Name: Um modelo de Disturbed Aterosclerose Flow-induzido em rato artéria carótida pela ligadura parcial e um método simples de isolamento de RNA a partir do endotélio Carótidas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-22T17:30:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Aprenda a realizar ligadura parcial da carótida em camundongos para induzir fluxo perturbado e aterosclerose rápida. Este método inclui verificação por ultrassom e isolamento de RNA endotelial de alta pureza.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi financiado por recursos do NIH concede HL87012 (HJ), HL75209 (HJ), UO1HL80711 (DH, DG, HJ) e um World Class University Project (HJ) do Ministério da Ciência, Tecnologia e Educação de S. Korea.

1. Ligadura parcial da artéria carótida esquerda <ol><li> Mouses são utilizados em ~ 8 semanas de idade. O peso dos ratos é recomendado para ser pelo menos 18 gramas. </li><li> Esterilizar os instrumentos para 30 segundo no esterilizador instrumento talão e deixe esfriar </li><li> Induzir a anestesia com Ketamina (80mg/kg) e xilazina (10mg/kg) intraperitonial injeção (ip) ou alternativa anestesia aprovado pelo IACUC. Para injeção ip, injetar mouse no quadrante esquerdo baixo do abdômen. </li><li> Colocar o mouse em uma câmara de aquecimento até que esteja completamente anestesiado. Verifique a profundidade da anestesia com resposta a pitada dedo do pé. </li><li> Colocar o mouse em um estágio cirúrgico, em decúbito dorsal (barriga para cima lado) posição. Tape as patas fore-palmas para cima e na sola patas traseiras, até o palco. </li><li> Aplique uma quantidade liberal de agente depilatório (por exemplo, Nair) no pescoço entre a mandíbula eo esterno. Massageie suavemente até que todo o cabelo é removido. </li><li> Limpe o agente depilatórios e aplicar quantidade generosa de Betadine para a área depilada. </li><li> Prepare uma polegada de comprimento seções de 6-0 seda para ligadura. Cada rato vai precisar de dois pedaços de sutura. </li><li> Usando uma tesoura afiada pequena, faça uma incisão 4-6mm vertical no meio do pescoço. A pele e da fáscia subjacente precisam ser cortadas. </li><li> Mover a parótida esquerda da linha média para a esquerda e começar a dissecar sem rodeios logo à direita da traquéia. Você deve ser capaz de identificar a carótida esquerda pulsante comum facilmente. </li><li> Siga as carótida comum caudalmente até localizar a bifurcação. </li><li> Sem rodeios dissecar a bifurcação para expor os seguintes quatro ramos distais a artéria carótida comum esquerda: artéria carótida externa, artéria carótida interna, artéria occipital e da artéria tireóidea superior. Estas embarcações, de tireóide, especialmente superior, pode ser frágil. Tenha muito cuidado com o seu esvaziamento. </li><li> Empate fora da carótida externa ACIMA superior da tireóide 6-0 fio de seda. Para fazer isso, passe um fórceps debaixo da artéria e pegar um pedaço de sutura precut com a ajuda do seu fórceps outros. Puxe o fio para passar debaixo da artéria. Amarre firmemente evitando qualquer tecido circundante ser pego no nó. Se você amarrar abaixo da decolagem da artéria tireoidiana superior, até o final do procedimento você vai efetivamente ter realizado uma ligadura completa que é um modelo substancialmente diferente. </li><li> Amarrar as artérias carótida interna e occipital, com um nó usando a mesma técnica. </li><li> Verificar a posição de suturas e patência da artéria tireóidea superior. </li><li> A pele ea pele aproximada perto usando uma pequena quantidade de tecido-Mend. </li><li> Camundongos lugar em uma câmara de aquecimento até a recuperação. Recuperação normalmente leva 30 a 60 minutos. </li><li> Uma única dose de buprenorfina (0.1mg/Kg) deve ser administrado imediatamente após a cirurgia, se a anestesia utilizada não proporcionar alívio da dor prolongada (ou seja, isoflurano inalado) ou se o animal está em perigo nas primeiras 24 horas. Em nossa experiência, a dose de quetamina administrada para anestesia fornece analgesia suficiente quando a cirurgia é realizada por cirurgião experiente e sem analgesia adicional é necessária. </li></ol> 2. Carótida exame ultra-sonográfico <ol><li> Para validar se a ligadura parcial induzida perturbado fluxo, fluxo carotídeo devem ser examinados um dia pós-ligadura </li><li> Induzir a anestesia com isoflurano - caixa de indução da anestesia pode ser usada, se necessário </li><li> Coloque os ratos anestesiados no palco de imagem, lado de barriga para cima </li><li> Tape braços e pernas para ECG sensor de imagem no palco </li><li> Desfolhar pescoço pela aplicação liberal de Nair (esta etapa só é necessária se não tiver feito para o procedimento ligadura) </li><li> Insira o termômetro retal para registro de temperatura </li><li> Aplique gel eco no pescoço </li><li> Iniciar em modo-B. </li><li> Plano de imagem deve ser de 90 graus (botão na sonda deve apontar para o nariz do mouse) </li><li> Menor sonda para o pescoço do mouse até a imagem é obtida. </li><li> Manipular estágio esquerda e direita até traquéia (mid-line estrutura) é identificado </li><li> Identificar artéria carótida comum esquerda </li><li> Estágio de imagem inclinação, para que um ângulo é criado entre o plano de imagem e da carótida. Quanto maior o ângulo isso, o forte é o sinal Doppler será. </li><li> Lugar onda de pulso Doppler no meio da carótida