Name: 在体内的Ca 2 + -蜜蜂的嗅觉学习期间的蘑菇体神经元的成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: 学习在蜜蜂嗅觉学习期间使用钙成像技术记录蘑菇体神经元的体内活动。该方法结合气味刺激和喙伸反应监测，为研究昆虫学习与记忆的神经机制提供了可靠的实验手段。

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本工作由德国研究基金会（DFG）资助。

蜜蜂准备与回填
<ol>
<li>在蜂巢处捕捉蜜蜂采集蜂，并用冰块冷藏使其 immobilization（固定）。</li>
<li>将蜜蜂固定于 Plexiglas 记录室3中，用低熔点硬蜡将复眼和胸部固定在记录室壁上。</li>
<li>使用常规电生理实验所用的玻璃毛细管，将其拉制后在尖端折断，使尖端直径约为 10μm。用染料糊覆盖毛细管尖端，染料糊由 Fura-2 dextran 与可固定赖氨酸的四甲基罗丹明葡聚糖按 10:1 比例混合而成。</li>
<li>染色过程中，用微量操作针或正二十烷固定触角；移除脑上方的一小片体壁，将腺体和气管移向一侧，以暴露蘑菇体区域。</li>
<li>将毛细管插入蘑菇体神经元的胞体或轴突区域，可手动操作或使用显微操作器完成。随后将体壁碎片复位，并松开触角。</li>
<li>在将蜜蜂置于 20°C 的湿润环境中孵育至少 4 小时或过夜前，喂食 30% 蔗糖溶液。</li>
</ol>
活体成像
<ol>
<li>使用一小块海绵压住蜜蜂的腹部，并用夹子或胶带将其固定在记录室中，以防止蜜蜂移动。</li>
<li>为防止食道搏动引起脑部移动，可在上唇上方的体壁上切一小切口，小心地将食道及其周围固态结构拉出，使其处于张力状态但不损伤食道4。随后用双组分硅胶覆盖。</li>
<li>用针刺出小孔，并插入导线电极以记录M17神经元活动。</li>
<li>去除脑部上方的体壁、气管和腺体组织。用一小片纸吸除头壳内的血淋巴。</li>
<li>用双组分硅胶填充头壳，确保脑组织被完全覆盖。</li>
<li>将蜜蜂置于显微镜载物台上，在硅胶表面滴加一滴水，使显微镜的浸水物镜浸入液滴中。聚焦于已染色的神经元。</li>
</ol>
气味刺激与信号记录
嗅觉仪：我们使用一种由计算机控制、自行搭建的刺激装置，即“嗅觉仪”，其设计如 Galizia 和 Vetter3 之前所述。气味被稀释后送入持续的气流中，并定向吹向触角。任何刺激均由持续3秒、体积为0.2 mL的气味饱和空气脉冲组成。刺激程序可在记录软件 TILLVision 中设置。 显微镜与成像系统：我们使用蔡司荧光显微镜。通过安装在显微镜上的TILL-Photonics成像设备，在25°C下以5 Hz的采样率进行图像采集。钙信号通过X60、0.9 W的奥林巴斯浸水物镜和Imago CCD相机（640×480像素，芯片上4倍二值化合并为160×120像素）记录。使用340 nm和380 nm单色光激发Fura-2，进行比率测量。荧光信号经410 nm二向色镜和440 nm长通滤光片检测。记录参数在记录软件中设定。每次测量持续10秒，两种波长的曝光时间可根据每份样本的染色强度进行调整。 M17记录：通过细胞外记录唇部缩肌（M17）以监测与学习相关的行为反应，即 PER5,6。将铜丝电极插入靠近口器的肌肉中，接地电极插入复眼。肌肉电位通过自行搭建的前置放大器放大，经数字化后存储于计算机中。刺激开始由嗅觉仪触发。
数据分析
<ol>
<li>实验过程中：钙信号的记录数据被输入计算机并存储。记录软件 TILLVision 可对信号进行初步分析，例如计算不同波长（340nm/380nm）之间的比值，以及计算 deltaF（减去基线信号）。</li>
<li>图像处理使用 IDL 编写的自定义程序完成。对每个像素点，计算来自 340nm 和 380nm 测量的 Ca2+ 信号比值。通过在刺激前的帧中取平均值确定背景荧光（F），并从比值信号中减去该背景值（deltaF）。</li>
<li>定义感兴趣区域（ROI）：计算刺激期间各帧的平均值，并应用低通滤波（3×3 像素）。将灰度图像转换为伪彩色图像。在伪彩色图像中识别神经结构中的活性区域作为活性斑点，并将其定义为 ROI。</li>
<li>通过在所有帧中对 ROI 内的像素取平均值（不进行任何滤波或校正），计算活性区域的时间动态变化。</li>
</ol>
形态学分析与重建
我们使用可固定的染料罗丹明葡聚糖（“mini ruby”）与 Fura-2 葡聚糖共同填充神经元。两种染料的分子量相同，应在神经元内共定位。宽场成像的空间分辨率非常有限，因此建议在实验后使用共聚焦扫描显微镜观察染色结构。
<ol>
<li>生理学测量后，解剖脑组织并进行固定。</li>
<li>用 PBS 冲洗，再用乙醇逐步脱水，并在水杨酸甲酯中透明处理。</li>
<li>为进行共聚焦显微镜观察，将脑组织包埋于水杨酸甲酯中。</li>
<li>我们使用 Leica TCS SP2 显微镜，激发波长为 543 nm。</li>
<li>使用干镜或油镜扫描脑组织，并将染色结构与成像数据进行比较。</li>
</ol>
代表性结果：
如果染色和制备成功，在蘑菇体α叶的外在神经元中，假彩色标度下的信号可能如图1所示。 行为反应（PER）可通过刺激期间的脉冲频率减去刺激前的脉冲频率来计算（图2）。 可使用共聚焦显微镜对染色的结构进行更详细的观察（图3）。
<img src="/files/ftp_upload/1353/figure1_new.png" alt="神经成像装置；荧光区域；脑活动分析；感觉反应图；刺激" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 图1： 钙成像信号的代表性结果（以庚醛进行刺激）。A：蜜蜂脑部的成像区域。B：通过20倍浸入式物镜在380 nm激发波长下观察到的原始荧光图像，蘑菇体的α叶以紫色轮廓标出。染料被注射至α叶腹外侧边缘，以标记外在神经元。C：在三秒刺激期间，由平均信号deltaF（340/380）生成的伪彩色图像；α叶以紫色标出，选定的兴趣区域（ROI）以黑色标出。D：对气味刺激响应的钙信号时间动态变化，信号来自C图中标示的兴趣区域的平均值。E：对蔗糖刺激同侧与对侧触角响应的钙信号时间动态变化，兴趣区域同C图所示。
<img src="/files/ftp_upload/1353/figure2_new.png" alt="昆虫触角反应图，气味暴露，电生理学，感觉信号分析。" data-altupdatedat="1787630408000"> 图 2： 典型的 M17 反应。嗅觉条件化后，当气味在无奖励的情况下呈现时，蜜蜂会伸出口器。红线表示气味刺激。插图：蜜蜂的口器伸展反应（PER）。
<img src="/files/ftp_upload/1353/figure3_new.png" alt="神经组织切片显微镜图像；细胞结构分析；比例尺 100µm。" data-altupdatedat="1787630408000"> 图3： 代表性图像堆栈。成像实验后，解剖脑组织。使用20倍油镜物镜的共聚焦显微镜扫描图1中的神经元，紫色轮廓标出α叶。

