Name: Electron Cryotomography de células bacterianas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-06T13:20:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Aprenda crio-tomografia eletrônica para visualizar a ultraestrutura de células bacterianas em estado nativo com resolução macromolecular. Este método utiliza congelamento por imersão e alta pressão.

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Este trabalho foi financiado em parte pelo National Institutes of Health Grants AI067548 R01, R01 GM081520, R01 GM086200, R01 AI049194 e P01 GM066521 para GJJ, bem como o Howard Hughes Medical Institute, o Instituto Beckman em Caltech, e presentes a partir da Caltech Gordon e Betty Moore Foundation e Agouron Institute. MSL é suportado pelo NIH conceder 2R37-A1041239-06A1 para Pamela S. Björkman. Leica Microsystems Inc. gentilmente fornecido conteúdo de vídeo de coleta cryosection. Os resultados representante do Treponema primitia foram coletados e processados ​​por Gavin E. Murphy, e publicado na Molecular Microbiology com o título &quot;ultra-estruturas Novel de Treponema primitia e suas implicações para a mobilidade&quot;. (Murphy, G. et al. Mol. Microbiol. 67, 1184-1195, 2008).

<ol><li>Jensen, G. J., Briegel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+electron+cryotomography+is+opening+a+new+window+onto+prokaryotic+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).</li>
<li>Li, Z., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryotomography%3A+a+new+view+into+microbial+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Electron cryotomography: a new view into microbial ultrastructure.</a> Curr. Opin. Microbiol. 12, 333-340 (2009).</li>
<li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+biological+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of biological complexity.</a> J. Struct. Biol. 138, 85-91 (2002).</li>
<li>Iancu, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryotomography+sample+preparation+using+the+Vitrobot%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot.</a> Nat. Protocols. 1, 2813-2819 (2007).</li>
<li>Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+for+cryofixation+by+high-pressure+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">A new approach for cryofixation by high-pressure freezing.</a> J. Microsc. 203, 285-294 (2001).</li>
<li>Ladinsky, M. S., Pierson, J., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitreous+cryosectioning+of+cells%2C+facilitated+by+a+micromanipulator%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Vitreous cryosectioning of cells, facilitated by a micromanipulator.</a> J. Microsc. 224, 129-134 (2006).</li>
<li>Pierson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+technique+of+vitreous+cryo-sectioning+for+cryo-electron+tomography%3A+Electrostatic+charging+for+section+attachment+and+implementation+of+an+anti-contamination+glove+box%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Improving the technique of vitreous cryo-sectioning for cryo-electron tomography: Electrostatic charging for section attachment and implementation of an anti-contamination glove box.</a> J. Struct. Biol. 169, (2009).</li>
<li>Suloway, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated%2C+sequential+tilt-series+acquisition+with+Leginon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon.</a> J. Struct. Biol. 167, 11-18 (2009).</li>
<li>Fernando, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markov+random+field+based+automatic+image+alignment+for+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Markov random field based automatic image alignment for electron tomography.</a> J. Struct. Biol. 161, 260-275 (2008).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-axis+tomography%3A+an+approach+with+alignment+methods+that+preserve+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual-axis tomography: an approach with alignment methods that preserve resolution.</a> J. Struct. Biol. 120, 343-352 (1997).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Mostramos neste artigo como fazer video ECT de células bacterianas. Limitado pelo espaço e tempo, só mostramos o protocolo geral. Mais detalhes podem ser encontrados em documentos, informações on-line ou outros fornecidos pelos fabricantes dos equipamentos e desenvolvedores de software e de grupos de pesquisa ECT. Dependendo da espécie bacteriana diferentes estudados, os equipamentos utilizados e os juros estruturais nas células, o protocolo e os parâmetros experimental precisa ser testado e otimizado.