comum esquerda. </li><li> Use correção do ângulo, conforme necessário. </li><li> Repetir as medições sobre a carótida comum direita. </li><li> Ligadura parcial da carótida sucesso resultará em redução global no fluxo (~ 80-90%) na carótida comum esquerda em comparação com o lado direito, com reversão do fluxo de entrada para a aorta durante a diástole. </li><li> Uma vez que as imagens foram satisfatórios obtidos, desligue a anestesia, limpe echo off gel ratos e camundongos livre de res fitatraints. Coloque os ratos na câmara de recuperação aquecido. </li></ol> 3. Isolamento de RNA íntima carótida <ol><li> Sacrifício camundongos por inalação de CO 2 de acordo com o protocolo institucional IACUC </li><li> Tape as patas a uma toalha de papel. </li><li> Cortar a pele do rato do abdômen para o topo do tórax. </li><li> Abrir a parede abdominal abaixo da caixa torácica com uma tesoura afiada. </li><li> Levantar o esterno com uma pinça e corte o diafragma e, em seguida cortar as costelas para expor o coração. </li><li> Cortar a veia cava com uma tesoura. </li><li> Perfundir pressão (120 mmHg) por 2 a 3 min com solução salina contendo 10 Unidades / mL de heparina através do ventrículo esquerdo até os pulmões e fígado tornar-se pálida. </li><li> Cortar a pele do pescoço e remover toda a gordura, músculos e tecidos conectivos até as artérias carótidas são expostos. </li><li> Posicione o mouse em um microscópio de dissecação. </li><li> Punção um furo logo abaixo os sites ligadura na carótida esquerda para a segunda perfusão. </li><li> Perfundir pressão novamente para min ~ 1 com soro fisiológico contendo 10 Unidades / mL de heparina através do ventrículo esquerdo, certificando-se a carótida esquerda é bem perused. </li><li> Usando uma pinça de ponta fina e uma tesoura pequena mola, remova cuidadosamente os tecidos peri-adventícia ao redor das carótidas. Tenha cuidado para não espremer ou esticar a carótidas durante esta etapa de limpeza. </li><li> Cortar a artéria carótida esquerda entre o arco aórtico e os pontos de ligação acima da bifurcação da carótida. </li><li> Cortar a artéria carótida direita entre o ponto de ramificação da artéria subclávia direita e na bifurcação da carótida. </li><li> Transferência das carótidas a um prato 35 milímetros cultura, contendo gelada HBSS. Se necessário, remova cuidadosamente qualquer tecido peri-adventícia restantes. </li><li> Prepare uma seringa de insulina (3 / seringa de 10 ml) com uma agulha de 29G, preencha com 150 mL de buffer QIAsol lise (Qiagen) por cada carótida. </li><li> Insira cuidadosamente a ponta da agulha em uma das extremidades da carótida. </li><li> Enquanto mantém a carótida ea ponta da agulha com uma pinça, rapidamente (~ 1 seg) liberar o buffer de lise QIAsol (150 mL) em um tubo de 1,5 ml (eluato íntima). </li><li> Lavar o restante da carótida (media + adventícia) de vez em HBSS, colocá-lo em um tubo de 1,5 ml, e encaixe-congelamento em nitrogênio líquido. </li><li> Intima eluato e os restos congelados são então utilizados para o isolamento + íntima ou mídia RNA adventícia usando o mini-kit miRNeasy (QIAGEN), de acordo com as instruções do fabricante. </li></ol> 4. Resultados representativos: Nós parcialmente ligada esquerdo do mouse artérias carótidas e ultra-sonografia foi realizada um dia após o procedimento. Conforme mostrado na Figura 1, ligadura parcial sucesso reduz a velocidade do fluxo sanguíneo e inverte o fluxo (fluxo perturbado) na artéria carótida comum esquerda durante a diástole. Ligadura parcial da ApoE knockout (KO) ratos acompanhados por uma dieta rica em gordura induz a aterosclerose robusta na artéria carótida comum esquerda (LCA), mas não na carótida direita contralateral, por duas semanas (Figura 2). RNA coletados a partir da íntima carótida contém genes marcadores endoteliais como PECAM-1, enquanto livre de medial do músculo liso genes de células marcador como um SMA (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/1861/1861fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: Esquema da anatomia carótida e ligadura: Três ramos da artéria carótida comum esquerda (LCA) [artéria carótida externa (ACE), artéria carótida interna (ACI) e artéria occipital (OA)] foram ligados, deixando a artéria tireóidea superior (STA) aberto. <img src="/files/ftp_upload/1861/1861fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: As imagens de ultra-som mostram perfis de velocidade de fluxo e revelam que a ligadura parcial induz inversão de fluxo (indicado por setas) na LCA durante a diástole. Fluxo em RCA permanece inalterado após a ligadura. <img src="/files/ftp_upload/1861/1861fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3: ligadura parcial e alto teor de gordura da dieta rapidamente induz aterosclerose em camundongos ApoE LCA de camundongos ApoE KO KO foram parcialmente ligada e alimentados com a dieta rica em gordura para 1-3 semanas.. Cortes congelados de LCA foram coradas com Oil Red-O-. <img src="/files/ftp_upload/1861/1861fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Método de preparação RNA íntima. RNA íntima e média + adventícia (m + a) RNA foram obtidos a partir sham-operado RCA e LCA em camundongos C57BL / 6. RNAs foram analisados ​​por semi-quantitativa de RT-PCR (A) e qPCR (B, C) ​​para PECAM-1 e α-SMA utilizando 18 anos como um controle interno. Gráficos de barras são média ± EPM, n = 3.

