil (SD-Ura) en incubeert u de platen bij 30 °C gedurende 2-3 dagen.
- Patch drie enkele kolonies op een SD-Ura agar-plaat voor de selectie van cellen die plasmiden bevatten voor verdere experimenten.
OPMERKING: Om nauwkeurige en betrouwbare resultaten te genereren, hebben we ten minste drie biologische replicaties per stam onderzocht.
3. Spotting assay
OPMERKING: Het is bekend dat de expressie van GFP-gelabelde α-synucleïne in plasmiden met een hoog aantal kopieën geassocieerd is met cytotoxiciteit in gist10.
- Ent de drie gepatchte gisttransformatiemiddelen per stam in 3 ml SRd-Ura voor de selectieve groei van gist die de plasmiden bevat met 2% raffinose voor remming van de inductie van α-synucleïne onder de GAL1-promotor en 0,1% glucose. Incubeer de celcultuur bij 30 °C onder roeren bij 200 tpm.
OPMERKING: Het herhalen van alle experimenten met verschillende kolonies is belangrijk. Het verkrijgen van dezelfde resultaten van meer dan drie onafhankelijke kolonies betekent dat het resultaat betrouwbaar is. - Ent de volgende dag de 's nachts gekweekte cellen in 3 ml verse SRd-Ura tot een OD600 van 0,2 en incubeer gedurende 6 uur bij 30 °C onder roeren bij 200 tpm.
- Wanneer de OD600 0,6-0,8 bereikt, verdunt u de cellen in 96-well platen voor de spotting assay als volgt.
- Meet de OD600 van alle monsters en verdun de monsters tot een OD600 van 0,5 met steriele dH2O (het gemengde volume is 100 μL) in baan 1 van een 96-well plaat om het aantal cellen in elke cultuur gelijk te trekken.
- Voer vijfvoudige seriële verdunningen van de gistcellen uit door 160 μL steriel dH2O toe te voegen aan de volgende vijf rijstroken. Zorg voor een totaal volume van 40 μL bij het serieel verdunnen van de cellen in elke baan.
OPMERKING: Lage verdunningsfactoren kunnen grotere verschillen tussen de monsters veroorzaken. Er is voldoende pipettering vereist om een gelijkmatige menging te garanderen bij het uitvoeren van de seriële verdunningen. De pipetpunt moet op elk verdunningspunt worden vervangen. Anders kunnen de cellen die aan het oppervlak van de punt zijn bevestigd, worden overgebracht naar de volgende put en het celnummer beïnvloeden.
- Gebruik een meerkanaals pipet om 10 μL uit elke put over te brengen om de monsters op SD-Ura agar-platen voor de controles en SG-Ura-agar-platen te spotten om de toxiciteit te controleren.
OPMERKING: De platen moeten worden gedroogd totdat de gevlekte monsters volledig op de platen zijn opgenomen. - Incubeer de gevlekte platen ondersteboven bij 30 °C gedurende 4 dagen.
- Maak elke 24 uur tot dag 4 foto's van de platen en analyseer vervolgens de gegevens door de groeiverschillen tussen soorten die met het oog worden waargenomen te vergelijken. Tel de individuele kolonies in het meest verdunde monster, bereken het aantal levensvatbare cellen in de oorspronkelijke cultuur voor elke stam of vergelijk de grootte van de afzonderlijke kolonies.
4. Meting van gistgroei met behulp van een microplaatlezer
- Ent de drie gepatchte gisttransformatoren per stam in 3 ml SRd-Ura en incubeer bij 30 °C onder roeren bij 200 tpm 's nachts.
OPMERKING: Om elk koloniefenotype van de gehumaniseerde giststam te begrijpen die α-synucleïne tot expressie brengt, gebruikt u dezelfde transformanten voor alle experimenten. - Ent de volgende dag de 's nachts gekweekte cellen in een totaal van 200 μL verse SD-Ura en SG-Ura in 96-well platen. Pas het uiteindelijke volume, inclusief de cellen, aan op 200 μL en pas de initiële cel OD600 aan op 0,05.
- Pas de programma-instellingen in de microtiterplaat als volgt aan: stel de doeltemperatuur in op 30 ° C, stel de schudtijd (lineair) in op 890 s, stel de schudamplitude (lineair) in op 5 mm, stel de intervaltijd in op 00:15:00 en stel de meting in als absorptie op 600 nm.
- Incubeer de plaat gedurende 2-3 dagen voor alle stammen om de stationaire fase in een microplaatlezer te bereiken.
