Name: Indução toxina e Extração de Proteínas de Fusarium Spp. Culturas de Estudos Proteômica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-16T15:05:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Aprenda a induzir toxinas e extrair proteínas de Fusarium spp. para estudos proteômicos seguindo diretrizes MIAPE. Este protocolo padronizado minimiza vieses experimentais e garante amostras de alta qualidade para análises confiáveis.

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Agradecemos a Servane Contal e Boris Untereiner por sua contribuição técnica. Agradecemos o apoio da FNR &quot;FUTOX&quot; do projeto.

O protocolo exige que 16 dias para sua conclusão. O prazo é detalhado na figura 1. Detalhes para a preparação de buffer <ul><li> Preparação do tampão de lise (3mL por amostra). </li><li> Preparação do tampão de lavagem (50 ml por amostra). Esta reserva deve ser pré-refrigerados e armazenados a -20 ° C no freezer até análise mais aprofundada e mantidos em gelo durante todo o procedimento. </li><li> Preparação do tampão de precipitação (20 mL por amostra). Esta reserva deve ser pré-refrigerados e armazenados a -20 ° C no freezer até que seja necessário e mantidos em gelo durante todo o procedimento. </li><li> O trabalho deve preferencialmente ser realizado em câmara fria a 4 ° C. </li></ul> Espécies de fungos Três cepas utilizadas para análises proteômicas foram classificadas a Fusarium graminearum, com base em suas características morfológicas e Tradução Alongamento-Alpha-1 fator de análise (O'Donnell et al., 1998) Essas cepas pertenciam à coleção Lippmann CRP-Gabriel e foram mantidos e armazenados a - 80 ° C em 15% de glicerol. Preparação dos micélios Fungos foram cultivados em V8 de 4 dias a 25 ° C alternadas período de claro e escuro a cada 12 hrs. Culturas foram fragmentados utilizando uma lâmina estéril e peças dessas culturas foram utilizadas para inocular balões de 250 ml Erlenmeyer contendo 100 mL da toxina induzindo-media. Micélios foram colhidas após 10 dias e foram separados do meio por filtração a cultura com um filtro estéril. Micélios foram lavadas 3 vezes com água estéril para remover resíduos de médio e outros compostos. Em seguida, imediatamente congelou as células pela adição de nitrogênio líquido e mantidas as amostras a -80 ° C. Descrição geral da extração de proteínas Amostras de proteínas foram extraídas com o método descrito na figura 3A e 3B. As amostras de Fusarium foram moídas em nitrogênio líquido eo pó foram recolhidos em 10 ml tubos de Teflon. As amostras foram então incubadas 30 minutos com o tampão de lise, cozidos por 10 minutos, e centrifugado duas vezes a temperatura ambiente (12000g por 15 minutos). Os sobrenadantes foram coletados e incubados a -20 ° C com tampão de precipitação durante a noite. Após centrifugação a 4 ° C 30000g por 45 minutos, as bolinhas das proteínas precipitadas foram lavadas três vezes com acetona gelada contendo DTT. Finalmente, as pelotas foram secas ao ar e as proteínas foram ressolubilizam no buffer de rotulagem, ajustando o pH a 8. A sub-amostra de 30 ml foi removido para a quantificação de proteínas totais eo sobrenadante restante foi armazenado a -20 ° C até eletroforese de proteínas. <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Timeline do procedimento. <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Esquema para múltiplos operadores de processamento de amostra. <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig3atmb.jpg" alt="Figura 3a" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3a"> Figura 3a. <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig3btmb.jpg" alt="Figura 3b" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3b"> Figura 3b. Por favor, <a href="/files/ftp_upload/1690/1690fig3a.jpg">clique aqui</a> para ver uma versão ampliada da figura 3a, ou <a href="/files/ftp_upload/1690/1690fig3b.jpg">aqui</a> para uma versão ampliada da figura 3b. Figuras 3a-b Fluxogramas para o procedimento de extração de proteínas (A: primeiro dia; B: segundo dia).. <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig4tmb.jpg" alt="Figura 4" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. 1D imagem de extratos de proteína. Proteínas foram executados até a migração completa do azul para o final do gel que foi manchada com roxo lava. Por favor, <a href="/files/ftp_upload/1690/1690fig4.jpg">clique aqui</a> para ver uma versão ampliada da figura 4.