<ol><li>Joerges, J., Küttner, A., Galizia, C. G., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Representations+of+odors+and+odor+mixtures+visualized+in+the+honeybee+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Representations of odors and odor mixtures visualized in the honeybee brain.</a> Nature. 387 (6630), 285-288 (1997).</li>
<li>Rehder, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+the+honeybee%27s+proboscis+reflex+by+electromyiographic+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantification of the honeybee's proboscis reflex by electromyiographic recordings.</a> J. Insect Physiol. 33, 501-507 (1987).</li>
<li>Galizia, C. G., Vetter, R. S. Optical Methods for Analyzing Odor-Evoked Activity in the Insect Brain. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGalizia%2C+CG+%22Methods+in+Insect+Sensory+Neuroscience%22">Methods in Insect Sensory Neuroscience</a>. Christensen, T. A. , CRC Press. Boca Raton. 345-388 (2004).</li>
<li>Mauelshagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+correlates+of+olfactory+learning+paradigms+in+an+identified+neuron+in+the+honeybee+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Neural correlates of olfactory learning paradigms in an identified neuron in the honeybee brain.</a> J Neurophysiol. 69 (2), 609-625 (1993).</li>
<li>Kuwabara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bildung+des+bedingten+Reflexes+von+Pavlovs+Typus+bei+der+Honigbiene+Apis+mellifica%2C+Hokaido+Univ%5BTitle%5D)+AND+%22Zool.+J.+Sci%22%5BJournal%5D)">Bildung des bedingten Reflexes von Pavlovs Typus bei der Honigbiene Apis mellifica, Hokaido Univ.</a> Zool. J. Sci. 13, 458-464 (1957).</li>
<li>Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schafer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+conditioning+of+proboscis+extension+in+honeybees+%28Apis+mellifera%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Psychology%22%5BJournal%5D)">Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera.</a> Journal of Comparative Psychology. 97 (2), 107-119 (1983).</li>
</ol>

