Name: In Vitro Síntese de ARNm de modificação para indução da expressão da proteína em células humanas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Aprenda a síntese in vitro de ARNm modificado para indução de expressão proteica em células humanas. Este método utiliza transcrição in vitro e complexos lipídicos, oferecendo vantagem sobre vetores virais ao evitar integração no genoma.

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Este projeto foi financiado pelo Fundo Social Europeu, em Baden-Württemberg, Alemanha.

1. Aumento de plasmídeos contendo Obrigatório Codificação de DNA seqüências (CDS) <ol><li> Meio de pré-SOC morno, que está incluída no kit de transformação, para a temperatura ambiente e as placas de agar LB contendo 100 ug / ml de ampicilina a 37 ° C. Equilibrar o banho de água a 42 ° C. </li><li> Descongelar um frasco de química componente E. coli em gelo. </li><li> Adicionar 1-5 ul do plasmídeo (10 pg a 100 ng) contendo os CDS para dentro do frasco de componente quimicamente E. coli e misture delicadamente. Não misture as células por pipetagem. Após a adição de plasmídeos, misture tocando suavemente o tubo. </li><li> Incubar a mistura em gelo durante 30 min. </li><li> Heat-choque do E. coli durante 30 segundos a 42 ° C num banho de água sem agitação. </li><li> Colocar o frasco em gelo durante 2 min. </li><li> Adicionar 250 ul de meio SOC pré-aquecido para a E. coli e agitar as bactérias horizontalmente a 300 rpm durante 1 hora a 37 ° C num incubador bacteriano. </li><li><html> Espalhe 100 ul e 150 ul da mistura de transformação em placas de agar de LB pré-aquecido, inverter as placas e incubar durante a noite a 37 ° C. </li><li> Depois de colónias tornam-se visíveis, inocular uma única colónia de cada placa num tubo de cultura de 15 ml contendo 5 ml de meio LB com 100 ug / ml de ampicilina. Incubar-los durante a noite a 37 ° C com agitação a 300 rpm até a cultura está em log tardia ou fase estacionária. </li><li> Para armazenamento a longo prazo de transformada E. coli, pipeta 75 ul de glicerol a 100% para o frasco de congelação. Adicionar 225 ul da cultura bacteriana (estoque congelada conterá 25% de glicerol), misturar bem e armazenar o frasco de congelação a -80 ° C. </li><li> Isolar os plasmídeos que contêm os CDS necessários usando um kit de purificação de plasmídeo de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Determinar a concentração de plasmídeo utilizando um espectrofotómetro. </li><li> Preparar alíquotas de 20 ul e armazená-las a -20 ° C durante um tempo prolongado. </li></ol>_title &quot;&gt; 2. A amplificação do plasmídeo inserções e adição de poli T-tail por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) <ol><li> NOTA: Para obter o DNA molde para a transcrição in vitro (IVT), CDS de interesse, aqui eGFP, é amplificado utilizando PCR. Simultaneamente, um poli-T-cauda de 120 timidinas (T) é adicionada à pastilha utilizando um iniciador reverso com uma extensão de 120 t. Deste modo, os mRNAs gerados obter um poli A-cauda com um comprimento definido, após o IVT. </li><li> Prepare a mistura de PCR conforme detalhado na Tabela 1. </li><li> Misture a mistura de reacção completamente. NOTA: o produto de PCR pode ser usado em reacções 4-5 IVT. Para aumentar a quantidade de ADN molde para IVT, o volume total da mistura de PCR pode ser aumentada. Vários tubos de PCR de 100 ul de cada mistura de PCR contendo pode ser utilizado para obter um rendimento suficiente de produto de PCR. </li><li> Inserir os tubos de PCR num termociclador e executar a PCR utilizando o protocolo de PCR de ciclismo (Tabela 2). </li><li> Limpe o PCR reacção utilizando um kit de purificação de PCR de acordo com as instruções do fabricante e eluir o ADN, utilizando 20 ul de água livre de nuclease. </li><li> Medir a concentração do ADN, utilizando um espectrofotómetro. NOTA: A concentração de DNA detectado é de aproximadamente 300 ug / ml. Assim, o montante total esperado deve ser ~ 6 mg. A quantidade de ADN para outras proteínas pode variar dependendo do comprimento da CDS, quantidade de plasmídeo utilizado para a PCR, a temperatura de emparelhamento de iniciadores, e o número do ciclo. </li><li> Congelar o ADN a -20 ° C, durante um longo período de tempo ou usá-lo directamente para IVT. </li></ol> Passo 3. Controlo: Qualidade do Produto PCR <ol><li> Para verificar a qualidade do produto de PCR por electroforese em gel de ADN. </li><li> Misturar a quantidade desejada de agarose com TBE 1x num balão. Para um gel de agarose a 1%, adicionar 0,5 g de agarose com 50 ml de 1 x TBE. </li><li> Micro-ondas, até a agarose é dissolvido. Não deixe