在体内的Ca ^{2 +} -蜜蜂的嗅觉学习期间的蘑菇体神经元的成像

蜜蜂可以调节食欲嗅觉学习范式（每空调）。作为刺激的气味，我们建立了一个行为记录的同时，钙成像是用来衡量蘑菇体神经元的气味诱发活动的方法

此过程首先将蜜蜂固定到记录室中。从头囊中取出一块角质层，以对大脑中的选定结构进行染色。使用宽场成像装置在体内记录染色神经元中的钙信号。

在成像过程中，蜜蜂可以受到气味或蔗糖输送到天线的刺激。这样，蜜蜂可能会受到异味的影响而伸展长鼻。使用 M 17 肌肉的肌电图记录监测长鼻伸展反应。

成像实验后，解剖大脑以使用共聚焦显微镜更仔细地研究染色结构。大家好，我是来自 rdo Mansel 实验室的 Melanie。嗨，我是 Anya，也是来自 Mansel 实验室的。

今天我们将向您展示体内钙成像和蜜蜂蘑菇体的程序。我们在实验室中使用该程序来研究蜜蜂大脑中的嗅觉编码和学习相关的可塑性。那么让我们开始吧。

首先在蜂巢入口处捕捉蜜蜂觅食者，然后通过在冰上冷却来固定它。接下来，将蜜蜂安装到有机玻璃记录室上。使用低熔点硬蜡将眼睛和胸部固定在墙上。

所有这些都在尖端打破玻璃毛细管以获得 10 微米的直径。用 d 糊状物覆盖毛细管的尖端，该糊状物由 URA 两种糊精和可固定的 Rodin 糊精的 10 比 1 混合物组成。准备好的毛细管将用于染色。

要开始染色程序，首先用 koane 固定触角。通过去除一块角质层并将腺体和气管推到两侧，打开大脑上方的头囊，以便进入蘑菇体。用一张纸吸收头囊内的血淋巴液。

要对蘑菇体神经元进行染色，请将毛细管注射到神经元的胞体或树突区域。然后恢复头囊上的角质层片并松开天线。最后，用 30% 蔗糖溶液喂蜜蜂，并将其存放在覆盖有湿厨房毛巾的聚苯乙烯泡沫塑料盒中至少四个小时或在 20 摄氏度下过夜。

B 制备完成后，我们可以开始体内成像。首先，使用附在记录室上的海绵防止蜜蜂移动，将其压在腹部。现在用 ioane 固定蜜蜂的触角，以防止大脑因食道抽动而移动。

在盂唇上方的角质层上切一个小切口，小心地拉出食道及其周围的固体结构，并用两种成分硅胶覆盖它们。接下来，用针打孔，插入用于记录来自阴唇量角肌的电图的线电极。去除大脑上方的角质层片、气管和腺体。

用一张纸吸收头囊内的血液，记录 M 17 的电图。将铜线注射到靠近口器的肌肉中。将接地电极注入眼睛。

现在用双组分硅胶填充头部胶囊。确保大脑被完全覆盖。将蜜蜂放在显微镜载物台上，并在硅胶表面滴一滴水。

将显微镜的浸入物镜浸入液滴中，然后聚焦于载物台神经元。随着体内成像的准备工作完成，我们现在可以描述气味刺激和信号记录。为了向蜜蜂提供气味刺激，我们使用计算机控制的定制嗅觉计将气味剂稀释到恒定的气流中。

针对天线的气味刺激由三秒的气味饱和空气脉冲组成。对于钙成像，我们使用安装在 zes 荧光显微镜上的 til 光子学成像装置在室温下以 5 赫兹的采样率记录图像。钙信号通过带有 Ango CCD 相机的 X 60 0.9 W 奥林巴斯浸入物镜记录，每次测量持续 10 秒。

肌肉电位用草放大器放大，并用模拟数字转换器记录和数字化。来自 M 17 的记录用于监测与学习相关的行为反应信号记录完成后，我们现在可以继续进行形态学分析和重建。因为回填过程中使用的两种染料具有相同的分子量。

它们在神经元中位于同一位置。宽场成像的空间分辨率有限，因此我们使用共聚焦扫描显微镜来研究染色结构。实验结束后，先解剖大脑，第二天在4°C的4%甲醛中固定过夜，用PBS冲洗，然后在乙醇中脱水，步骤50%70%90%99%10分钟，100%2次10分钟，将大脑放在有凹槽的物体载玻片上，用一滴水杨酸甲酯覆盖， 将其滑入，然后将其放在共聚焦扫描显微镜的显微镜载物台上。

使用空气物镜和 4 微米光学切片的 1.1 至 1.2 数字变焦扫描大脑。在这里，我们看到蘑菇体外源神经元对触角气味刺激的反应，通过 60 倍物镜记录并以伪色可视化。左侧的红色方块表示气味刺激的持续存在。

实验结束后，解剖大脑，并使用 20 倍放大倍率的共聚焦显微镜更详细地研究染色结构。因此，我们刚刚向您展示了如何在嗅觉学习期间对蜜蜂中的蘑菇体神经元进行成像。执行此程序时，请务必记住，涉及光敏染料的实验必须在黑暗中进行。

就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。再见。