在本演示中，我们已逐步介绍了开展研究所需的全部步骤 体内 蜜蜂中的钙信号。我们将该技术应用于蘑菇体神经元，但只要建立相应的染色方法，该成像技术也可用于所有类型的神经元。本研究重点关注蜜蜂嗅觉通路中的神经元。所有实验均在暗室中进行，实验装置采用长波长光源照明，该光源处于蜜蜂视觉感知范围之外，且不会激发所使用的染料。必须避免任何可能的荧光伪影，例如硅胶中的气泡。
该系统的主要优势之一是能够以空间和时间分辨率采集神经元活动的相关信息。同时，我们还可以在蜜蜂表现出相关行为时进行观察，例如在研究与学习相关的神经可塑性时。然而，其空间和时间分辨率仍存在一定的局限性。in vivo 钙成像实验的时间受到限制。与细胞外电生理记录方法（可持续数小时甚至数天）不同，我们的实验时间大约仅限于90分钟。当以5 Hz的采样率、采用两种激发波长进行85次测量时，每次测量持续10秒，340 nm曝光时间为20 ms，380 nm曝光时间为5 ms，信号质量仍然较为理想。此后，荧光染料漂白可能成为问题。

<table><tbody><tr><td>低熔点硬蜡 Deiberit 502</td><td>Dr. B&amp;#246;hme Sch&amp;#246;ps Dental GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FURA-2 葡聚糖钾盐，分子量 10 000</td><td>Invitrogen</td><td>F-3029</td><td>避光保存。</td></tr><tr><td>四甲基罗丹明葡聚糖，分子量 10 000</td><td>Invitrogen</td><td>D-3312</td><td>避光保存。</td></tr><tr><td>正二十烷（n-eicosane）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21, 927-4</td><td></td></tr><tr><td>Kwik Sil 粘合剂</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>KWIK SIL</td><td></td></tr><tr><td>成像系统</td><td>TILL Photonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD 相机</td><td>Imago</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CED</td><td>Texas Instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

在体 ca2+ 成像观察蜜蜂嗅觉学习过程中蘑菇体神经元的活动

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

本实验室十余年前由 Joerges、Küttner 和 Galizia 建立了用于钙成像的 in vivo 和 semi-in vivo 制备方法，以检测触角叶中由气味诱发的神经活动1。此后，该方法被持续优化，并应用于蜜蜂脑中的不同神经节。本文描述了目前实验室用于检测蘑菇体神经元活性的制备方法，采用与葡聚糖偶联的钙敏感性染料（Fura-2）。我们通过将染料注射到蘑菇体神经元的轴突或胞体区域，实现逆行标记。本方法着重降低侵入性，以确保蜜蜂仍可用于基于伸吻反射（PER）的条件化训练。我们通过记录控制伸吻反射的肌肉（M17）的肌电图，实现对行为反应的监测与量化2。
生理实验后，利用共聚焦扫描显微镜对成像结构进行更详细的观察，以确定神经元的身份。

蜜蜂可通过 appetitive 嗅觉学习范式（PER-conditioning）进行条件化训练。利用气味作为刺激，我们建立了一种方法，在记录行为的同时，结合钙成像技术检测蘑菇体神经元中由气味诱发的神经活动。 体内.