ferver. Assegure-se que a agarose é completamente na solução. </li><li> Adicionar 5 mL nucleico mancha gel de ácido para 50 ml de gel de agarose. </li><li> Despeje o gel em uma caixa de gel de agarose, coloque o pente, e esperar cerca de 1 hora até que o gel solidificado. </li><li> Retire o pente e colocar a caixa de gel em uma bandeja de gel. </li><li> Misture 2 ul (200 ng) de 80-10,000 pb de ADN-Escada e 200 ng de produto de PCR, cada uma com 2 ul de tampão de carregamento 6x num volume total de 12 ul. </li><li> Encher cuidadosamente amostras de ADN nos poços do gel de agarose. </li><li> Usando 1 x TBE como tampão de corrida, correr o gel de agarose a 100 V durante 1 h. </li><li> Visualizar as bandas de ADN em um sistema de imagem (Figura 2). </li></ol> 4. transcrição in vitro (IVT) <ol><li> NOTA: Após a PCR, os insertos de plasmídeo são amplificados e uma cauda poli-T é adicionado. Durante o IVT, a informação genética é transcrito a partir do DNA para o RNA. A transcrição do mRNA gerado é usado para produzir proteínas em células. </li><li> Limpe a área de trabalho e pipetas com uma RNase dsolução econtamination. Use PCR pontas de pipeta dual-filtro limpo e esterilizado e mudam frequentemente de luvas para minimizar a contaminação da reação mistura com RNases. </li><li> Prepare a mistura analógica NTP / cap, conforme descrito na Tabela 3. </li><li> Misture a mistura analógica NTP / cap completamente em vórtice e mexer um pouco. </li><li> Montar a mistura de reacção IVT como descrito na Tabela 4. </li><li> Misture a mistura de reação IVT com cuidado pipetando cima e para baixo. Em seguida centrifugar o tubo de PCR rapidamente para recolher a mistura na parte inferior do tubo. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 3 horas num termomisturador. NOTA: O tempo de incubação óptimo depende do comprimento das inserções e a eficiência transcricional de determinado modelo. Para inserções curtas (&lt;500 nt), um tempo de incubação mais longo pode ser vantajoso. Uma experiência ao longo do tempo pode ser realizado para determinar o tempo de incubação óptimo para um rendimento máximo. Por isso, criou reações FPI, para example, durante 1, 2, 3, 4, 6 hr, e a incubação durante a noite e determinar a quantidade de ARNm. A cinética da transcrição in vitro para a geração de mRNA eGFP é mostrado na Figura 3. </li><li> Para remover o DNA molde, adicionar 1 ul de ADNase (2 U / ul) à mistura de reacção IVT, misturar bem e incubar 15 min a 37 ° C. </li><li> Purifica-se a mistura de reacção utilizando um kit de purificação de RNA de acordo com as instruções do fabricante. Eluir o mRNA modificado a partir da membrana coluna de rotação duas vezes com 40 mL de água livre de nuclease. NOTA: A concentração de ARN detectado é cerca de 1,500 ug / ml. Assim, o montante total esperado deve ser ~ 120 mg. A quantidade de mRNA sintetizados para outras proteínas pode variar dependendo do comprimento de CDS e a quantidade de produto de PCR utilizado para IVT. </li></ol> 5. Tratamento de mRNA purificado com Antártica Phosphatase <ol><li> NOTA: O mRNA gerado é tratado com fosfatase para remover 5 tri &#39;fosfatos, que podem ser reconhecidos por RIG-I e levam à activação imunitária. Além disso, o tratamento com fosfatase evita a re-circularização numa reacção de auto-ligação. </li><li> Adicionar 9 mL de tampão de reação 10x fosfatase Antártida a 79 ml de solução de mRNA purificado. Posteriormente, adicionar 2 mL de fosfatase Antártica (5 U / mL) e misture delicadamente a amostra. Incubar a mistura de reacção a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Purifica-se a mistura de reacção utilizando um kit de purificação de RNA de acordo com as instruções do fabricante. Eluir o ARNm modificado a partir da membrana coluna de centrifugação duas vezes com 50 mL de água livre de nuclease. </li><li> Medir a concentração dos ARNm modificados utilizando um espectrofotómetro. Verificar que a razão de absorvância a 260 nm / 280 nm (A 260 / A 280) é ≥ 1,8 e a proporção de A 260 / A 230 é de 2,0, o que indica pureza. NOTA: O rendimento total esperado deve ser aproximadamente de 90 ug, que é sufficient por aproximadamente 36 transfections mRNA. </li><li> Ajustar a concentração de mRNA de 100 ng / mL por adição de água livre de nuclease. </li><li> Alíquota o ARNm modificado em alíquotas de uso único necessários para transfecções e armazenar a -80 ° C. Evite múltiplos ciclos de congelamento e descongelamento. Devidamente preparado e armazenado ARNm é estável durante muitos anos. Durante o trabalho, mantenha sempre o mRNA modificado no gelo. </li></ol> 6. Controle de Passo: Qualidade de