<ol><li>Bridge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Extraction+from+Fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Purification+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protein Extraction from Fungi.</a> Protein Purification Protocols. , 39-48 (1996).</li>
<li>Jiao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+different+carbon+sources+on+trichothecene+production+and+Tri+gene+expression+by+Fusarium+graminearum+in+liquid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Effects of different carbon sources on trichothecene production and Tri gene expression by Fusarium graminearum in liquid culture.</a> FEMS Microbiol Lett. 285, 212-219 (2008).</li>
<li>Kim, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+of+filamentous+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Proteomics of filamentous fungi.</a> Trends in Biotechnology. 25, 395-400 (2007).</li>
<li>Milles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+proteomic+approach+to+monitor+protein+synthesis+in+mycotoxin+producing+moulds%5BTitle%5D)+AND+%22Mycotoxin+Res%22%5BJournal%5D)">Development of a proteomic approach to monitor protein synthesis in mycotoxin producing moulds.</a> Mycotoxin Res. 23, 161-165 (2007).</li>
<li>Morrison, N., Field, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concept+of+sample+in+OMICS+technology%5BTitle%5D)+AND+%22OMICS%22%5BJournal%5D)">Concept of sample in OMICS technology.</a> OMICS. 10, 127-137 (2006).</li>
<li>O'Donnell, K., Kistler, H. C., Cigelnik, E., Ploetz, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+evolutionary+origins+of+the+fungus+causing+Panama+disease+of+banana%3A+Concordant+evidence+from+nuclear+and+mitochondrial+gene+genealogies%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: Concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies.</a> PNAS. 95, 2044-2049 (1998).</li>
<li>Paper, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomics+of+extracellular+proteins+in+vitro+and+in+planta+from+the+pathogenic+fungus+Fusarium+graminearum%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomics of extracellular proteins in vitro and in planta from the pathogenic fungus Fusarium graminearum.</a> Proteomics. 7, 3171-3183 (2007).</li>
<li>Pasquali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video+in+science.+Protocol+videos%3A+the+implications+for+research+and+society%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Video in science. Protocol videos: the implications for research and society.</a> EMBO Rep. 8, 712-716 (2007).</li>
<li>Taylor, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+minimum+information+about+a+proteomics+experiment+%28MIAPE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The minimum information about a proteomics experiment (MIAPE).</a> Nat Biotechnol. 25, 887-893 (2007).</li>
<li>Taylor, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analyses+of+Fusarium+graminearum+grown+under+mycotoxin-inducing+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analyses of Fusarium graminearum grown under mycotoxin-inducing conditions.</a> Proteomics. 8, 2256-2265 (2008).</li>
</ol>