<ol><li>Korshunov, V. A., Berk, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-induced+vascular+remodeling+in+the+mouse%3A+a+model+for+carotid+intima-media+thickening%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow-induced vascular remodeling in the mouse: a model for carotid intima-media thickening.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (12), 2185-2191 (2003).</li>
<li>Sullivan, C. J., Hoying, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-dependent+remodeling+in+the+carotid+artery+of+fibroblast+growth+factor-2+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow-dependent remodeling in the carotid artery of fibroblast growth factor-2 knockout mice.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 22 (7), 1100-1105 (2002).</li>
<li>Nam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+carotid+ligation+is+a+model+of+acutely+induced+disturbed+flow%2C+leading+to+rapid+endothelial+dysfunction+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 297 (4), H1535-H1543 (2009).</li>
</ol>

Neste procedimento, a identificação adequada de todos os ramos da carótida comum, incluindo a carótida externa, carótida interna, artéria occipital e da artéria tireóidea superior é essencial. Também é importante verificar o padrão de fluxo com ultra-som, como demonstrado. Em nossas mãos experientes, nossa taxa de sucesso de cirurgias ligadura parcial com base nos estudos de ultra-som de mais de 500 ratos é melhor do que 90%. Para a carótida preparações íntima RNA, é importante prestar atenção à aparência da carótida ap...