mRNA Modificado Sintetizado <ol><li> Verificar a qualidade de ARNm modificado por electroforese em gel de ARN. </li><li> Misturar a quantidade desejada de agarose com TBE 1x num balão. Para um gel de agarose a 1%, adicionar 0,5 g de agarose com 50 ml de 1 x TBE. </li><li> Micro-ondas, até a agarose é dissolvido. Não deixe ferver. Assegure-se que a agarose é completamente na solução. </li><li> Adicionar 5 mL nucleico mancha gel de ácido para 50 ml de gel de agarose. </li><li> Despeje o gel em uma caixa de gel de agarose, coloque o pente, e esperar cerca de 1 hora até que o gel é solidified. </li><li> Retire o pente e colocar a caixa de gel em uma bandeja de gel. </li><li> Misturar 3 ul (3 ug) de 0,5-10 kb ARN Escada e 200 ng de cada mRNA sintetizados modificado com tampão de carga 7 ul num volume total de 10 ul. A composição do tampão de carga é descrita na Tabela 5. </li><li> Desnaturar a escada e as amostras de ARNm, a 70 ° C durante 10 min. </li><li> Carregar cuidadosamente a escada e as amostras de ARNm sobre o gel de agarose a 1%. </li><li> Efectuar a electroforese a 100 V durante 1 h utilizando 1 x TBE como tampão de corrida. </li><li> Visualizar a escada e bandas de ARNm num transiluminador de UV e uma fotografia utilizando um sistema de documentação de gel (Figura 4). </li></ol> 7. Preparação de células para transfecção <ol><li> Placa 2 x 10 5 células (células HEK293) por poço da placa de 12 poços. </li><li> Incubar as células durante a noite a 37 ° C num incubador celular. NOTA: No dia da transfecção, as células devem ter reacele tinha 80-90% de confluência. </li></ol> 8. Realizar mRNA transfecção de células <ol><li> Descongelar o ARNm modificado. </li><li> Gerar os lipoplexos para transfecção. </li><li> Adicionar 25 ul (2,5 ug) de ARNm modificado e 2 ul de reagente de transfecção de lípido catiónico para 473 ul de Opti-MEM (Meio Essencial Mínimo) I de meio de soro reduzido para gerar a mistura de transfecção para a transfecção de um poço de uma placa de 12 poços. Dimensionar-se os volumes de acordo com o número de poços a serem transfectadas. Como controle negativo, prepare uma mistura de transfecção sem mRNA. </li><li> Misturar os componentes com cuidado por pipetagem. Incubar a mistura de transfecção à temperatura ambiente durante 20 min para gerar lipoplexos para transfecção. NOTA: A mistura de transfecção não contém antibióticos. Assim, tome cuidado para garantir a esterilidade durante o manuseio de células. </li><li> Lavar as células com DPBS 500 ul / poço. </li><li> Adicionar 500 ul mistura de transfecção para um poço de uma pla de 12 poçoste. </li><li> Incubar as células durante 4 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Aspirar a mistura de transfecção e juntar 1 mL de meio de cultura de células completa para as células. </li><li> Incubar as células durante 24 horas na incubadora celular. </li><li> Realizar fluorescência microscópica análises utilizando um microscópio de fluorescência (Figura 5). NOTA: Para analisar a expressão de outras proteínas nas células, as quais são produzidas através de transfecção com o outro do que o ARNm de codificação de mRNA eGFP, as células podem ser cultivadas em lamelas. Em seguida, a transfecção pode ser realizada e as células podem ser coradas com anticorpos apropriados e analisadas por microscopia de fluorescência. </li></ol> 9. A análise de citometria de fluxo de eGFP Expressão em Células <ol><li> Remover o meio de cultura de células a partir dos poços e lavar cada poço 1 ml com DPBS (sem cálcio e magnésio). Adicionar 500 ul de tripsina / EDTA por cavidade para destacar as células da superfície das placas de cultura de células. Posteriormente, adicione 500TNS ul por cavidade para inactivar a tripsina. </li><li> Centrifugar as células destacadas durante 5 min a 300 xg à temperatura ambiente. Retirar o sobrenadante, deixando apenas o sedimento. Ressuspender o sedimento celular em 150 ul solução de fixação de células e transferir a suspensão de células para um tubo de citometria de fluxo. </li><li> Analisar a percentagem de células que expressam eGFP e da intensidade de fluorescência utilizando Geo média (média geométrica da intensidade de fluorescência) (Figura 6). </li></ol> 10. A medição da expressão da proteína ao longo do tempo <ol><li> Realizar ARNm de transfecção de células em três poços de uma placa de 12 poços tal como descrito no passo 8. Para além disso, incubar três poços de células HEK293 com a mistura de transfecção sem a adição de ARNm. </li><li> Medir a expressão de eGFP 1, 2, e 3 dias após a transfecção para avaliar a duração da expressão da proteína (Figura 7). </li></ol>