Recente interesse em abordagens proteômicas no domínio da biologia de fungos levou a um aumento do número de publicações com essa técnica (como revistas em Kim et al., 2007). Métodos para a extração de proteínas dependem de uma combinação de procedimentos de extração, que são muitas vezes mal descritos nas seções metodológicas e requerem conhecimento especializado para lidar com os métodos de solução de problemas em potencial. Como para outros &quot;ómicas&quot; abordagens, estabelecendo normas para o processamento de amostras e dados é essencial a fim de gerar informações científicas confiáveis. Além disso as amostras e os procedimentos de manipulação devem ser adequadamente descritos de modo a permitir interpretação dos resultados compartilhados entre os diferentes &quot;ómicas&quot; experimentos. Isso seria essencial para a plena exploração do potencial cross-de mineração de dados em genômica, proteômica, metabolômica, ... (Morrison et al., 2006). Informações mínimas sobre um experimento proteômica foi elaborado e grupos de trabalho foram criados de forma a gerir todos os aspectos de uma experiência (de eletroforese em gel, Espectrometria de Massa, interações moleculares, modificações de proteínas, Informática Proteomics, o processamento da amostra). No momento nenhuma informação definida estão disponíveis em procedimentos de processamento da amostra. Dada a importância dos procedimentos de extração da proteína para determinar a qualidade final dos estudos de proteômica, a fim de implementar procedimentos que podem aumentar a padronização no âmbito das diretrizes MIAPE (Taylor et al., 2007), propusemos o uso de um protocolo de vídeo detalhando amostra processamento. Descrição do vídeo de experimentos pode contribuir substancialmente para aumentar o número de informações sobre o processamento da amostra, que pode resultar em melhor reprodutibilidade de &quot;ómicas&quot; experimentos (Pasquali, 2007). Na verdade, toda a reprodutibilidade laboratórios é um requisito fundamental para garantir a validade dos resultados proteômica (http://www.fixingproteomics.org). A reprodutibilidade cruz laboratório é influenciado por dois fatores: instrumentações diferentes e diferentes operadores manipulando as amostras. No protocolo descrito, propomos a realizar replica biológica envolvendo múltiplos operadores (Figura 2 e vídeo) para aumentar a confiabilidade dos dados (ou seja, variação da técnica dos resultados é levado em conta). O procedimento descrito para a extração de proteínas é baseado em SDS e aquecimento. Isto foi demonstrado anteriormente para garantir uma pureza e boa quantidade de proteínas (Bridge, 1996). SDS juntamente com ebulição dissolve as paredes das células, as proteínas hidrofóbicas e impede a formação de oligômeros que a precipitação de proteínas abortar. Ebulição permite também a inativação de proteases. O mesmo efeito é produzido também por EDTA, PMSF e inibidor da protease completa mini. TDT remove pontes dissulfeto e entre proteínas facilitando a solubilização da proteína. A fim de remover antes IEF SDS, as proteínas são precipitadas por acetona / TCA / TDT. Além disso, acetona / TCA / TDT precipitação permite remover alguns contaminantes, tais como lipídios, ácidos nucléicos, sais e / ou compostos fenólicos, quando estes compostos estão presentes. Como SDS, estas moléculas evitar uma migração bem durante IEF. Seguindo essa precipitação, é necessário lavar as proteínas precipitadas com acetona / DTT, a fim de remover TCA, pois ele pode interferir com IEF. A preparação da amostra boa é a chave para bons resultados. Para isso, é também essencial para evitar a contaminação de proteínas do ambiente de trabalho com luvas sem pó e respeitando as boas práticas laboratoriais. Do ponto de vista técnico, dentro do protocolo descrito, os passos mais críticos para obtenção de quantidades suficientes e pureza de proteínas são duas fases. Primeiro, a fase de moagem onde a destruição completa da célula é fundamental para a liberação de proteínas e, segundo, a purificação de proteínas totais, uma fase que engloba a remoção da maioria dos lipídios DNA, e outros contaminantes que possam interferir com a migração de proteínas.

Mídia e soluções PDA: 39 g Batata Dextrose Agar (Difco), 1 L de água destilada. V8 agar: 200 ml V8 (Campbell, EUA), 2g CaCO3 (Sigma), Agar 16g (DIFCO), 800 ml de água destilada Toxina mídia induzindo: 1g K 2 HPO 4, 0,5 g KCl, 0,5 g MgSO 4 7H 2 O, 10 mg FeEDTA, 2g L ácido glutâmico, sacarose 10g em 1L de água destilada. Tampão de Lise: <table border="1"><tr><td></td><td> 100mL </td><td> Concentração final </td><td></td></tr><tr><td> Tris-HCL PH8 </td><td> 5mL </td><td> 50mM </td><td> 1M </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 2g ou 10 ml </td><td> 2% </td><td> 20% </td></tr><tr><td> TDT </td><td> 500mL </td><td> 10mM </td><td> 2M </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 20mL </td><td> 0,1 mM </td><td> 0.5M </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> 200mL </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Inibidor da protease completa mini- </td><td> 1 comprimido </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Água </td><td> Qsp </td><td></td><td></td></tr></table> Tampão de precipitação: <table border="1"><tr><td></td><td> 100mL </td><td> Concentração final </td></tr><tr><td> TCA </td><td> 20mL </td><td> 20% </td></tr><tr><td> TDT </td><td> 0,1 ml </td><td> 0,1% </td></tr><tr><td> Acetona </td><td> Qsp </td><td></td></tr></table> Lavar Buffer: <table border="1"><tr><td></td><td> 100mL </td><td> Concentração final </td></tr><tr><td> TDT </td><td> 0,1 ml </td><td> 0,1% </td></tr><tr><td> Acetona </td><td> 100mL </td><td></td></tr></table> Rotulagem de buffer (armazenamento a -18 ° C em alíquotas pequenas): <table border="1"><tr><td></td><td> 1mL </td><td> Concentração final </td></tr><tr><td> Uréia </td><td> 140 mg </td><td> 7M </td></tr><tr><td> Tiouréia </td><td> 50 mg </td><td> 2M </td></tr><tr><td> CHAPS </td><td> 40 mg </td><td> 4% </td></tr><tr><td> Tris </td><td> 30 mL </td><td> 30 mM </td></tr><tr><td> Água </td><td> 1 mL </td><td></td></tr></table>

indução toxina e extração de proteínas de fusarium spp. culturas de estudos proteômica