<table><tbody><tr><td>Poli-L-Lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>solução 0,1%</td></tr><tr><td>MKIII Vitrobot</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução coloidal de ouro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1527-25ml</td><td>10 nm</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Invitrogen</td><td>P2489</td><td>10%</td></tr><tr><td>Papel filtro nº 1</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1001 055</td><td></td></tr><tr><td>Dextrana</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31389</td><td>15-25%, PM 39000</td></tr><tr><td>Plaqueta de latão com cúpula</td><td>Swiss Precision Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Con geladora de alta pressão Bal-Tec HPm 010</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Criomicrotomo ultracintrífugo UC6/FC6</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trinca criogênica de diamante 45</td><td>Diatome</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ionizador linha estática II</td><td>Diatome</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transportador criogênico CX100</td><td>Taylor-Wharton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estação de carregamento MSH</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido Ti E/B</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Personalizado</td></tr><tr><td>Estágio de microscopia criogênica</td><td>FEI</td><td></td><td>Personalizado</td></tr><tr><td>TF30-polara</td><td>FEI</td><td></td><td>Com UltraCam da Gatan</td></tr><tr><td>Amira</td><td>Visage Imaging</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

electron cryotomography de células bacterianas

Electron Cryotomography of Bacterial Cells

Embora muito já se conhece sobre o metabolismo básico de células bacterianas, muitas questões fundamentais continuam sem resposta surpreendentemente, incluindo, por exemplo como gerar e manter formas de células específicas, estabelecer polaridade, segregar seus genomas, e dividir. A fim de compreender esses fenômenos, as tecnologias de imagem são necessários que a ponte resolução entre microscopia de luz de fluorescência e de alta resolução métodos como cristalografia de raios X e espectroscopia de RMN. Electron cryotomography (ECT) é uma tecnologia emergente que faz exatamente isso, permitindo que o ultra-estrutura das células para ser visualizado em um estado quase original, em três dimensões (3D), com &quot;macromolecular&quot; resolução (~ 4nm). 1, 2 Em ECT, as células são gravadas em um vítreo, &quot;frozen-hidratado&quot; estado em um microscópio eletrônico de transmissão crio (cryoTEM) a baixa temperatura (&lt;-180 ° C). Para as células delgadas (até ~ 500 nm de espessura 3), células intactas são mergulhar congelado dentro de mídia através EM grades em criogênios, como etano ou etano / propano misturas. Células mais espessas e biofilmes também pode ser trabalhada em um estado vítreo, em primeiro lugar &quot;congelamento de alta pressão&quot; e depois &quot;, crio-seccionamento-los&quot;. Uma série de imagens bidimensionais de projeção são então recolhidos através da amostra, uma vez que é inclinada de forma incremental ao longo de um ou dois eixos. Uma reconstrução tridimensional, ou &quot;tomografia&quot; pode então ser calculada a partir das imagens. Enquanto a ECT exige instrumentação caro, nos últimos anos, tem sido utilizado em alguns laboratórios para revelar as estruturas de vários apêndices externos, as estruturas dos envelopes de células diferentes, as posições e estruturas de filamentos do citoesqueleto, e os locais e arquiteturas de grande macromolecular assembléias, tais como motores flagelares, os compartimentos internos e matrizes quimiorreceptora. 1, 2 Neste artigo de vídeo que ilustram como as células de imagem com a ECT, incluindo os processos de preparação de amostra, coleta de dados, a reconstrução tomogram e interpretação dos resultados através da segmentação e, em alguns casos com correlação microscopia de luz.

Que vamos mostrar aqui como usar elétron cryotomography (ECT) para estudar a ultra-estrutura das células bacterianas em quase nativo estados, a &quot;macromolecular&quot; (~ 4 nm) resolução.

Electron Cryotomography de células bacterianas

Embora já se saiba muito sobre o metabolismo básico das células bacterianas, muitas questões fundamentais permanecem surpreendentemente sem resposta, inclusive para...