<table><tbody><tr><td>Soro fisiológico (cloreto de sódio 0,9%)</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>2B1323</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de insulina (seringa de 3/10 ml 29g)</td><td>Tyco Healthcare, Covidien</td><td>8881600145</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Cellgro</td><td>21-023</td><td></td></tr><tr><td>Kit miRNeasy mini (incluindo QIAzol)</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de microimagem de alta resolução Vevo 770</td><td>VisualSonics, inc.</td><td>a. Sistema Visualsonics 770 b. Estágio de imagem c. Sistema de trilho integrado Vevo d. Cabeçote de varredura RMV para camundongos</td><td>ou sistema semelhante</td></tr><tr><td>Sutura de seda 6-0, estéril</td><td>Covidien</td><td>s-1172 c2</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura pequena</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5675</td><td>ou similar</td></tr><tr><td>Pinça cirúrgica</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5005</td><td>ou similar</td></tr><tr><td>Tissue Mend II</td><td>Webster Veterinary</td><td>07-856-7946</td><td></td></tr></tbody></table>

um modelo de disturbed aterosclerose flow-induzido em rato artéria carótida pela ligadura parcial e um método simples de isolamento de rna a partir do endotélio carótidas

A Model of Disturbed Flow-Induced Atherosclerosis in Mouse Carotid Artery by Partial Ligation and a Simple Method of RNA Isolation from Carotid Endothelium

Apesar da conhecida associação perto, evidências diretas ligando fluxo perturbado a aterogênese tem faltado. Recentemente, usou uma versão modificada do carótida métodos de ligadura parcial [1,2] para mostrar que induz agudamente condições de baixo fluxo e oscilatório, duas características-chave do fluxo perturbado, no rato artéria carótida comum. Usando esse modelo, nós fornecemos evidências diretas de que o fluxo perturbado realmente leva ao desenvolvimento de aterosclerose rápido e robusto em apolipoproteína rato knockout E [3]. Também desenvolveu um método de preparação de RNA endotelial com elevado grau de pureza da carótida íntima do mouse [3]. Usando este modelo de mouse e método, encontramos que a ligadura parcial causa disfunção endotelial em uma semana, seguido pela formação de ateromas robusta e rápida em duas semanas em um modelo de camundongo hiperlipidêmicos, juntamente com recursos de formação de lesão complexa como a neovascularização intraplaca por quatro semanas. Essa rápida<em&gt; In vivo</em&gt; Modelo eo método de preparação endotelial RNA poderia ser usado para determinar os mecanismos moleculares subjacentes fluxo de regulação dependente da biologia vascular e doenças. Além disso, ele poderia ser usado para testar várias intervenções terapêuticas visando a disfunção endotelial e aterosclerose na duração do estudo consideravelmente reduzido.

Esta descreve uma cirurgia de ligadura parcial da carótida, o que causa as condições de fluxo perturbado e desenvolvimento da aterosclerose subsequente (em duas semanas) com intraplaca neo-vascularização (em quatro semanas) em ratos artéria carótida comum. Descrevemos também um novo método de isolamento de RNA a íntima carótida, proporcionando RNA de alta pureza endoteliais.

Um modelo de Disturbed Aterosclerose Flow-induzido em rato artéria carótida pela ligadura parcial e um método simples de isolamento de RNA a partir do endotélio Carótidas

Apesar da bem conhecida e estreita associação, tem faltado evidência direta que vincule o fluxo perturbado à aterogênese. Recentemente, utilizamos um...