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<li>Avci-Adali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+conditions+for+successful+transfection+of+human+endothelial+cells+with+in+vitro+synthesized+and+modified+mRNA+for+induction+of+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biological+engineering%22%5BJournal%5D)">Optimized conditions for successful transfection of human endothelial cells with in vitro synthesized and modified mRNA for induction of protein expression.</a> Journal of biological engineering. 8, 8(2014).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A terapia de ARNm tem um tremendo potencial no campo da medicina regenerativa, tratamento de doenças e de vacinação. Neste vídeo, que demonstram a produção de um ARNm modificado estabilizado para a indução da expressão da proteína nas células. Usando este protocolo, outros ARNm desejados podem ser gerados. A síntese in vitro do ARNm modificado permite a transfecção de células com mRNAs desejadas para induzir a expressão de proteínas alvo. Deste modo, a proteína desejada é expressa transientemente em condições f...

Nas células, a transcrição de ARN mensageiro (ARNm) e a tradução na sequência de ARNm em proteínas desejadas garantir o bom funcionamento das células. Doenças genéticas, hereditárias ou adquiridas pode levar à síntese de proteínas insuficiente e ineficiente e causar doenças graves. Assim, uma nova abordagem terapêutica para induzir a produção de proteínas defeituosas ou em falta é o fornecimento exógeno de ARNm sintético modificado em células, que codifica para a proteína desejada. Desse modo, as células são acionados para sintetizar proteínas funcionais, que normalmente não podem produzir ou, naturalmente, não precisa. Usando esta abordagem, as doenças genéticas pode ser corrigido por introdução do ARNm que codifica para a proteína defeituosa ou falta 1. A terapia de mRNA também pode ser utilizada para a vacinação de sintetizar proteínas, antigénios que são expressos pelas células tumorais ou agentes patogénicos. Deste modo, o sistema imune do hospedeiro pode ser activado para eliminar de forma eficaz as células tumorais ou prevenir infeficções 2,3. Além disso, nos últimos anos, o ARNm foi utilizado com sucesso para gerar células estaminais pluripotentes induzidas (IPSCs). Para este efeito, os fibroblastos foram transfectadas com os mRNAs para induzir a expressão de factores de reprogramação 4-6 e de convertê-los em iPSCs com um enorme potencial em medicina regenerativa. Anteriormente, o uso de ARNm convencional estava associada com a baixa estabilidade e forte imunogenicidade. Assim, aplicações clínicas de mRNAs convencionais foram limitados. No entanto, a substituição de citidina e uridina por 5-metilcitidina e pseudouridina dentro da molécula de ARNm por Kariko e colegas rendeu moléculas de mRNA estáveis ​​em fluidos biológicos e reduziu dramaticamente a activação imunitária 7-10, que agora permite que a aplicabilidade clínica de mRNAs modificados. Utilizando mRNAs modificados produzidos sinteticamente, transcritos de genes desejados podem ser temporariamente entregues in vivo 11ou in vitro para induzir a expressão da proteína. O mRNA é traduzido introduzido sob condições fisiológicas pela máquina de tradução celular. Devido à falta de integração no genoma da célula hospedeira em comparação com vectores de terapia de genes virais, o risco de oncogénese é impedido 12,13. Assim, a terapia usando mRNA sintético modificado vai ficar melhor aceitação clínica no futuro. Aqui, nós descrevemos um protocolo detalhado para a produção de ARNm modificado (Figura 1), a transfecção de células com o ARNm e a avaliação da expressão da proteína em células transfectadas.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Cultura de células</td></tr><tr><td>DMEM, alta glicose</td><td>PAA</td><td>E15-009</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10500</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina&nbsp;</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td>100x</td></tr><tr><td>L-glutamina&nbsp;</td><td>PAA</td><td>M11-004</td><td>200 mM</td></tr><tr><td>DPBS sem cálcio e magnésio&nbsp;</td><td>PAA</td><td>E15-002</td><td></td></tr><tr><td>0.04% Tripsina / 0.03% EDTA&nbsp;</td><td>Promocell</td><td>C-41020</td><td></td></tr><tr><td>TNS</td><td>Promocell</td><td>C-41120</td><td>Solução Neutralizante de Tripsina, inibidor de tripsina a 0,05% em células BSA</td></tr><tr><td>HEK-293</td> a 0,1% <td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Consumíveis</td></tr><tr><td>Placas de cultura de tecidos, 12 poços&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de cultura de células (75 cm2)&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>tubos de microcentrífuga estéreis de 1,5 ml livres de DNase e RNase&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>0030 121.589</td><td>Safe-Lock, Tubos</td></tr><tr><td>cônicos Biopur de 15 ml&nbsp;</td><td>greiner bio-one</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>PCR limpa e estéril epT.I.P.S. pontas de