Neste vídeo, imagens 3D de células bacterianas em estados próximos ao nativo com resolução molecular são geradas por tomografia crioeletrônica. Isso é realizado primeiramente por congelação por imersão de células intactas, ou alternativamente por congelação em alta pressão e crioseccionamento dos pellets celulares. Uma série de imagens projetadas M é adquirida e utilizada para gerar uma reconstrução tridimensional, ou Tom Graham, que é segmentada e posteriormente analisada computacionalmente.Olá, sou Grant Jensen da Divisão de Biologia do Caltech, e esta é Sonya Chen, que organizou nossa apresentação. Hoje vamos mostrar como realizar a tomografia crioeletrônica de células bacterianas. Normalmente, um único indivíduo realizaria todo o procedimento, mas como nossos protocolos foram desenvolvidos por meio de experiências compartilhadas, incluiremos todas as pessoas que atualmente trabalham no laboratório.Além de Sonya e de mim no vídeo, você verá Megan Dobro, Ariana, Bri, Miguel, Alistair McDowell, Mark Rodinsky e Jen. Outros membros do laboratório produziram as capturas de tela do computador e ajudaram a preparar o protocolo escrito que acompanha, incluindo Morgan Bebe, Martin Piller, Jane Ding, Joe Lee, Lou GaN, Aliza Tova e Dylan Morris. Ariana começará mostrando como congelamos por imersão células bacterianas.Para células bacterianas finas, uma suspensão de células intactas é congelada rapidamente em uma grade de microscopia eletrônica. Aqui, o processo é demonstrado utilizando um congelador criogênico automático comercial: comece examinando os cultivos bacterianos para garantir que estejam livres de contaminantes e em uma confluência ou concentração apropriada. Submeta a grade de ME revestida com carbono à descarga elétrica por dois a quatro minutos. Em seguida, misture 100 microlitros de solução coloidal de ouro com 25 microlitros de uma solução de BSA a 5%.Centrifugue a mistura a 18.000 G durante 15 minutos. Após a centrifugação, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet de ouro. Em 20 microlitros de solução celular, coloque a grade de ME no Vitra bot com umidade de 100%.Em seguida, aplique quatro microlitros da mistura celular à grade de microscopia eletrônica submetida à descarga luminosa. A grade é automaticamente tamponada por ambos os lados com papel filtro para remover o excesso de líquido e, então, mergulhada rapidamente em uma mistura líquida de etano e propano, resfriada por nitrogênio líquido. Remova cuidadosamente a grade da mistura de etano e propano e transfira-a rapidamente para uma caixa de armazenamento de grades mantida sob nitrogênio líquido. Para células mais espessas, o congelamento sob alta pressão evita a cristalização do gelo.O corte criomicrotômico subsequente torna as amostras finas o suficiente para ME. O processo de imagem começa com a centrifugação de 15 mililitros de células a 1000 RPM durante três minutos. Após a centrifugação, remova o sobrenadante e misture 0,5 mililitros do pellet celular remanescente com 0,5 mililitros de crioprotetor de dextrina 20%.Em seguida, centrifugue novamente a 13.000 RPM por 15 segundos. Após a sedimentação das células, remova o sobrenadante e pipete 0,1 mililitro da pasta do pellet superior para uma ponta de micropipeta selada a calor, que já contém 0,2 mililitros de crioprotetor de dextrina 20%. Centrifugue a mistura na ponta de micropipeta a 13.000 RPM por 30 segundos.Após a centrifugação, remova o sobrenadante. Um pellet compacto de cinco a 10 microlitros é visto na ponta selada. Transfira a pasta para uma das metades em forma de cúpula de uma placa metálica abobadada revestida com teflon já montada no braço do suporte do congelador de alta pressão, e em seguida, sela-a com sua tampa plana de latão correspondente.Em seguida, insira imediatamente o conjunto do braço no congelador de alta pressão previamente preparado. Sob pressão de 2100 bar, a unidade combinada de plaqueta de latão contendo as células é rapidamente resfriada por um jato de nitrogênio líquido sob alta pressão. Após o congelamento das células, remova rapidamente o conjunto do braço e mergulhe-o com urgência em um banho de nitrogênio líquido para evitar que a plaqueta aqueça.Em seguida, transfira a