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusaria são fungos filamentosos capazes de produzir toxinas diferentes. Micotoxinas Fusarium, como o desoxinivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, ácido fusárico, moniliformin, etc .. ter efeitos adversos na saúde humana e animal e alguns são considerados como fatores de patogenicidade. Estudos de proteômica mostrou-se eficaz para decifrar os mecanismos de produção de toxinas (Taylor et al., 2008), bem como para a identificação de fatores patogênicos em potencial (Paper et al. 2007, Houterman et al., 2007) em Fusaria. Torna-se, portanto, fundamental para estabelecer métodos confiáveis ​​para a comparação entre os estudos de proteômica, a fim de contar com verdadeiras diferenças encontradas na expressão da proteína entre os experimentos, as cepas e laboratórios. O procedimento que será descrito deverá contribuir para um maior nível de padronização de procedimentos proteômica de duas maneiras. O protocolo filmado é usado para aumentar o nível de detalhes que pode ser descrito com precisão. Além disso, a disponibilidade de procedimentos padronizados para processo biológico replica deve garantir uma maior robustez dos dados, tendo em conta também o fator humano dentro da reprodutibilidade técnica do processo de extração. O protocolo descrito requer 16 dias para sua conclusão: 14 dias para as culturas e dois dias para a extração de proteínas (figura 1). Resumidamente, Fusarium cepas são cultivadas em meios sólidos por 4 dias, pois eles são, então, manualmente fragmentado e transferido para uma mídia toxina modificada indução (Jiao et al, 2008.) Por 10 dias. Micélio é coletado por filtração através de uma camada Miracloth. Moagem é realizada em uma câmara fria. Diferentes operadores realizada extração de repetições (n = 3), a fim de ter em conta o viés devido a variações técnica (figura 2). Extração foi baseado em um tampão SDS / TDT conforme descrito em Taylor et al. (2008) com ligeiras modificações. Extração de proteína total necessário um processo de precipitação das proteínas com acetona / TCA / TDT tampão de lavagem durante a noite e acetona / TDT (figura 3a, 3b). Proteínas foram finalmente ressolubilizam no buffer de proteína rotulagem e quantificados. Resultados da extração foram visualizados em gel 1D (Figura 4, SDS-PAGE), antes de prosseguir para 2D géis (IEF / SDS-PAGE). O mesmo procedimento pode ser aplicado para análises proteômicas em outros suportes de cultura e outros fungos filamentosos (Miles et al., 2007).

Extração de proteínas para análise proteômica em espécies de fungos requer um alto nível de padronização a ser realizado de acordo com as informações mínimas sobre um experimento proteômica (MIAPE) orientações. Nós apresentamos um vídeo protocolo que inclui um procedimento para minimizar viés experimental durante a indução da toxina e extração de proteínas de<em&gt; Fusarium spp.</em

Indução toxina e Extração de Proteínas de Fusarium Spp. Culturas de Estudos Proteômica

Os Fusarium são fungos filamentosos capazes de produzir diferentes toxinas. Micotoxinas de Fusarium, tais como o deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearalenona, ácido fusárico, ...