pipeta de filtro duplo&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>10 &micro; l: 022491202; 100 &micro; L: 022491237; 1.000 &micro; l: 022491253</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>greiner bio-one</td><td>122279-128</td><td>Cryo.s&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubo de fundo redondo de polipropileno de 14 ml para cultura bacteriana&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Amplificação e purificação de plasmídeos</td></tr><tr><td>pcDNA 3.3_eGFP Plasmid&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>26822</td><td></td></tr><tr><td>One Shot Top10 componente químico Escherichia coli&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>C4040-10</td><td></td></tr><tr><td>Água estéril (Ampuwa)</td><td>Fresenius Kabi</td><td>1636071</td><td></td></tr><tr><td>LB médio (Luria/Miller)&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>X968.1</td><td>Dissolver 25 g L-1 in água estéril.</td></tr><tr><td>Ágar LB (Luria/Miller)&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>X969.1</td><td>Dissolver 40 g L-1 in água estéril.</td></tr><tr><td>Solução Pronta para Ampicilina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5354</td><td>100 mg/ml&nbsp;</td></tr>Kit de Minipreparação <tr>Spin Spin <td>Aldrich</td><td>G2025</td><td></td>QIAprep <td>Sigma Glycerol</td></tr><tr><td></td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">produção de mRNA</td></tr><tr><td>Kit de Polimerase HiFidelity HotStar&nbsp;</td>Kit <td>de</td> Purificação <td>de PCR Qiagen</td> 202602 <td></td></tr><tr><td>QIAquick&nbsp;</td><td>Kit Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript T7</td><td>Life Technologies</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>5-Metilcitidina-5&agudo;-trifosfato&nbsp;</td><td>Trilink</td><td>N1014</td><td>5-metil-CTP</td></tr><tr><td>pseudouridina-5&agudo;-trifosfato&nbsp;</td><td>Trilink</td><td>N1019</td><td>Pseudo-UTP</td></tr><tr><td>3&acute<;->O-Me-m7G(5&agudo;)ppp (5&agudo;)G RNA cap structure analog&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>S1411L</td><td></td></tr><tr><td>RiboLock RNase Inhibitor</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0381</td><td>40 U/&micro; l&nbsp;</td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Life Technologies</td><td>AM1334</td><td>2 U/&micro; l (do Kit MEGAscript T7)</td></tr><tr><td>Fosfatase antártica&nbsp;</td>Kit mini New <td>England Biolabs</td><td>MO289S</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy&nbsp;</td><td>Solução Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Transfection</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Reagente de transfecção lipídica catiônica</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Mídia de soro reduzida&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11058-021</td><td>Meio Essencial Mínimo Melhorado (MEM) que permite uma redução da suplementação de Soro Fetal Bovino (FBS)&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Eletroforese em gel</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Gelred Nucleic Acid Gel Stain</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>10,000x em água&nbsp;</td></tr><tr><td>Mix de Gama peqGOLD DNA-Ladder&nbsp;</td><td>Peqlab</td><td>25-2210</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Análises de citometria de fluxo</td></tr><tr><td>CellFIX (1x)</td><td>BD Biosciences</td><td>340181</td><td>10x concentrado&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Primer para amplificação de inserção e PCR de cauda poli (T)</td></tr><tr><td>Forward Primer (grau HPLC) 10 &micro; M</td><td>Ella Biotech</td><td></td><td>5&agudo;-TTGGACCCTCGTAC AGAAGCTAATACG-3&agudo;</td></tr><tr><td>Primer reverso (grau HPLC) 10 &micro; M</td><td>Ella Biotech</td><td></td><td>5&acute;- T120-CTTCCTACT CAGGCTTTATTCAA AGACCA-3&agudo;</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Cell incubator</td><td>Binder</td><td></td><td>CO2 (5%) e O2 (20%)&nbsp;</td></tr><tr><td>Contador de células CASY&nbsp;</td><td>Sch&auml; rfe System</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bancada de trabalho estéril&nbsp;</td><td>BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora bacteriana</td><td>Espectrofotômetro ScanDrop para</td> banho-maria Incutec <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Termociclador analítico Jena</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR</td><td>Microcentrífuga Eppendorf Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>peqlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aparelho de gel para eletroforese&nbsp;</td><td>Sistema de documentação Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel&nbsp;</td><td>Sistema Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACScan&nbsp;</td><td>Microscópio de fluorescência BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Microscópio</td> de contraste de fase Nikon<td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro síntese de arnm de modificação para indução da expressão da proteína em células humanas