Este vídeo demonstra uma cirurgia de ligadura parcial da carótida na qual a artéria carótida externa, a artéria carótida interna e a artéria occipital são ligadas em um camundongo anestesiado para induzir condições de fluxo perturbado e o subsequente desenvolvimento rápido de aterosclerose. O sucesso da cirurgia é verificado por ultrassonografia; em seguida, as carótidas ligadas e controladas são coletadas do camundongo eobtém-se RNA endotelial de alta pureza. Olá, meu nome é Doug Na, do laboratório do Prof. Jo da Engenharia Biomédica e da Divisão de Cardiologia da Georgia Tech e da Universidade Emory.Olá, meu nome é Amir Revan. Também sou do Laboratório JO. Vou demonstrar a verificação por ultrassom da ligadura. E eu sou CHI, também do Laboratório Jaw.Hoje demonstrarei a preparação interna de RNA. Mostraremos um procedimento para ligadura parcial da carótida, ultrassonografia, verificação da ligadura e um método para isolamento de RNA da íntima. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar os efeitos do estresse cisalhante na aterosclerose.Então vamos começar. Antes de iniciar este procedimento, verifique a profundidade da anestesia induzida por cetamina e xilazina. Em um camundongo de oito semanas de idade, mediante compressão do dedo do pé, posicione o camundongo sobre uma plataforma cirúrgica na posição supina, fixando as quatro patas à plataforma, com as palmas voltadas para cima.Em seguida, fixe as patas traseiras com fita adesiva, com as solas voltadas para baixo. Use uma gaze como almofada para o pescoço do camundongo. A seguir, aplique uma quantidade generosa de agente depilatório no pescoço do animal, entre a mandíbula e o esterno.Massage suavemente a área até que todo o cabelo seja removido. Usando um aplicador de algodão, remova o agente depilatório. Em seguida, aplique uma quantidade generosa de Betadine utilizando um pequeno par de tesouras afiadas.Realize uma incisão vertical de quatro a seis milímetros no meio do pescoço do animal, cortando a pele e a fáscia subjacente. Usando pinças de dissecação, mova suavemente a glândula carótida esquerda da linha média para o lado esquerdo do animal. Disseque o tecido de forma romba utilizando pinças de dissecação.Para revelar a artéria carótida comum pulsante. Siga a artéria carótida comum cuidadosamente. Para localizar a bifurcação.Disseque cuidadosamente a bifurcação para expor o seguinte: quatro ramos distais da artéria carótida comum esquerda, artéria carótida externa, artéria carótida interna, artéria occipital e artéria tireóidea superior. Esses vasos, especialmente a tireóidea superior, podem ser muito frágeis.Passe um par de pin&ccedil;as sob a art&eacute;ria car&oacute;tida externa acima da tire&oacute;idea superior e pegue um peda&ccedil;o de cerca de 2,5 cm de sutura de seda n&uacute;mero seis de outro par de pin&ccedil;as. Puxe suavemente a sutura para pass&aacute;-la sob a art&eacute;ria. Amarre firmemente a car&oacute;tida externa, evitando qualquer tecido circundante.Usando a mesma técnica, amarre a artéria carótida interna e as artérias occipitais com um único nó. Após verificar a posição dos pontos e a perviabilidade da artéria tireóidea superior por inspeção visual, reposicione a glândula parótida, aproxime a pele e utilize grampos de tecido para fechar a pele. Após o procedimento cirúrgico, coloque o camundongo em uma câmara de aquecimento até que se recupere.Tipicamente de 30 a 60 minutos. Em seguida, os camundongos podem ser transferidos para sua área habitual de alojamento. Coloque um pouco de alimento no fundo da gaiola, pois os camundongos podem sentir desconforto ao levantar para alcançar o alimento durante o primeiro dia.Uma dose única de buprenorfina deve ser administrada no dia seguinte para alívio da dor. Um dia após a ligadura. Prepare o animal anestesiado com isoflurano para ultrassonografia, colocando-o sobre a plataforma de imagem com o ventre voltado para cima.Fixe os braços e as pernas ao sensor de ECG com fita adesiva. Aplique gel eco ao pescoço do animal. A temperatura corporal do animal deve ser monitorada durante todo o procedimento.Ligue o computador e o software de imagem. Selecione o usuário e a sonda de eco apropriados. Configure o ultrassom para o modo bee.Em seguida, com o botão da sonda voltado para o focinho do camundongo, abaixe a sonda sobre o pescoço do camundongo até obter uma imagem. Manipule o estágio da sonda para a direita e para a esquerda até que a traqueia possa ser identificada. Em seguida, localize a artéria carótida comum esquerda e incline o estágio de imagem para que um ângulo seja criado entre o plano de imagem e a carótida.Altere o ultrassom do modo B para doppler de onda pulsada, mantendo a sonda no meio da artéria carótida comum esquerda. Use o botão de correção de ângulo para ajustar o ângulo de