Este vídeo descreve um procedimento utilizado para induzir a síntese de toxinas em algumas espécies, neste caso específico, e o protocolo para extração completa de proteínas empregado em estudos proteômicos no nosso laboratório. A duração do procedimento é de 16 dias: quatro dias para o crescimento fúngico, 10 dias para a síntese de toxinas e dois dias para a extração de proteínas. Após quatro dias, as colônias ainda estão em crescimento ativo em direção à borda da placa.O micélio aéreo típico é formado e coletado usando uma lâmina estéril dentro de uma cabine de fluxo laminar, raspando suavemente a superfície da placa. O micélio é cortado em cinco pedaços pequenos e adicionado a um frasco de cultura contendo 25 mililitros de meio indutor de toxinas. A indução de toxinas é mais eficiente do que a exposição à luz escura.O frasco é coberto com alumínio. Em seguida, as culturas são agitadas por 10 dias, a 150 rotações por minuto a 25 centígrados. O meio é SAPH e contém solução concentrada de S row.A cama, juntamente com a escuridão, é conhecida por facilitar a síntese de toxinas em ria. O micélio é então separado do líquido contendo toxinas por filtração em tecido MI close. O líquido pode ser usado para medir o teor de toxinas, enquanto o micélio é utilizado para a extração de proteínas.Para evitar arraste de meio, meu micélio é lavado três vezes com água estéril. A água em excesso deve ser eliminada posteriormente, então é adicionado nitrogênio líquido, e as amostras podem ser armazenadas a menos 80 ou usadas para extração de proteínas. O procedimento de extração de proteínas baseia-se no uso de SDS e TCA e consiste em diferentes etapas de lise.Ele propõe um método que envolve múltiplos operadores para realizá-lo. Ao mesmo tempo da extração de réplicas biológicas, um operador diferente realiza cada réplica. Este procedimento leva em consideração as diferenças no procedimento de extração que podem ser geradas por diferentes operadores que processam as réplicas.Portanto, deve apresentar maior robustez ao comparar réplicas biológicas, pois a variável operador está incluída na réplica. Ao mesmo tempo, o uso de múltiplos operadores reduz o tempo de processamento. A amostra é moída em um almofariz estéril utilizando nitrogênio líquido até que o micélio se torne um pó fino.Esta etapa é crucial para a qualidade e quantidade de proteínas. O micélio é coletado em tubos de teflon de 10 mililitros em uma proporção de quatro décimos do volume total dos tubos. Em seguida, é adicionado o tampão de lise contendo SDS e diferentes inibidores de protease.Os tubos são então agitados até que uma solução homogênea seja obtida. Em seguida, as amostras são agitadas por 30 minutos na câmara fria para posterior homogeneização; as amostras são fervidas para dissolver as paredes celulares e as proteínas hidrofóbicas. A presença de SDS impede a formação de oligômeros que interromperiam a precipitação das proteínas.Uma etapa de centrifugação separa três fases. As proteínas ficam suspensas na solução transparente, que é coletada em um novo tubo mantido sob gelo. A paleta é então usada para realizar uma segunda etapa de lise, repetindo a vórtex, fervura e centrifugação.O sobrenadante das duas lisas é combinado para realizar a precipitação com o tampão de precipitação glacial, contendo ácido acético, ácido tricloroacético e DTT. As amostras são então armazenadas durante a noite por 16 horas a -20 °C para permitir a precipitação das proteínas. As proteínas precipitadas se situam na parte inferior dos tubos para melhorar a precipitação.Os tubos são centrifugados em alta velocidade por 45 minutos. O pellet agora está bem visível. Os sobrenadantes podem ser descartados usando uma pipeta de cinco mililitros.O TCA é então removido pela adição de 25 mililitros do tampão de lavagem glacial contendo acetona e DTT. Em seguida, a mistura é agitada completamente e vigorosamente. Então, um novo passo de centrifugação é realizado.A palheta de proteína está agora flutuando, portanto, deve-se ter o cuidado de eliminar o resíduo. Um segundo passo de lavagem é realizado, adicionando o tampão de lavagem, agitação e centrifugação. O agente SUP é eliminado e a amostra é seca usando um speed bag.Quando a amostra estiver seca, a proteína terá consistência semelhante à de um pó. Para armazenamento, a proteína da amostra deve ser recolhida do tubo para reduzir a interferência eletrostática do plástico.Uma pistola eletrostática é utilizada e o pó proteico é coletado usando uma espátula de metal. As proteínas são então ressuspendidas diretamente no tampão de marcação. Utilizado para 2D – 30 minutos a 800 gramas por minuto.Suficiente para solubilizar. A proteína antes de prosseguir para a marcação 2D, que é cara. A qualidade da proteína é testada em gel unidimensional SDS-PAGE, conforme pode ser observado.A ausência de borras significativas na borda de uma faixa sugere uma boa qualidade da amostra.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Para estudar os processos de desenvolvimento de ascósporos em Gibberella zeae, um procedimento de coleta em condições estéreis é filmado de forma a gerar o maior nível de informação para a descrição do protocolo. Isso deve facilitar a reprodutibilidade do experimento, um aspecto crucial quando completa do genoma testes perfil de expressão são implementadas.

Gibberella zeae produção de ascósporos e Coleta de Experimentos de Microarray.

A devastação das culturas de cereais por fungos que infectam sementes de suscitou numerosos esforços de pesquisa para entender melhor planta-patógeno interações. Para estudar sementes de fungos interações em um ambiente de laboratório, nós desenvolvemos um método robusto para a quantificação de reprodução dos fungos, biomassa e contaminação por micotoxinas utilizando bioensaios de kernel.