plaqueta para um porta-objeto tipo morsa pré-resfriado montado com firmeza na câmara do micrótomo criogênico para expor a cúpula bem congelada de células para o corte. As duas plaquetas de latão são cuidadosamente separadas sob nitrogênio líquido. Uma cúpula de células perfeitamente congelada terá aparência vítrea e estará livre de rachaduras e fissuras por nucleação de gelo.Usando o micrótomo criogênico, modele a região do domo externo para menos de 0,2 milímetros quadrados utilizando a ferramenta de corte de diamante com uma velocidade de corte rápida, mantendo uma profundidade de cerca de 200 micrômetros e com pulverização de spray antiestático direcionada à lâmina em ângulo baixo e às grades de suporte de cobre. Nas proximidades, avance cuidadosamente a lâmina de diamante até a face polida do bloco utilizando uma velocidade de corte de aproximadamente 0,4 milímetros por segundo e uma janela de corte estreita. Inicie o corte de fatias com espessura entre 50 e 350 nanômetros.Manobre um aplicador fino de rímel para prender as seções iniciais, deslizando-as para fora da borda em baixo ângulo da lâmina de diamante e para apoiar e guiar as fitas de seções sobre o suporte de grade de cobre. Uma vez que a grade esteja carregada, use uma sonda de prata polida resfriada para pressionar firmemente as fitas. Armazene as grades nas caixas de grades dentro de um transportador seco resfriado com nitrogênio líquido até que o microscópio esteja pronto.As células bacterianas na grade podem ser visualizadas usando um microscópio de luz criogênico. Aqui, será utilizado um microscópio invertido Nikon personalizado, TIB, com estágio criogênico FEI modificado. Carregue as grades nos cartuchos na estação criogênica e fixe-as usando os anéis de clipe de cobre; em seguida, coloque o cartucho em um tubo com nitrogênio líquido para transferência.Carregue até dois cartuchos no estágio criogênico pré-resfriado e mova a grade para a janela de visualização. Em seguida, abaixe a lente condensadora e foque a lente objetiva na grade. Localize as células e capture imagens.Para estudo correlacionado de LM e EM. A grade é escaneada ao redor da área das células para localizá-las posteriormente em EM. Após a aquisição de imagens da grade, coloque o cartucho de volta no tubo e mantenha o tubo em nitrogênio líquido até o momento de ser analisado em EM para obter uma TOM tridimensional da célula bacteriana.Uma série de imagens de projeção é obtida enquanto a amostra é inclinada progressivamente ao longo de um ou dois eixos no microscópio eletrônico criogênico; aqui, o procedimento é demonstrado utilizando o Legon com um TF 30 Polar criogênico, carregando até seis cartuchos em um suporte de múltipla seleção na estação criogênica. Em seguida, conecte-o ao TF 30 Polar, selecione um cartucho e insira-o na coluna do ME. Inicie o Legon no software cliente do computador do ME.Insira as condições da imagem para a legenda na sessão. Selecione os alvos nas imagens começando pela menor ampliação e envie-os para a próxima etapa com maior ampliação. Em seguida, coloque todos os alvos em fila para a coleta da série de inclinação e envie todos eles para a etapa final de tomografia.Adquira uma série de imagens. A amostra será inclinada progressivamente ao longo de um ou dois eixos no microscópio eletrônico criogênico. Após a conclusão do experimento, faça o download da série de inclinações concluída em uma estação de trabalho local para reconstrução.Os tomogramas das células bacterianas são calculados usando um software especializado. O programa Raptor é utilizado para reconstruir os tomogramas automaticamente e o eTomo pode ser usado para realizá-lo de forma semiautomática. Inspecione as séries de inclinação usando o visualizador 3D mod do IMOD e descarte aquelas que, devido a erros de rastreamento ou outros problemas, provavelmente não produzirão resultados satisfatórios.Um bom tomógrafo raptor é executado de forma distribuída nas máquinas Linux do laboratório usando as configurações básicas. Leva de 20 minutos a duas horas, dependendo do tamanho do arquivo, para gerar a tomografia. Quando o Raptor falha ou quando um pesquisador deseja garantir que a reconstrução seja ideal, o EMO pode ser usado