forma que a linha de correção de ângulo fique paralela à artéria carótida comum. Capture uma imagem pressionando o botão de armazenamento de quadros.O perfil de velocidade do sangue na carótida comum será documentado. Espera-se uma inversão do perfil de velocidade durante a diástole. Repita os passos anteriores na carótida comum direita para comparação.A velocidade será maior e nenhuma inversão será observada na artéria carótida comum direita. Após a obtenção de imagens satisfatórias, desligue a anestesia e remova o gel ecográfico do camundongo. Libere o camundongo das restrições de fita adesiva.Coloque o animal em uma câmara de recuperação aquecida. A recuperação da inalação de isoflurano geralmente ocorre em menos de cinco minutos. Prenda com fita a pausa de um camundongo eutanasiado com dióxido de carbono em uma toalha de papel usando uma tesoura.Corte a pele do camundongo do abdômen até o topo do tórax. Em seguida, usando uma tesoura afiada, abra a parede abdominal abaixo da caixa torácica com auxílio de uma pinça. Levante o esterno e corte o diafragma.Remova a caixa torácica para expor o coração. Em seguida, corte a veia da CVA e, utilizando um kit de perfusão com agulha borboleta, realize uma perfusão por pressão com soro fisiológico normal contendo 10 unidades por mililitro de heparina através do ventrículo esquerdo por dois a três minutos, até que os pulmões e o fígado fiquem pálidos. Após a perfusão com soro fisiológico, corte a pele do pescoço e remova todas as gorduras, músculos e tecidos conjuntivos até expor as artérias carótidas.Agora, posicione o camundongo sob um microscópio estereoscópico e, com uma agulha de calibre 29, faça um orifício pontual logo abaixo dos locais de ligadura na carótida esquerda para a segunda perfusão. Realize novamente a perfusão por pressão por cerca de um minuto através do ventrículo esquerdo, certificando-se de que a carótida esquerda seja bem perfundida após a segunda perfusão. Utilize pinças de ponta fina e tesouras pequenas de mola para remover cuidadosamente os tecidos periadventiciais que envolvem as carótidas.Tenha cuidado para não comprimir ou esticar as carótidas durante esta etapa de limpeza, agora entre o arco aórtico e os pontos de ligadura acima da bifurcação carotídea. Corte a artéria carótida esquerda entre o ponto de bifurcação da artéria subclávia direita e a bifurcação carotídea. Corte a artéria carótida direita.Transfira as carótidas para uma placa de cultura de 35 milímetros contendo HBSS gelado. Remova cuidadosamente qualquer tecido periadventicial remanescente. Insira uma seringa de insulina com agulha de 29 graus em uma das extremidades de uma carótida e segure a carótida e a ponta da agulha com pinça.Rapidamente e com cuidado. Lave cada carótida com 150 microlitros de tampão de lise cazo, coletando o tampão em um tubo de 1,5 mililitro rotulado como intima eit. Por fim, enxágue cada carótida uma vez em HBSS.Em seguida, coloque-o em um tubo microfuge de 1,5 mililitro rotulado como meio mais adventícia e congele rapidamente. Congele-o em nitrogênio líquido. O RNA pode então ser extraído das amostras congeladas usando gin's.Kit mini Micro RZ. O exame ultrassonográfico de um camundongo foi realizado um dia após a ligadura parcial da artéria carótida esquerda, conforme mostrado nesta figura. A ligadura parcial bem-sucedida reduz a velocidade do fluxo sanguíneo e inverte o fluxo na artéria carótida comum esquerda durante a diástole. A ligadura parcial de camundongos knockout para APOE mantidos em dieta rica em gordura induz aterosclerose acentuada na artéria carótida comum esquerda, mas não na carótida direita contralateral, em duas semanas. A aterosclerose é demonstrada com coloração com vermelho de óleo para lipídios e contra-coloração com hematoxilina para núcleos.O RNA coletado da íntima carótida contém genes marcadores endoteliais, como pcam, e um marcador de células musculares lisas da média. Genes como alfa SMA estão ausentes no RNA coletado do restante da artéria, marcado como M+A (mídia mais adventícia), onde o marcador de músculo liso está presente, enquanto o marcador endotelial está ausente. Acabamos de mostrar como realizar uma ligadura parcial da carótida.Utilize ultrassom para verificar a ligadura e também um método para o isolamento de RNA intimal. Ao realizar este procedimento, é essencial identificar corretamente os ramos da artéria comum correta e assegurar que o padrão do ramo da artéria tireoide superior permaneça, enquanto os demais ramos são firmemente ligados. É importante verificar o resultado da ligadura utilizando ultrassom durante o procedimento; em um preparo simples, preste atenção para que o iLet lavado não entre em contato com nenhuma outra parte da artéria, exceto o lúmen. Dito isso, obrigado por assistir e boa sorte em seus experimentos.