- Analyseer de gegevens door de groeicurve uit te zetten (bijvoorbeeld met werkmap). Verkrijg de gegevenspunten door het gemiddelde te nemen van de absorptiewaarden van de drie biologische replicaties en geef de foutbalken aan. Gebruik de waarde van absorptie van alleen media als besturingselement en trek dit af van de waarden van gekweekte cellen (optioneel).
5. Fluorescentiemicroscopie
- Ent de gepatchte gisttransformatoren in 3 ml SRd-Ura en kweek ze 's nachts bij 30 °C onder roeren bij 200 tpm.
OPMERKING: Om de correlatie van het fenotype met de cytotoxiciteit en focivorming te bepalen, gebruikt u dezelfde kolonies voor het experiment. - De volgende dag herculculeer je de 's nachts gekweekte cellen in 3 ml verse SRd-Ura tot een OD600 van 0,003. Incubeer de cultuur totdat de OD600 0,2 bereikt bij 30 °C onder roeren bij 200 tpm (~18 h).
- Wanneer een OD600 van 0,2 is bereikt, voegt u 300 μL 20% galactose toe en incubeert u vervolgens nog eens 6 uur bij 30 °C onder roeren bij 200 tpm.
- Verzamel de cellen door centrifugeren bij 800 x g gedurende 5 minuten en gooi het supernatant weg.
- Resuspenseer de celpellet voorzichtig in 30 μL gedestilleerd water.
- Laad 5 μL van de geresuspendeerde cellen op een schuifglas. Bereid een agarose gel pad12 en leg het op de geladen cellen om het gelijkmatig te verspreiden.
- Voer microscopische beeldvorming uit met een 100x objectief met behulp van zowel brightfield- als GFP-fluorescentiefilters.
- Gebruik eerst brightfield om de cel scherp te stellen met een 100x objectief met behulp van dompelolie. Gebruik de optie voor het vastleggen van het scherm voor het genereren van de afbeeldingen met behulp van het programma.
- Schakel over naar een GFP-fluorescentiefilter. Pas de belichtingstijd van het beeld aan tussen 50 ms en 300 ms om een helder beeld te krijgen door de signaal-ruisverhouding in evenwicht te brengen. Leg de afbeelding op het scherm vast met behulp van het programma.
- Afbeelding van veel cellen vanaf meerdere punten in plaats van slechts één.
- Analyseer de beelden door het percentage cellen te tellen dat foci van α-synucleïneaggregaten bevat met behulp van analytische software. Observeer de verschillen tussen het oplosbare GFP-eiwitsignaal en het foci-gevormde GFP-signaal, evenals de diffusie van GFP met de A30P-variantvorm van α-synucleïne.
OPMERKING: Foci-vorming zal worden waargenomen met de wild-type, E46K en A53T varianten van α-synucleïne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Van de hoge expressie van α-synucleïne is bekend dat deze verband houdt met neuronale celdood en PD in modelsystemen van PD. Deze studie beschrijft drie methoden om de cytotoxiciteit van α-synucleïne en de focivorming van geaggregeerde α-synucleïne in gist te monitoren. Hier werd de α-synucleïne overexpressie in gist en werden de fenotypen van wild-type α-synucleïne en drie varianten van α-synucleïne bekend als familiale mutanten van PD onderzocht (figuur 1 en de tabel met materialen).
De α-synucleïne-expressie onder de GAL1-promotor in de pRS426-vector vertoonde een significante groeivertraging op de agarplaat met galactose als inductor (figuur 2). Het verschil in groei door α-synucleïne expressie werd ook waargenomen in vloeibare culturen (figuur 3). In beide kweekomstandigheden vertoonden wild-type α-synucleïne en varianten met E46K- of A53T-mutaties groeidefecten als gevolg van α-synucleïnetoxiciteit. De α-synucleïne A30P-variant, die geen aggregaten vormt, vertoonde echter een niet-toxisch fenotype.
Om de relatie tussen cytotoxiciteit en de aggregatie van α-synucleïne te begrijpen, is een methode nodig om de status van α-synucleïne in gist te controleren. De α-synucleïne werd gelabeld door een GFP-eiwit op de C-terminus om de status van α-synucleïne in levende gistcellen te controleren door het GFP-signaal te detecteren met behulp van fluorescentiemicroscopie. De stammen die ernstige cytotoxiciteit vertoonden, vertoonden foci van α-synucleïneaggregaten, maar in de A30P-variant werd een minder toxische vorm van α-synucleïne door de cellen verspreid (figuur 4).