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

O fornecimento exógeno de codificação de RNA mensageiro sintético (ARNm) para a indução da síntese de proteínas nas células desejadas tem um potencial enorme nos domínios da medicina regenerativa, biologia celular básico, tratamento de doenças, e reprogramação das células. Aqui, nós descrevemos um protocolo passo-a-passo para a geração de ARNm modificado com reduzido potencial imunológico activação e aumento da estabilidade, controlo de qualidade de ARNm produzido, a transfecção de células com o mRNA e verificação da expressão da proteína induzida por citometria de fluxo. Até 3 dias após a transfecção com um único mRNA eGFP, as células HEK293 transfectadas produzir eGFP. Neste artigo de vídeo, a síntese de mRNA eGFP é descrito como um exemplo. No entanto, o procedimento pode ser aplicado para a produção de outros ARNm desejados. Usando o mRNA sintético modificado, as células podem ser induzidas a expressar transitoriamente as proteínas desejadas, que normalmente não expressam.

Usando um plasmídeo pcDNA 3.3 contendo CDS da eGFP, a síntese de mRNA eGFP foi estabelecida modificada (Figura 1). Após a amplificação por PCR de inserção e poli-T-cauda, ​​uma banda clara com um comprimento de, aproximadamente, 1.100 pb é detectado (Figura 2). Aumentando o tempo de FPI aumentou o rendimento de ARNm (Figura 3). Após o IVT, uma banda de ARNm clara com um comprimento de, aproximadamente, 1.100 pb foi detectado, o que corresponde ao comprimento do mRNA eGF...

Neste artigo de vídeo, que descrevem a síntese in vitro do ARNm modificado para a indução da expressão da proteína nas células.

In Vitro Síntese de ARNm de modificação para indução da expressão da proteína em células humanas