a-model-disturbed-flow-induced-atherosclerosis-mouse-carotid-artery

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

O manguito constricting apresentado neste artigo é projetado para induzir a aterosclerose na artéria carótida comum murino. Devido à forma cônica de sua luz interior do manguito implantado gera regiões bem definidas de baixa, alta tensão e de cisalhamento oscilatório desencadear o desenvolvimento de lesões ateroscleróticas de diferentes fenótipos inflamatórios.

Implantação de um Cuff Carotid para Triggering Shear-estresse aterosclerose induzida em camundongos

Um modelo de implante de stent na artéria carótida do rato é descrito. Comparado com outros métodos similares, este procedimento é muito rápido, simples e acessível, oferecendo a possibilidade de estudar em uma forma conveniente a reação da parede vascular para diferentes stents farmacológicos e os mecanismos moleculares de reestenose.

Um modelo murino de implante de stent na artéria carótida para o Estudo da reestenose

Descrevemos uma técnica cirúrgica que produz lesão por fio na artéria femoral de camundongos para induzir hiperplasia neointimal para servir como um sistema de teste modelo para a entrega perivascular de compostos terapêuticos para a inibição da reestenose.

Modelo murino de artéria femoral Injury fio com a implantação de uma droga patch Entrega perivascular

Este estudo descreve um procedimento invasivo para a indução de aterosclerose acelerada em camundongos. Em comparação com outros métodos que utilizam lesões elétricas ou induzidas por criodes, a lesão induzida por mecânica imita a condição humana da restenose após terapias de revascularização e é ideal para o estudo dos mecanismos moleculares envolvidos.

Indução de Aterosclerose Acelerada em Camundongos: O Modelo de "Lesão por Fio"

A compreensão dos mecanismos celulares e moleculares da re-endotelização após lesão desnudamento arterial é de suma importância na prevenção de trombose e restenose das artérias. Aqui nós descrevemos um protocolo de lesão desnudamento arterial reprodutível da aorta abdominal infra-renal. O procedimento foi desenvolvido para investigar os mecanismos subjacentes que regulam a regeneração endotelial usando modelos do rato.

Reprodutível Arterial Desnudamento Lesão por aorta abdominal infrarrenal fixação num modelo murino

Apresentamos um método para isolar células e núcleos endoteliais do lúmen de artérias carótidas de camundongos expostas a condições de fluxo estáveis ou perturbadas para a realização de experimentos ômicos unicelulares.

Isolamento de células endoteliais do lúmen de artérias carótidas de camundongos para experimentos multi-ômicos unicelulares

O presente protocolo descreve uma nova técnica de bandagem aórtica em camundongos para induzir hipertrofia cardíaca por sobrecarga pressórica. Para bandas, um anel de borracha com um diâmetro interno fixo é usado. Esta nova técnica promete menos variância e mais dados reprodutíveis para experimentos futuros.

Bandas Aórticas O-Ring versus Constrição Aórtica Transversa Tradicional para Modelagem da Hipertrofia Cardíaca Induzida por Sobrecarga de Pressão

Aqui descrevemos um protocolo de digestão celular em duas etapas para o preparo de uma suspensão unicelular de artérias carótidas de camundongos.

Preparação de uma Suspensão Unicelular de Artérias Carótidas de Camundongos para Sequenciamento Unicelular

O presente protocolo descreve um método cirúrgico padronizado para a indução de aneurismas carotídeos em modelo murino por meio de uma única operação cirúrgica.

Um modelo murino de formação de aneurisma carotídeo

Este estudo tem como objetivo desenvolver um método eficaz para alcançar a hemostasia nas artérias de camundongo.

Procedimento simples e eficaz para hemostasia em artérias de camundongos

Aprenda a realizar ligadura parcial da carótida em camundongos para induzir fluxo perturbado e aterosclerose rápida. Este método inclui verificação por ultrassom e isolamento de RNA endotelial de alta pureza.

Um modelo de Disturbed Aterosclerose Flow-induzido em rato artéria carótida pela ligadura parcial e um método simples de isolamento de RNA a partir do endotélio Carótidas (Vídeo) | JoVE Journal

Um modelo de Disturbed Aterosclerose Flow-induzido em rato artéria carótida pela ligadura parcial e um método simples de isolamento de RNA a partir do endotélio Carótidas

Explorar mais vídeos