Figuur 1: α-synucleïnedomeinen en constructen die in deze studie worden gebruikt. (A) De structuur van menselijke α-synucleïne met de drie verschillende domeinen- het N-terminaldomein, het NAC-domein en het C-terminaldomein. De aminozuurresten worden onderaan aangegeven. De oranje lijnen geven de gemuteerde locaties aan. (B) De recombinante plasmideconstructen die in dit onderzoek zijn gebruikt. Het pRS426 plasmide werd gebruikt als ruggengraat. α-synucleïne werd gefuseerd met een GFP-tag op de C-terminus en de expressie ervan werd gecontroleerd door de GAL1-promotor . Afkortingen: NAC = niet-amyloïde-β component; GFP = groen fluorescerend eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Cytotoxiciteit van α-synucleïne op agar als gevolg van de expressie van plasmiden met een hoog aantal kopieën in gist. Gistcellen die GAL1-aangedreven α-synucleïne-GFP-varianten in pRS426-plasmiden tot expressie brengen, werden gespot in vijfvoudige verdunningen op een selectief gistmedium dat 2% glucose of 2% galactose bevat. De cellen werden gedurende 3 dagen geïncubeerd bij 30 °C en de platen werden gefotografeerd. Afkortingen: GFP = groen fluorescerend eiwit; EV = lege vector; WT = wild-type; α-Syn = α-synucleïne. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Cytotoxiciteit van α-synucleïne in vloeibare media als gevolg van de expressie van plasmiden met een hoog aantal kopieën in gist. Gistcellen die GAL1-aangedreven α-synucleïne-GFP-varianten tot expressie brachten, werden gedurende 2 dagen gekweekt in vloeibare media in een 96-well plaat bij 30 °C en de groei werd gevolgd met behulp van een microplaatlezer. Afkortingen: GFP = groen fluorescerend eiwit; EV = lege vector; WT = wild-type; α-Syn = α-synucleïne. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Analyse van gistcellen die α-synucleïne-GFP tot expressie brengen door fluorescentiemicroscopie. α-synucleïne-GFP-varianten werden geïnduceerd door galactose toe te voegen en gedurende 6 uur te broeden. De bevestiging van α-synucleïne-GFP werd gedaan door fluorescentiemicroscopie. Schaalbalk = 10 μm. Afkortingen: GFP = groen fluorescerend eiwit; EV = lege vector; WT = wild-type; α-Syn = α-synucleïne. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Samenvatting van deze methode voor het meten van cytotoxiciteit en aggregaatvorming van α-synucleïne met behulp van gehumaniseerde gist. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gezien de complexiteit van verschillende cellulaire systemen bij mensen, is het voordelig om gist te gebruiken als een model voor het bestuderen van menselijke neurodegeneratieve ziekten. Hoewel het bijna onmogelijk is om de complexe cellulaire interacties van het menselijk brein met behulp van gist te onderzoeken, hebben gistcellen vanuit een eencellig perspectief een hoge mate van gelijkenis met menselijke cellen in termen van de genomische sequentie homologie en fundamentele eukaryote cellulaire processen 8,13. Bovendien, gezien het gemak van genetische manipulatie, kan gist de studie van complexe en veeleisende menselijke systemen vergemakkelijken. Daarom is gist op grote schaal gebruikt als een modelsysteem om eukaryote cellulaire processen en de pathogenese van verschillende ziekten te begrijpen 14,15,16. In het bijzonder zijn er discrepanties tussen de in silico-, in vitro- en in vivo aggregatie-eigenschappen van amyloidogene eiwitten, waaronder α-synucleïne17. Rekening houdend met de complexiteit en onvoorspelbaarheid van eiwitgedrag in de cel, is het belangrijk om eiwiteigenschappen in vivo te bestuderen. Dus om te begrijpen wat er gebeurt in een cel met α-synucleïne, is het noodzakelijk om het in in vivo omstandigheden te onderzoeken, en gist wordt beschouwd als een nuttig en krachtig modelsysteem hiervoor.