para alinhar manualmente as imagens com cuidado.Siga as etapas de cada guia na interface gráfica do e tomo para reconstruir a Tomografia de Graham a partir da série de inclinações. Utilizamos uma base de dados interna baseada na web para organizar, armazenar, pesquisar e distribuir os dados tomográficos. A página principal de navegação apresenta uma imagem em miniatura e um vídeo destacado semelhante aos do YouTube.Para cada tomo Graham. Após o Tommo, os Grahams obtidos podem ser segmentados individualmente para ajudar a visualizar suas formas. Na segmentação 3D, o processo consiste em atribuir cada voxel da imagem 3D a uma região ou material específico.Aqui, um software de reconstrução é utilizado para gerar um modelo de superfície no qual cada região é mostrada com uma cor diferente e visualizada em filmes e animações tridimensionais da tomografia. Gráficos podem ser criados para resumir projetos e ilustrar descobertas em representações gráficas tridimensionais. Softwares como Amira ou Kymera podem ser usados para renderizar os quadros individuais do filme e do comercial.Softwares de edição de vídeo, como o Adobe Premiere, podem ser utilizados para editar o vídeo com fins comerciais. O Maya é usado para gerar a animação. Ele pode importar as superfícies do Amira, criar quadros-chave e renderizar em um vídeo.Aqui é apresentada uma série representativa de inclinação de dados de células inteiras para o Spiro Treponema Promesa, seguida por uma visualização fatia a fatia do tomograma reconstruído. A segmentação da célula de T. Promesa distingue sua membrana externa, membrana interna e estruturas superficiais, incluindo taças superficiais e arco de gancho superficial. A bactéria possui flagelos e motor axial, cone periplasmático e pilos.Este modelo mecânico mostra como o espiroqueta Treponema Promesa nada e como um cilindro interno ou núcleo é envolvido por uma bainha externa. Os flagelos se movem como rolos de tinta entre o cilindro interno e a bainha externa. À medida que os flagelos giram, o cilindro interno gira em sentido contrário dentro da bainha externa.Em um ambiente não viscoso, a célula gira inutilmente, mas em ambientes viscose, como aqueles nos quais T Promesa é encontrada na natureza, fibras externas ou outros objetos resistem à rotação da bainha externa, acelerando a rotação do cilindro interno e fornecendo materiais contra os quais a célula pode se impulsionar enquanto se perfura para a frente. Aqui são mostradas células reais de T promeus observadas por microscopia óptica. Acabamos de mostrar como realizar a tomografia crioeletrônica de células bacterianas.É claro que reconhecemos que esse tipo de trabalho exige investimentos significativos. Os microscópios eletrônicos criogênicos e os microscópios de fluorescência são sofisticados e caros, e também devem ser devidamente citados. Por exemplo, a fundação desta sala é uma laje de concreto mecanicamente isolada, com várias polegadas de espessura, apoiada sobre um solo especialmente compactado.O sistema de ar condicionado também é personalizado, com dutos grandes e curvas suaves para manter uma temperatura constante sem correntes de ar ou turbulência. As cortinas que você vê são colocadas para reduzir o ruído acústico. E, por fim, verificamos se esta sala está livre de campos eletromagnéticos interferentes.Embora as operações que mostramos no microscópio sejam agora em grande parte automatizadas, problemas ainda surgem com frequência e exigem diagnóstico especializado. Apesar disso, esperamos que assistir a este vídeo tenha ajudado você a compreender os procedimentos e os instrumentos envolvidos neste tipo de trabalho. Agradecemos sua atenção.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Fonte: Chetrit, D., et al. Aplicação de imagens de células vivas e tomografia crioeletrônica para resolver características espaço-temporais do sistema de secreção de pontos/ICM de Legionella pneumophila . J. Vis. Exp. (2020)O vídeo descreve como preparar amostras de Legionella pneumophila para tomografia crioeletrônica, combinando cultura bacteriana, marcação de nanopartículas de ouro e técnicas de vitrificação. O processo preserva as estruturas celulares nativas e permite imagens de alta...

