In vivo Ca ^{2 +} - Imagem de Neurônios Corpo Mushroom durante o aprendizado olfativo no Honey Bee

Abelhas pode ser condicionado em um paradigma de aprendizado apetitivo olfativo (PER-condicionado). Usando odores como estímulos, estabelecemos um método em que o comportamento é gravado simultaneamente imagens de cálcio é usado para medir a atividade do odor evocado nos neurônios do corpo de cogumelo

Este procedimento começa com a fixação da abelha em uma câmara de gravação. Um pedaço de cutícula é removido da cápsula da cabeça para manchar estruturas selecionadas no cérebro. Os sinais de cálcio nos neurônios corados são registrados in vivo usando uma configuração de imagem de campo amplo.

Durante a imagem, a abelha pode ser estimulada com odores ou entrega de sacarose à antena. Dessa forma, a abelha pode ser condicionada a estender a tromba em resposta a um odor. A resposta de extensão da probóscide é monitorada usando registros de eletromiograma do músculo M 17.

Após o experimento de imagem, o cérebro é dissecado para uma investigação mais detalhada das estruturas coradas usando um microscópio confocal. Olá, sou Melanie do laboratório de rdo Mansel. Olá, sou Anya também do Mansel Lab.

Hoje mostraremos um procedimento para imagens de cálcio in vivo e o corpo do cogumelo das abelhas. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar a codificação olfativa e a plasticidade relacionada ao aprendizado no cérebro das abelhas. Então vamos começar.

Comece pegando uma abelha forrageira na entrada da colmeia e, em seguida, imobilize-a resfriando-a no gelo. Em seguida, monte a abelha em uma câmara de gravação de plexiglass. Use cera dura de baixo ponto de fusão para fixar os olhos e o tórax na parede.

Todos quebram um capilar de vidro na ponta para obter um diâmetro de 10 mícrons. Cubra a ponta do capilar com pasta d consistindo de uma mistura de 10 para um de dextrina URA dois e dextrina Rodin fixável. O capilar preparado será usado para coloração.

Para iniciar o procedimento de coloração, primeiro imobilize as antenas com um koane. Abra a cápsula da cabeça acima do cérebro removendo um pedaço de cutícula e empurrando as glândulas e a traqueia para os lados, permitindo o acesso ao corpo do cogumelo. Use um pedaço de papel para absorver a hemolinfa dentro da cápsula da cabeça.

Para corar os neurônios do corpo do cogumelo, injete o capilar no soma ou na região dendrítica dos neurônios. Em seguida, restaure a parte da cutícula na cápsula da cabeça e solte a antena. Por fim, alimente a abelha com solução de sacarose a 30% e guarde-a em uma caixa de isopor coberta com um pano de prato úmido por pelo menos quatro horas ou durante a noite a 20 graus Celsius.

Com a preparação B concluída, podemos começar a imagem in vivo. Para começar, use uma esponja presa à câmara de gravação para evitar que a abelha se mova, pressionando-a contra o abdômen. Agora fixe as antenas da abelha com um ioane para evitar que o cérebro se mova devido ao bombeamento do esôfago.

Faça uma pequena incisão na cutícula acima do lábio e retire cuidadosamente o esôfago e suas estruturas sólidas circundantes e cubra-as com dois componentes: silicone. Em seguida, use uma agulha para fazer orifícios para a inserção de eletrodos de fio usados para registrar eletrogramas do músculo transferidor do lábio. Remova o pedaço da cutícula, traqueia e glândulas acima do cérebro.

Use um pedaço de papel para absorver o hemograma dentro da cápsula da cabeça para registrar eletrogramas de M 17. Injete um fio de cobre no músculo perto das partes da boca. Injete um eletrodo de aterramento no olho.

Agora encha a cápsula da cabeça com silicone de dois componentes. Certifique-se de que o cérebro esteja completamente coberto. Coloque a abelha no microscópio e coloque uma gota de água na superfície do silicone.

Mergulhe a objetiva de mergulho do microscópio na gotícula e, em seguida, concentre-se nos neurônios do palco. Com a preparação para imagens in vivo concluída, agora podemos descrever a estimulação de odores e a gravação de sinais. Para fornecer estímulos de odor à abelha, usamos um olfatômetro personalizado controlado por computador para diluir os odores em uma corrente de ar constante.

Direcionado à antena, a estimulação do odor consiste em um pulso de três segundos de ar saturado de odor. Para imagens de cálcio, usamos uma configuração de imagem fotônica til montada em um microscópio fluorescente zes para registrar imagens em temperatura ambiente com uma taxa de amostragem de cinco hertz. Os sinais de cálcio são registrados através de uma objetiva de mergulho X 60 0,9 W Olympus com câmera Ango CCD, cada medição dura 10 segundos.

Os potenciais musculares são amplificados com um amplificador de grama e gravados e digitalizados com um conversor digital analógico. As gravações de M 17 são usadas para monitorar as respostas comportamentais relacionadas ao aprendizado com o registro de sinal completo, podemos agora passar para a análise morfológica e reconstrução. Porque ambos os corantes usados durante o aterro têm o mesmo peso molecular.

Eles estão co-localizados nos neurônios. A imagem de campo amplo tem resolução espacial limitada, por isso usamos microscopia de varredura confocal para investigar as estruturas coradas. Após o experimento, primeiro disseque o cérebro e fixe-o durante a noite em 4% de formaldeído a quatro graus Celsius no dia seguinte, enxágue-o em PBS e depois desidrate-o em etapas de etanol 10 minutos em 50% 70% 90% 99% e duas vezes 10 minutos em 100% Coloque o cérebro em uma lâmina de objeto ranhurado com uma gota de cobertura de salicilato de metila, Deslize-o e coloque-o no microscópio stage de um microscópio de varredura confocal.

Escaneie o cérebro com uma lente objetiva de ar e um zoom digital de 1,1 a 1,2 em seções ópticas de quatro micrômetros. Aqui vemos a resposta dos neurônios extrínsecos do corpo do cogumelo à estimulação do odor das antenas gravada através de uma objetiva de 60 x e visualizada em cores falsas. O quadrado vermelho à esquerda representa a persistência do estímulo de odor.

Após o experimento, o cérebro é dissecado e as estruturas da mancha são investigadas com mais detalhes usando um microscópio confocal com aumento de 20x. Então, acabamos de mostrar como visualizar os neurônios do corpo do cogumelo na abelha durante o aprendizado olfativo. Ao fazer este procedimento, é importante lembrar que experimentos envolvendo corantes sensíveis à luz devem ser realizados no escuro.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos. Até logo.