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

O objetivo geral deste procedimento é a síntese in vitro de mRNA modificado para indução da expressão de proteínas nas células. Isso é feito primeiro amplificando a inserção do plasmídeo ou a sequência de DNA codificadora e adicionando uma cauda poli T de 120 timidina usando a reação em cadeia da polimerase. A segunda etapa é a transcrição in vitro do DNA gerado em mRNA com caudas de poliadenina.Em seguida, o DNA molde é removido pelo tratamento D da mistura de reação de transcrição in vitro. A etapa final é o tratamento com fosfatase antártica do mRNA produzido para remover cinco fosfatos primários. Em última análise, as células são transfectadas pelo mRNA gerado, complexos lipídicos.A microscopia fluorescente e a análise por citometria de fluxo são usadas para mostrar a síntese de GFP aumentada nas células. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como o transfecto viral, é a falta de integração no genoma da célula hospedeira, o que evita o risco de oncogênese. Este método pode ajudar a produzir proteínas ausentes ou defeituosas nas células e pode ser usado para tratamento de vacinação de doenças genéticas.E no campo da medicina regenerativa, demonstrando o procedimento será steinle um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Antes do início deste procedimento, os plasmídeos contendo as sequências de DNA codificantes necessárias ou CDS foram amplificados em e coli e isolados conforme descrito no texto do protocolo. Neste exemplo, o CDS de interesse é a proteína fluorescente verde aprimorada ou EGFP para amplificar e adicionar simultaneamente um detalhe poli ao CDS do EGFP.Prepare uma mistura de PCR conforme detalhado no texto do protocolo. Coloque o tubo de PCR em um termociclador e execute o protocolo de ciclagem de PCR descrito no texto do protocolo. Quando a reação de PCR estiver completa, limpe a reação de PCR usando um kit de purificação de PCR disponível comercialmente e dilua o DNA usando 20 microlitros de água livre de nuclease.Para verificar a qualidade do produto de PCR, realize eletroforese em gel de DNA e visualize as bandas de DNA em um sistema de imagem. Uma banda de DNA clara com um comprimento de aproximadamente 1.100 pares de bases deve ser detectada durante a transcrição in vitro ou IVT. O DNA gerado anteriormente será transcrito para mRNA.Prepare a mistura analógica da tampa NTP conforme mostrado aqui. Misture bem a mistura análoga da tampa NTP por vórtice. Em seguida, gire-o para baixo Monte brevemente a mistura de reação IVT conforme descrito nesta tabela.Misture bem a mistura de reação IVT, pipetando suavemente para cima e para baixo. Em seguida, centrifugue brevemente o tubo de PCR para coletar a mistura no fundo do tubo. Incube a mistura de reação IVT a 37 graus Celsius por três horas em um misturador térmico.Após três horas, remova o DNA molde adicionando um microlitro de DNAs à mistura de reação IVT. Misturando bem e incubando a 37 graus Celsius por 15 minutos. Purifique a mistura de reação usando um kit de purificação de RNA e dilua o MR NA modificado da membrana da coluna giratória duas vezes com 40 microlitros de água livre de nuclease, o mRNA modificado gerado por IVT deve ser tratado com fosfatase para remover cinco trifosfatos primários, o que pode levar à ativação imunológica.Para iniciar este procedimento, adicione nove microlitros de tampão de reação de fosfatase antártica 10 x a 79 microlitros de uma solução de mRNA purificada. Em seguida, adicione dois microlitros de fosfatase antártica e misture delicadamente a amostra. Incube a mistura a 37 graus Celsius por 30 minutos.Após 30 minutos, purifique a mistura de reação usando um kit de purificação de RNA e dilua o mRNA modificado da membrana da coluna de rotação duas vezes com 50 microlitros de água livre de nuclease. Depois de medir a concentração do mRNA modificado, ajuste a concentração para 100 nanogramas por microlitro adicionando água livre de nuclease. Verifique a qualidade do mRNA modificado sintetizado por eletroforese em gel de RNA e visualize as proibições de escada e mRNA em um iluminador trans UV.Deve ser detectada uma banda de mRNA clara com um comprimento de aproximadamente 1.100 pares de bases. Prepare as