In deze studie werden de eigenschappen van α-synucleïne in gist in een sterk overexpressie met behulp van een 2 micron plasmide geanalyseerd. Het α-synucleïneniveau werd gecontroleerd door een induceerbare GAL1-promotor. Deze promotor wordt geactiveerd wanneer galactose beschikbaar is als voedingsstof, en dus stelt dit systeem ons in staat om fenotypen te bestuderen die zijn afgeleid van specifieke niveaus van α-synucleïne-eiwitexpressie. De overexpressie van de wild-type en α-synucleïne varianten, met uitzondering van A30P, veroorzaakte toxiciteit in de spotting assay, evenals in de groeicurve analyse. Deze wild-type en α-synucleïne varianten werden onderzocht met behulp van fluorescentiemicroscopie om de eiwitaggregaten van α-synucleïne in de cellen te monitoren. Uit deze experimenten werd de vorming van foci afgeleid van α-synucleïneaggregatie waargenomen in de α-synucleïne wild-type en varianten die cytotoxiciteit vertonen. Deze resultaten bevestigen dat de cellulaire toxiciteit en focivorming als gevolg van verkeerd gevouwen α-synucleïne-eiwitaggregatie zijn gekoppeld aan een van de representatieve fenotypen van PD in neuronale cellen 18,19.
Het is belangrijk om de transformatoren gedurende 3 dagen te incuberen en grote en roodachtige kolonies te kiezen voor verdere experimenten. De W303a-stam heeft een adeninemutatie, waardoor de cel rood20 wordt. Daarom resulteert het kiezen van een witte kolonie in het werken met de verkeerde verontreiniging. Het kiezen van het juiste celstadium voor de inductie van α-synucleïne door galactose toe te voegen, is belangrijk om een reproduceerbaar fenotype waar te nemen. Voor het testen van het effect van een specifiek eiwit op de cytotoxiciteit van α-synucleïne, kunnen andere eiwitten co-expressie worden gebracht door co-transformatie. Plasmiden met Ura-markers moeten echter worden vermeden omdat de α-synucleïneplasmide wordt gehandhaafd met Ura.
Deze methode is niet beperkt tot de studie van de cellulaire kenmerken van α-synucleïne zelf en kan een nuttig hulpmiddel zijn om kandidaatgenen te valideren die de aggregatie van α-synucleïne kunnen beïnvloeden. Interessant is dat van verschillende bacteriële eiwitten (bijv. Chaperones en curli) onlangs is gemeld dat ze de vorming van α-synucleïne in vitrobeïnvloeden 21,22. Het effect van een kandidaat-gen op α-synucleïne-afgeleide toxiciteit of aggregaatvorming kan worden gevolgd door co-expressie. Bijvoorbeeld, α-synucleïne dat werd onderhouden door het URA3-markergen werd mede tot expressie gebracht in cellen met een kandidaat-gen van het pRS425-plasmide, dat een galactose-induceerbare promotor en een LEU2-marker bevatte. Bovendien zou dit systeem kunnen worden gebruikt voor genetische screening met behulp van genreletie- of overexpressiebibliotheken, evenals chemische bibliotheken, in gist23. In genoombrede screeningstests die gericht zijn op het blootleggen van genetische interacties, zal co-overexpressie met andere eiwitten in een plasmide echter niet gemakkelijk te bereiken zijn in termen van transformatie-efficiëntie. In dergelijke situaties kan het beter zijn om α-synucleïne in het genoom in meerdere kopieën uit te drukken om de toxische vorm te manipuleren20. Kortom, dit gistmodelsysteem en -protocol bieden een eenvoudig en uitgebreid platform om de fysiologie van α-synucleïne te begrijpen en genen te evalueren met het potentiële vermogen om α-synucleïnetoxiciteit en -aggregatie te moduleren (figuur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
We bedanken James Bardwell en Tiago F. Outeiro voor het delen van de plasmiden die α-synucleïne bevatten. Changhan Lee ontving financiering van de National Research Foundation of Korea (NRF) gefinancierd door de Koreaanse overheid (MSIT) (subsidie 2021R1C1C1011690), het Basic Science Research Program via de NRF gefinancierd door het ministerie van Onderwijs (subsidie 2021R1A6A1A1A10044950) en het nieuwe facultaire onderzoeksfonds van Ajou University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well plate | SPL | 30096 | |
| Agarose | TAESHIN | 0158 | |
| Bacto Agar | BD Difco | 214010 | |
| Breathe-easy | diversified biotech | BEM-1 | Gas permeable sealing membrane for microtiter plates |
| cover glasses | Marienfeld | 24 x 60 mm | |
| Culture tube | SPL | 40014 | |
| Cuvette | ratiolab | 2712120 | |
| D-(+)-Galactose | sigma | G0625 | |
| D-(+)-Glucose | sigma | G8270 | |
| D-(+)-Raffinose pentahydrate | Daejung | 6638-4105 | |
| Incubator (shaking) | Labtron | model: SHI1 | |
| Incubator (static) | Vision scientific | model: VS-1203PV-O | |
| LiAc | sigma | L6883 | |
| Microplate reader | Tecan | 30050303 01 | Model: Infinite 200 pro |
| multichannel pipette 20-200 µL | gilson | FA10011 | |
| multichannel pipette 2-20 µL | gilson | FA10009 | |
| Olympus microscope | Olympus | IX-53 | |
| PEG | sigma | P4338 | average mol wt 3,350 |
| Petridish | SPL | 10090 | |
| pRS426 | Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene. 110 (1), 119-122 (1992). | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A30P | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A53T | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein E46K | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein WT | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| Reservoir | SPL | 23050 | |
| Spectrophotometer | eppendorf | 6131 05560 | |
| W303a | Present from James Bardwell | ||
| Yeast nitrogen base w/o amino acids | Difco | 291940 | |
| Yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil | sigma | Y1501 | |
| YPD | Condalab | 1547.00 |
References
- Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: Why cook with baker's yeast. Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).