Quantificação da colonização fúngica, esporogênese, e produção de micotoxinas Utilizando Bioensaios Kernel

Membros do género Burkholderia são patógenos de importância clínica. Nós descrevemos um método para extração de proteínas bacterianas, usando ruptura mecânica, e eletroforese em gel 2-D para a análise proteômica subseqüente.

Extração de proteínas e 2-D métodos Eletroforese em Gel de<em&gt; Burkholderia</em&gt; Espécies

Nós demonstramos um método para a análise de aflatoxinas e a expressão do transgene em sementes de amendoim que contêm sinais de ARN de interferência para silenciar genes aflatoxina-síntese no fungo Aspergillus flavus. Controlo mediada por ARNi de micotoxinas em plantas não foi reportado anteriormente.

Controle mediado por RNAi de aflatoxinas em amendoim: método para analisar a produção de micotoxinas e Transgene Expression na Amendoim /<em&gt; Aspergillus</em&gt; Patossistema

Aqui nós apresentamos um protocolo para análise de crescimento de Aspergillus flavus e produção de aflatoxinas em grãos de milho expressar uma proteína antifúngica.  Estamos usando uma estirpe de GFP-expressando a. flavus monitorado a infecção e a propagação do fungo em sementes maduras em tempo real. O ensaio é rápido, confiável e reprodutível.

Inibição do crescimento de Aspergillus flavus e produção de aflatoxina em milho transgénicos que expressar o inibidor de α-amilase de Lablab purpureus L.

O objetivo deste protocolo é detectar diferentes toxinotipos de Clostridium perfringens em alimentos adquiridos localmente, particularmente a toxina Epsilon produzindo tipos de estirpe B e D, sem o uso de câmaras anaeróbias.

Enriquecimento e detecção de toxinotipos de Clostridium perfringens em amostras de alimentos para varejo

Aqui, apresentamos um protocolo para traçar o perfil entre hospedeiro e patógeno durante a infecção por proteômica baseada em espectrometria de massa. Este protocolo usa quantificação livre de rótulos para medir mudanças na abundância de proteínas tanto do hospedeiro (por exemplo, macrófagos) quanto de patógenos (por exemplo, Cryptococcus neoformans) em um único experimento.

Fluxo de trabalho de proteômica quantitativa sem rótulo para interações de patógenos de host-pathogen orientadas para a descoberta

Aqui apresentamos um protocolo para a identificação rápida de proteínas produzidas por bactérias patogênicas genomicamente sequenciadas usando espectrometria de massa maldi-TOF-TOF e análise proteômica de cima para baixo com software desenvolvido internamente. Íons proteicos metastáveis fragmentom por causa do efeito ácido aspartic e essa especificidade é explorada para identificação de proteínas.

Identificação de Proteínas de Imunidade Antibacteriana em Escherichia coli usando MALDI-TOF-TOF-MS/MS e Análise Proteômica De Cima Para Baixo

Aqui apresentamos um protocolo baseado no sistema de isca mealworm (Tenebrio molitor)-isca que foi utilizado para isolar e selecionar fungos entomopatômicos (EPF) a partir de amostras de solo. Uma fórmula eficaz de número de conidia (ECN) é usada para selecionar EPF tolerante ao alto estresse com base em características fisiológicas para controle microbiano de pragas no campo.

Isolamento e Seleção de Fungos Entomopatômicos de Amostras de Solo e Avaliação da Virulência Fúngica contra Pragas de Insetos

Colônias fúngicas entomopatômicas são isoladas de amostras de solo tropical usando isca tenebrio , isca de Galleria , bem como meio artificial seletivo, ou seja, ágar de dextrose de batata enriquecido com extrato de levedura suplementado com clorofenicol, tiaabzolendae e ciclohexmida (meio CTC).

Comparação de métodos para isolar fungos entomopatômicos de amostras de solo

O presente artigo tem como objetivo fornecer protocolos detalhados e adequados para o isolamento de fungos endofíticos associados a plantas, preservação a longo prazo de isolados, caracterização morfológica e extração de DNA total para posterior identificação molecular e análises metagenômicas.

Isolamento, caracterização e extração de DNA total para identificação de fungos endofíticos em plantas micoheterotróficas

Aprenda a induzir toxinas e extrair proteínas de Fusarium spp. para estudos proteômicos seguindo diretrizes MIAPE. Este protocolo padronizado minimiza vieses experimentais e garante amostras de alta qualidade para análises confiáveis.

Indução toxina e Extração de Proteínas de Fusarium Spp. Culturas de Estudos Proteômica

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