células HEC 2 9 3 para transfecção com o mRNA modificado sintetizado por plaqueamento duas vezes. Centralize as cinco células por poço de uma placa de 12 poços incube as células durante a noite a 37 graus Celsius em uma incubadora de células No dia seguinte, a célula deve ter atingido 80 a 90% de confluência.Gere o lipoplexo para transfecção. Prepare uma mistura de transfecção suficiente para que todos os poços sejam transfectados Cada poço de uma placa de 12 poços requer 2,5 microgramas de mRNA modificado, dois microlitros de reagente de transfecção lipídica e 473 microlitros de opt um. Reduza o meio sérico.Misture os componentes delicadamente pipetando como controle negativo. Prepare uma mistura de transfecção sem Mr.NA, incube as misturas de transfecção em temperatura ambiente por 20 minutos para gerar lipoplexos. Para transfecção.Lave as células com 500 microlitros de DPBS por. Bem, adicione 500 microlitros de mistura de transfecção a cada poço da placa de 12 poços, incube as células por quatro horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono após quatro horas, aspire a mistura de transfecção e adicione um mililitro de cultura de células completa. Meio para as células em cada poço.Incube as células por 24 horas na incubadora de células. Posteriormente, realize a análise microscópica de fluorescência das células usando um microscópio de fluorescência para preparar as células para a citometria de fluxo. Remova o meio de cultura de células dos poços e lave cada poço com um dos DPBS sem cálcio e magnésio.Adicione 500 microlitros de TRIPSIN EDTA por poço para separar as células da superfície das placas de cultura de células. Posteriormente, adicione 500 microlitros de solução neutralizante de tripsina por poço para inativar a tentativa de centrifugar as células destacadas por cinco minutos a 300 vezes a temperatura ambiente de G. Após remover o Reese supinado, suspenda o palato celular em 150 microlitros de solução de fixação celular e transfira a suspensão celular para um tubo de citometria de fluxo.Analise a porcentagem de células que expressam EGFP e a intensidade de fluorescência usando a média geométrica da intensidade de fluorescência. A expressão da proteína ao longo do tempo também é avaliada pela análise de citometria de fluxo das células que expressam EGFP em um, dois e três dias após a transfecção, conforme descrito no texto do protocolo, a funcionalidade do mRNA de EGFP gerado foi testada por transfecção de células HEC 2 9 3. A produção de EGFP nas células foi detectada 24 horas após a transfecção por microscopia de fluorescência.Aqui, uma imagem de contraste facial das células é mostrada ao lado de uma imagem de fluorescência das células. A expressão de EGFP nas células também foi detectada por citometria de fluxo 24 horas após a transfecção. A linha rosa representa células sem mRNA, transfecção e a linha azul representa células EGFP positivas.Após a transfecção de mRNA EGFP, 93,91% de todas as células medidas foram positivas e a média geométrica da intensidade de fluorescência foi de 720,16. A duração da expressão da proteína nas células HC 2 93 foi avaliada medindo a expressão de EGFP um, dois e três dias após o mRNA. A expressão da proteína de transfecção foi maior nas células 24 horas após a transfecção.A quantidade foi reduzida em 1,6 vezes a cada dia seguinte, mas mesmo depois de três dias, as células continham EGFP Uma vez dominado. Esta técnica pode ser feita em dois dias se for realizada corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como produzir MRNA modificado estabilizado para a indução da expressão proteica desejada nas células.

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JoVE Journal

Biology

Biologia

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Baseado em RNA reprogramação de fibroblastos humanos primários em células-tronco pluripotentes induzidas

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Transfecção eficiente de mRNA transcrito in vitro em células cultivadas usando nanopartículas de peptídeo-poloxamina

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In Vitro Síntese de ARNm de modificação para indução da expressão da proteína em células humanas

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