在体 Ca2+ 成像观察蜜蜂嗅觉学习过程中蘑菇体神经元的活动

我们实验室的 Joerges、Küttner 和 Galizia 十多年前开发了用于钙成像的活体及半活体样本制备方法，以……

该实验首先将蜜蜂固定在记录室中。从头壳上移除一块体壁，以对脑内特定结构进行染色。利用宽场成像系统，在活体状态下记录染色神经元中的钙信号。成像过程中，可通过向触角传递气味或蔗糖刺激蜜蜂。通过这种方式，可训练蜜蜂在气味刺激下伸展喙。利用来自M 17肌肉的肌电图记录来监测喙伸展反应。成像实验结束后，将脑组织解剖下来，以便使用共聚焦显微镜对染色结构进行更深入的观察。大家好，我是曼塞尔实验室的Melanie。大家好，我也是来自曼塞尔实验室的Anya。今天，我们将向您展示一种在活体蜜蜂蘑菇体中进行钙成像的实验方法。我们实验室利用该方法研究蜜蜂大脑中与嗅觉编码及学习相关可塑性的机制。现在，让我们开始吧。首先在蜂巢入口处捕捉一只采集蜂，然后将其置于冰上冷却以使其固定。接着，将蜜蜂固定在有机玻璃记录室中。使用低熔点硬蜡将蜜蜂的复眼和胸部固定在壁上。将玻璃毛细管的尖端折断，以获得10微米的直径。用由URA2葡聚糖与可固定罗丹明葡聚糖按10:1比例混合而成的糊状物覆盖毛细管尖端。制备好的毛细管将用于染色。开始染色程序时，首先用一根细针固定触角。通过移除一小块表皮并将其腺体和气管推向两侧，打开脑部上方的头壳，以暴露蘑菇体。使用一小片滤纸吸除头壳内部的血淋巴。为了染色蘑菇体神经元，将毛细管插入神经元的胞体或树突区域。然后将头壳上的切开的表皮复位，并松开触角。最后，用30%蔗糖溶液喂食蜜蜂，并将其置于覆盖湿厨房纸巾的泡沫箱中，在20摄氏度下孵育至少4小时或过夜。完成B的准备工作后，我们便可开始活体成像。首先，使用连接在记录室上的海绵，将其轻轻压在蜜蜂的腹部，以防止蜜蜂移动。接着，用碘烷固定蜜蜂的触角，以防止因食道泵动导致脑部移动。在上唇基部的外骨骼上方切开一个小切口，小心地拉出食道及其周围固体结构，并用双组分硅胶覆盖。接着，使用针头打孔，以便插入用于记录下唇伸肌肌肉电图的导线电极。去除脑部上方的外骨骼碎片、气管和腺体。使用一张纸吸收头壳内的血淋巴，以记录 M 17 的肌电图。将一根铜丝插入靠近口器的肌肉中。将接地电极插入复眼中。现在用双组分硅胶填充头囊，确保大脑完全被覆盖。将蜜蜂放置在显微镜载物台上，并在硅胶表面滴加一滴水。将显微镜的浸水物镜浸入液滴中，然后聚焦于神经元。体内成像的准备工作完成后，接下来描述气味刺激和信号记录过程。为了向蜜蜂递送气味刺激，我们使用由计算机控制的自制嗅觉仪，将气味物质稀释到恒定的气流中。针对触角的气味刺激由持续三秒的饱和气味空气脉冲组成。进行钙成像时，我们采用安装在ZES荧光显微镜上的Ti:sapphire光子成像系统，在室温下以每秒五赫兹的采样率记录图像。钙信号通过X 60 0.9 W Olympus水浸物镜和Andor CCD相机采集，每次测量持续10秒。肌肉电位通过蛙肌放大器进行放大，并使用模数转换器进行记录和数字化。M 17 的记录用于监测与学习相关的行为反应。信号记录完成后，我们现在可以继续进行形态学分析和重建。因为逆行标记过程中使用的两种染料具有相同的分子量。它们在神经元中共定位。宽场成像的空间分辨率有限，因此我们使用共聚焦扫描显微镜来观察染色结构。实验结束后，首先解剖脑组织，并在4%甲醛溶液中4摄氏度下固定过夜；次日用PBS缓冲液冲洗，随后依次用50%、70%、90%、99%乙醇梯度脱水，每次10分钟，再用100%乙醇处理两次，每次10分钟。将脑组织置于带有凹槽的载物片上，滴加水杨酸甲酯，盖上盖玻片，然后将其放置于共聚焦扫描显微镜的载物台上进行观察。使用空气物镜和1.1至1.2倍的数字变焦，以4微米的光学切片扫描大脑。此处我们观察到通过60倍物镜记录并以伪彩显示的触角气味刺激下蕈形体外在神经元的反应。左侧的红色方框表示气味刺激的持续存在。实验结束后，解剖大脑，并在20倍放大条件下使用共聚焦显微镜进一步详细观察染色结构。以上我们已向您展示了如何在蜜蜂嗅觉学习过程中对蘑菇体神经元进行成像。进行该操作时，需注意涉及光敏性染料的实验必须在避光条件下进行。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利。再见。

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