In Vitro Síntese de ARNm de modificação para indução da expressão da proteína em células humanas

O objetivo geral deste procedimento é a síntese in vitro de mRNA modificado para indução da expressão de proteínas nas células. Isso é feito primeiro amplificando a inserção do plasmídeo ou a sequência de DNA codificadora e adicionando uma cauda poli T de 120 timidina usando a reação em cadeia da polimerase. A segunda etapa é a transcrição in vitro do DNA gerado em mRNA com caudas de poliadenina.

Em seguida, o DNA molde é removido pelo tratamento D da mistura de reação de transcrição in vitro. A etapa final é o tratamento com fosfatase antártica do mRNA produzido para remover cinco fosfatos primários. Em última análise, as células são transfectadas pelo mRNA gerado, complexos lipídicos.

A microscopia fluorescente e a análise por citometria de fluxo são usadas para mostrar a síntese de GFP aumentada nas células. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como o transfecto viral, é a falta de integração no genoma da célula hospedeira, o que evita o risco de oncogênese. Este método pode ajudar a produzir proteínas ausentes ou defeituosas nas células e pode ser usado para tratamento de vacinação de doenças genéticas.

E no campo da medicina regenerativa, demonstrando o procedimento será steinle um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Antes do início deste procedimento, os plasmídeos contendo as sequências de DNA codificantes necessárias ou CDS foram amplificados em e coli e isolados conforme descrito no texto do protocolo. Neste exemplo, o CDS de interesse é a proteína fluorescente verde aprimorada ou EGFP para amplificar e adicionar simultaneamente um detalhe poli ao CDS do EGFP.

Prepare uma mistura de PCR conforme detalhado no texto do protocolo. Coloque o tubo de PCR em um termociclador e execute o protocolo de ciclagem de PCR descrito no texto do protocolo. Quando a reação de PCR estiver completa, limpe a reação de PCR usando um kit de purificação de PCR disponível comercialmente e dilua o DNA usando 20 microlitros de água livre de nuclease.

Para verificar a qualidade do produto de PCR, realize eletroforese em gel de DNA e visualize as bandas de DNA em um sistema de imagem. Uma banda de DNA clara com um comprimento de aproximadamente 1.100 pares de bases deve ser detectada durante a transcrição in vitro ou IVT. O DNA gerado anteriormente será transcrito para mRNA.

Prepare a mistura analógica da tampa NTP conforme mostrado aqui. Misture bem a mistura análoga da tampa NTP por vórtice. Em seguida, gire-o para baixo Monte brevemente a mistura de reação IVT conforme descrito nesta tabela.

Misture bem a mistura de reação IVT, pipetando suavemente para cima e para baixo. Em seguida, centrifugue brevemente o tubo de PCR para coletar a mistura no fundo do tubo. Incube a mistura de reação IVT a 37 graus Celsius por três horas em um misturador térmico.

Após três horas, remova o DNA molde adicionando um microlitro de DNAs à mistura de reação IVT. Misturando bem e incubando a 37 graus Celsius por 15 minutos. Purifique a mistura de reação usando um kit de purificação de RNA e dilua o MR NA modificado da membrana da coluna giratória duas vezes com 40 microlitros de água livre de nuclease, o mRNA modificado gerado por IVT deve ser tratado com fosfatase para remover cinco trifosfatos primários, o que pode levar à ativação imunológica.

Para iniciar este procedimento, adicione nove microlitros de tampão de reação de fosfatase antártica 10 x a 79 microlitros de uma solução de mRNA purificada. Em seguida, adicione dois microlitros de fosfatase antártica e misture delicadamente a amostra. Incube a mistura a 37 graus Celsius por 30 minutos.

Após 30 minutos, purifique a mistura de reação usando um kit de purificação de RNA e dilua o mRNA modificado da membrana da coluna de rotação duas vezes com 50 microlitros de água livre de nuclease. Depois de medir a concentração do mRNA modificado, ajuste a concentração para 100 nanogramas por microlitro adicionando água livre de nuclease. Verifique a qualidade do mRNA modificado sintetizado por eletroforese em gel de RNA e visualize as proibições de escada e mRNA em um iluminador trans UV.

Deve ser detectada uma banda de mRNA clara com um comprimento de aproximadamente 1.100 pares de bases. Prepare as células HEC 2 9 3 para transfecção com o mRNA modificado sintetizado por plaqueamento duas vezes. Centralize as cinco células por poço de uma placa de 12 poços incube as células durante a noite a 37 graus Celsius em uma incubadora de células No dia seguinte, a célula deve ter atingido 80 a 90% de confluência.

Gere o lipoplexo para transfecção. Prepare uma mistura de transfecção suficiente para que todos os poços sejam transfectados Cada poço de uma placa de 12 poços requer 2,5 microgramas de mRNA modificado, dois microlitros de reagente de transfecção lipídica e 473 microlitros de opt um. Reduza o meio sérico.

Misture os componentes delicadamente pipetando como controle negativo. Prepare uma mistura de transfecção sem Mr.NA, incube as misturas de transfecção em temperatura ambiente por 20 minutos para gerar lipoplexos. Para transfecção.

Lave as células com 500 microlitros de DPBS por. Bem, adicione 500 microlitros de mistura de transfecção a cada poço da placa de 12 poços, incube as células por quatro horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono após quatro horas, aspire a mistura de transfecção e adicione um mililitro de cultura de células completa. Meio para as células em cada poço.

Incube as células por 24 horas na incubadora de células. Posteriormente, realize a análise microscópica de fluorescência das células usando um microscópio de fluorescência para preparar as células para a citometria de fluxo. Remova o meio de cultura de células dos poços e lave cada poço com um dos DPBS sem cálcio e magnésio.

Adicione 500 microlitros de TRIPSIN EDTA por poço para separar as células da superfície das placas de cultura de células. Posteriormente, adicione 500 microlitros de solução neutralizante de tripsina por poço para inativar a tentativa de centrifugar as células destacadas por cinco minutos a 300 vezes a temperatura ambiente de G. Após remover o Reese supinado, suspenda o palato celular em 150 microlitros de solução de fixação celular e transfira a suspensão celular para um tubo de citometria de fluxo.

Analise a porcentagem de células que expressam EGFP e a intensidade de fluorescência usando a média geométrica da intensidade de fluorescência. A expressão da proteína ao longo do tempo também é avaliada pela análise de citometria de fluxo das células que expressam EGFP em um, dois e três dias após a transfecção, conforme descrito no texto do protocolo, a funcionalidade do mRNA de EGFP gerado foi testada por transfecção de células HEC 2 9 3. A produção de EGFP nas células foi detectada 24 horas após a transfecção por microscopia de fluorescência.

Aqui, uma imagem de contraste facial das células é mostrada ao lado de uma imagem de fluorescência das células. A expressão de EGFP nas células também foi detectada por citometria de fluxo 24 horas após a transfecção. A linha rosa representa células sem mRNA, transfecção e a linha azul representa células EGFP positivas.

Após a transfecção de mRNA EGFP, 93,91% de todas as células medidas foram positivas e a média geométrica da intensidade de fluorescência foi de 720,16. A duração da expressão da proteína nas células HC 2 93 foi avaliada medindo a expressão de EGFP um, dois e três dias após o mRNA. A expressão da proteína de transfecção foi maior nas células 24 horas após a transfecção.

A quantidade foi reduzida em 1,6 vezes a cada dia seguinte, mas mesmo depois de três dias, as células continham EGFP Uma vez dominado. Esta técnica pode ser feita em dois dias se for realizada corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como produzir MRNA modificado estabilizado para a indução da expressão proteica desejada nas células.