Preparação de Legionella pneumophila para Tomografia Eletrônica Criogênica

Para preservar processos neuronais para análise ultra-estrutural, nós descrevemos um protocolo para revestimento dos neurônios primários em grades de microscopia eletrônica seguido de congelamento flash, rendendo amostras suspensas em uma camada de gelo vítreo. Essas amostras podem ser examinadas com um microscópio crio-eletrônico para visualizar estruturas em escala nanométrica.

Preparação de primário neurônios para visualizar Neuritos num Estado Frozen-hidratado Usando Cryo-Electron Tomografia

Nós apresentamos um protocolo de como coletar e eletrônica processo de crio-tomograms de toda mitocôndrias. A técnica fornece informações detalhadas sobre a estrutura, função e organização de grandes complexos de proteínas de membrana em membranas biológicas nativas.

Visualização da ATP sintase Dimers na mitocôndria por Electron Cryo-tomografia

Nós apresentamos um protocolo sobre como utilizar de alto rendimento tomografia crio-eletrônica para determinar alta resolução em estruturas in situ de máquinas moleculares. O protocolo permite que grandes quantidades de dados a serem processados, evita gargalos comuns e reduz o tempo de inatividade de recursos, permitindo que o usuário se concentrar em questões biológicas importantes.

Usando Tomoauto: Um Protocolo de métodos de alta capacidade automatizada Cryo-Electron Tomografia

Este protocolo descreve como visualizar a transiente compactação do DNA em cianobactérias. Cultivo síncrono, monitoramento por microscopia de fluorescência, congelação rápida e alta tomography do cryo-elétron de tensão são usados. É apresentado um protocolo para essas metodologias e desenvolvimentos e aplicações futuras são discutidos.

Visualização de compactação do DNA em cianobactérias por tomografia computadorizada de alta tensão Cryo-elétron

A imagem de células bacterianas é uma abordagem de biologia de sistemas emergentes focada na definição de processos estáticos e dinâmicos que ditam a função de grandes máquinas macromoleculares. Aqui, a integração da imagem quantitativa de células vivas e tomografia crio-elétron é usada para estudar a arquitetura e funções do sistema de secreção legionella tipo IV.

Aplicando imagens de células vivas e tomografia crio-elétron para resolver características espaciales do Sistema de Secreção Legionella pneumophila Dot/ICM

Apresentamos um protocolo para a preparação de lamella de espécimes biológicos congelados por micromaquingia de feixe de íons focado em crio-pia para estudos estruturais de alta resolução de macromoléculas in situ com tomografia crio-elétron. O protocolo apresentado fornece diretrizes para a preparação de lamellae de alta qualidade com alta reprodutibilidade para caracterização estrutural de macromoléculas dentro do Saccharomyces cerevisiae.

Preparação e micromaquinção Crio-FIB de Saccharomyces cerevisiae para Tomografia Crio-Elétron

O objetivo deste protocolo é direcionar a adesão celular e o crescimento para áreas direcionadas de redes para microscopia crio-elétron. Isso é conseguido aplicando uma camada anti-incrustada que é ablada em padrões especificados pelo usuário seguido pela deposição de proteínas de matriz extracelular nas áreas padronizadas antes da semeadura celular.

Micropatterning Transmissão Electron Microscopy Grids para Posicionamento Direto celular dentro de fluxos de trabalho de tomografia crio-elétron inteira

O presente protocolo descreve a aquisição remota de dados remotos crio-elétrons de alta resolução usando Tomo5 e processamento de dados subsequente e média de subtomogramas usando a emClarity. A apoferritina é usada como exemplo para ilustrar processos passo a passo detalhados para alcançar uma estrutura crio-ET com resolução de 2,86 Å.

Coleta remota de dados de tomografia crio-elétron e média de subtomograma

A tomografia crio-STEM fornece um meio de visualizar organelas de células intactas sem incorporação, seccionamento ou outras preparações invasivas. A resolução 3D obtida está atualmente na faixa de poucos nanômetros, com um campo de visão de vários micrômetros e uma espessura acessível na ordem de 1 μm.

Visualização de Organelas In Situ por Tomografia Crio-STEM

Esse protocolo padroniza a criotomografia eletrônica (crio-ET) para tecidos espessos, integrando congelamento de alta pressão (HPF) com o método waffle, levantamento por feixe de íons de foco criogênico (crio-FIB) e aquisição paralela e dose-simétrica, resultando em lamelas uniformemente finas e amostras vitrificadas para análise in situ reprodutível no hipocampo do camundongo.

Fluxo de trabalho de criotomografia eletrônica para tecidos espessos demonstrado em hipocampo de camundongos

Aprenda crio-tomografia eletrônica para visualizar a ultraestrutura de células bacterianas em estado nativo com resolução macromolecular. Este método utiliza congelamento por imersão e alta pressão.

Electron Cryotomography de células bacterianas

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