- Surguchov, A. Intracellular dynamics of synucleins: "Here, there and everywhere". International Review of Cell and Molecular Biology. 320, 103-169 (2015).
- Soto, C., Pritzkow, S. Protein misfolding, aggregation, and conformational strains in neurodegenerative diseases. Nature Neuroscience. 21 (10), 1332-1340 (2018).
- Gordon, J., Amini, S. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 2311, 1-8 (2021).
- Dawson, T. M., Golde, T. E., Lagier-Tourenne, C.
- Bassett, D. E., Boguski, M. S., Hieter, P. Yeast genes and human disease. Nature. 379 (6566), 589-590 (1996).
- Koteliansky, V., Glukhova, M., Bejanian, M., Surguchov, A., Smirnov, V. Isolation and characterization of actin-like protein from yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS Letters. 102 (1), 55-58 (1979).
- Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).
- Kachroo, A. H., Vandeloo, M., Greco, B. M., Abdullah, M. Humanized yeast to model human biology, disease and evolution. Disease Models & Mechanisms. 15 (6), (2022).
- Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).
- Dunham, M., Gartenberg, M., Brown, G. Methods in Yeast Genetics and Genomics. , Cold Spring Harbour Laboratory Press. Woodbury, New York. (2015).
- Skinner, S. O., Sepúlveda, L. A., Xu, H., Golding, I. Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization. Nature Protocols. 8 (6), 1100-1113 (2013).
- Tenreiro, S., Munder, M. C., Alberti, S., Outeiro, T. F. Harnessing the power of yeast to unravel the molecular basis of neurodegeneration. Journal of Neurochemistry. 127 (4), 438-452 (2013).
- Nielsen, J. Yeast systems biology: Model organism and cell factory. Biotechnology Journal. 14 (9), 1800421 (2019).
- Eleutherio, E., et al. Oxidative stress and aging: learning from yeast lessons. Fungal Biology. 122 (6), 514-525 (2018).
- Rencus-Lazar, S., DeRowe, Y., Adsi, H., Gazit, E., Laor, D. Yeast models for the study of amyloid-associated disorders and development of future therapy. Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 15 (2019).
- Franco, R., Rivas-Santisteban, R., Navarro, G., Pinna, A., Reyes-Resina, I. Genes implicated in familial Parkinson's disease provide a dual picture of nigral dopaminergic neurodegeneration with mitochondria taking center stage. International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4643 (2021).
- Wan, O. W., Chung, K. K. The role of alpha-synuclein oligomerization and aggregation in cellular and animal models of Parkinson's disease. PLoS One. 7 (6), 38545 (2012).
- Xu, L., Pu, J. Alpha-synuclein in Parkinson's disease: From pathogenetic dysfunction to potential clinical application. Parkinson's Disease. 2016, 1720621 (2016).
- Gitler, A. D., et al. The Parkinson's disease protein α-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).
- Sampson, T. R., et al. A gut bacterial amyloid promotes α-synuclein aggregation and motor impairment in mice. Elife. 9, 53111 (2020).
- Evans, M. L., et al. The bacterial curli system possesses a potent and selective inhibitor of amyloid formation. Molecular Cell. 57 (3), 445-455 (2015).
- Su, L. J., et al. Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models. Disease Models & Mechanisms. 3 (3-4), 194-208 (2010).
