Indução toxina e Extração de Proteínas de Fusarium Spp. Culturas de Estudos Proteômica

Extração de proteínas para análise proteômica em espécies de fungos requer um alto nível de padronização a ser realizado de acordo com as informações mínimas sobre um experimento proteômica (MIAPE) orientações. Nós apresentamos um vídeo protocolo que inclui um procedimento para minimizar viés experimental durante a indução da toxina e extração de proteínas de

Este vídeo descreve um procedimento usado para induzir a sinese da toxina em algumas espécies, neste caso, e o protocolo para extração de prote total usado para estudos proteômicos em nosso laboratório. A duração do procedimento, 16 dias, quatro dias para o crescimento fúngico, 10 dias para a síntese da toxina e dois dias para a extração da proteína. Após quatro dias, as colônias ainda estão crescendo ativamente em direção à borda da placa.

O micélio aéreo típico é formado e é coletado usando uma lâmina esteróide sob a caixa de fluxo da lâmina, arranhando suavemente a superfície da placa. O micélio é cortado em cinco pequenos pedaços e adicionado a um frasco inicial contendo 25 mililitros de meio indutor de toxinas. A indução de toxinas é mais eficiente do que a poeira escura.

O frasco é coberto em alumínio. As culturas são então agitadas por 10 dias, 150 rodadas por minuto a 25 graus centígrados. O meio é de SAPH e contém solução de linha S altamente concentrada.

Cama junto com a escuridão é conhecida por facilitar a sinese de toxinas em ria. O micélio é então separado da toxina contendo líquido filtrando no tecido próximo do IM. O líquido pode ser usado para medir o conteúdo de toxinas, enquanto o micélio é usado para extração de proteínas.

Para evitar a transferência de mídia, meu teto é lavado três vezes com água estéril. O excesso de água deve ser eliminado Posteriormente, como o nitrogênio líquido é adicionado, e as amostras podem ser armazenadas a menos 80 ou usadas para extração de proteínas. O procedimento de extração de proteínas é baseado no uso de SDS e TCA e consiste em diferentes etapas de lise.

Ele irá propor um método que engloba vários operadores para realizar. Paralelamente à extracção de réplicas biológicas, cada réplica é efectuada por um operador diferente. Este procedimento leva em consideração as diferenças no procedimento de extração que podem ser geradas por diferentes operadores que estão processando as réplicas.

Deve, portanto, mostrar maior robustez quando os replicados biológicos são comparados, pois a variável operadora é incluída no replicado. Ao mesmo tempo, o uso de vários operadores reduz o tempo de processamento. A amostra é moída em uma argamassa estéril usando nitrogênio líquido até que o micélio seja um pó fino.

Esta etapa é crucial para a qualidade e quantidade de proteínas. O micélio é coletado em tubos de Teflon de 10 mili na proporção de quatro décimos do volume total dos tubos. O tampão de lise contendo SDS e diferentes inibidores de protease é então adicionado.

Os tubos são então agitados até obter uma solução homogênea. Em seguida, as amostras são agitadas por 30 minutos na câmara de código para serem posteriormente homogeneizadas; as amostras são fervidas para dissolver as paredes celulares e as proteínas hidrofóbicas. A presença de SDS impede a formação de oligômeros que abortam a precipitação de proteínas.

Uma etapa de centrifugação separa três fases. As proteínas são suspensas na solução transparente que é coletada em um novo tubo mantido no gelo. A paleta é então usada para realizar uma segunda etapa, repetindo o vórtice, fervura e centrifugação.

O snat das duas lise é combinado para realizar precipitação com precipitação glacial, tampão contendo tom ácido, ácido triácido e TDT. As amostras são então armazenadas durante a noite por 16 horas a menos 20 graus centígrados para permitir a proteína. As proteínas de precipitação estão situadas no fundo dos tubos para melhorar a precipitação.

Os tubos são centrifugados em alta velocidade por 45 minutos. O palato agora é bem visível. Os sobrenadantes podem ser descartados usando uma almofada de tubo de cinco mililitros.

O TCA é então removido adicionando 25 mililitros de tampão de lavagem glacial contendo acetona e TDT. Em seguida, é completa e vigorosamente agitado. Em seguida, uma nova etapa de centrifugação é executada.

O palato proteico agora está flutuando, então uma tensão deve ser paga para eliminar o snat. Uma segunda etapa de lavagem é realizada, adicionando lavagem, tampão, agitação e centrifugação. O agente SUP é eliminado e a amostra é seca usando um saco de velocidade.

Quando a amostra está seca, a proteína tem consistência de pó. Para armazenar. A proteína da amostra deve ser coletada do tubo para diminuir a interferência eletrostática do plástico.

Uma pistola eletrostática é usada e a proteína em pó é coletada usando uma espátula de metal. As proteínas são então suspensas diretamente no tampão de marcação. Usado para traço 2D de 30 minutos a 800 gramas por minuto.

Basta para solubilizar. A proteína antes de prosseguir para a cara rotulagem 2D. A qualidade da proteína é testada no gel de dimensão da página um do SDS, como pode ser visto.

A ausência de manchas significativas na borda de uma pista sugere uma boa qualidade da amostra.