Electron Cryotomography de células bacterianas

Neste vídeo, imagens 3D de células bacterianas em estados quase nativos em resolução molecular são geradas por criotomografia eletrônica. Isso é feito primeiro congelando células intactas ou, alternativamente, congelando e criosseccionando os pellets de células. Uma série de imagens de projeção M são adquiridas e usadas para gerar uma reconstrução 3D, ou Tom Graham, que é segmentada e posteriormente analisada computacionalmente.

Olá, sou Grant Jensen, da Divisão de Biologia da Caltech, e esta é Sonya Chen, que organizou nossa apresentação. Hoje vamos mostrar como fazer criotomografia eletrônica de células bacterianas. Normalmente, um único indivíduo faria todo o procedimento, mas como nossos protocolos foram desenvolvidos por meio de experiências compartilhadas, incluiremos todos que estão trabalhando atualmente no laboratório.

Além de Sonya e eu no vídeo, você verá Megan Dobro, Ariana, Bri, Miguel, Alistair McDowell, Mark Rodinsky e Jen. Ela outros membros do laboratório produziram as capturas de tela do computador e ajudaram a preparar o protocolo escrito que o acompanhava, incluindo Morgan Bebe, Martin Piller, Jane Ding, Joe Lee, Lou GaN, Aliza Tova e Dylan Morris. Ariana nos começará mostrando como mergulhamos nas células bacterianas.

Para células bacterianas finas, uma suspensão de células intactas é congelada em uma grade EM. Aqui, o processo é demonstrado usando um freezer de imersão automático comercial, comece examinando as culturas bacterianas para garantir que estejam livres de contaminantes e, em uma confluência ou concentração apropriada, descarregue a grade EM revestida de carbono por dois a quatro minutos. Em seguida, misture 100 microlitros de solução de ouro coloidal com 25 microlitros de uma solução de 5% BSA.

Centrifugar a mistura a 18 000 g durante 15 minutos. Após a centrifugação, remova o sobrenadante e ressuspenda a pelota de ouro. Em 20 microlitros de solução celular, coloque a grade EM no bot Vitra a 100% de umidade.

Em seguida, aplique quatro microlitros da mistura de células na grade EM descarregada por brilho. A grade é automaticamente enxugada de ambos os lados com papel de filtro para remover o excesso de líquido e, em seguida, mergulhada rapidamente em uma mistura líquida de etano e propano, que é resfriada por nitrogênio líquido. Remova cuidadosamente a grade da mistura de etano propano e transfira-a rapidamente para uma caixa de armazenamento de grade mantida sob nitrogênio líquido Para células mais espessas, o congelamento em alta pressão evita a cristalização do gelo.

A crioseccionação subsequente renderiza amostras finas o suficiente para em. A imagem começa centrifugando 15 mililitros de células a 1000 RPM por três minutos. Após a centrifugação, remova a mistura sobrenadante 0,5 mililitros do pellet de cultura restante com 0,5 mililitros de crioprotetor de 20% de dextrina.

Em seguida, centrifugue novamente a 13.000 rpm por 15 segundos. Depois que as células forem peletizadas, remova a pipeta sobrenadante 0,1 mililitro da pasta de super pellet em uma ponta de micropipeta selada a quente, que já contém 0,2 mililitros de centrífuga crioprotetora de 20% de dextrina. A mistura na micropipeta é a 13 000 RBM durante 30 segundos.

Após a centrifugação, remova o sobrenadante. Um pellet apertado de cinco a 10 microlitros é visto na ponta selada. Transfira a pasta para meia cúpula de uma prancheta abobadada de latão revestida de Teflon já montada no braço do suporte do freezer de alta pressão e, em seguida, sele com seu chapéu de latão de parceiro plano.

Em seguida, insira imediatamente o conjunto do braço no freezer de alta pressão preparado. A 2100 bar de pressão, a unidade de planche de latão combinada contendo as células é rapidamente resfriada por um jato de nitrogênio líquido de alta pressão. Depois que as células forem resfriadas, remova rapidamente o conjunto do braço e mergulhe-o rapidamente em um banho de nitrogênio líquido para evitar que a prancheta aqueça.

Em seguida, transfira a prancheta para um mandril semelhante a um micrótomo criogênico pré-resfriado montado com segurança na câmara do micrótomo criogênico para expor a cúpula de células bem congelada para seccionamento. As duas pranchas de latão são cuidadosamente separadas sob nitrogênio líquido. Uma cúpula de células perfeitamente congelada terá aparência vítrea e livre de rachaduras e fissuras de nucleação de gelo.

Usando o micrótomo criogênico, a região externa da cúpula é inferior a 0,2 milímetros quadrados, usando a ferramenta de corte de diamante com uma rápida retenção de velocidade de seccionamento e cerca de 200 micrômetros de profundidade com spray antiestático direcionado à faca de baixo ângulo e grades de suporte de cobre. Nas proximidades, avance cuidadosamente a faca diamantada para a face do bloco polido usando uma velocidade de corte de cerca de 0,4 milímetros por segundo e uma janela de corte estreita. Comece a seccionar fatias de 50 a 350 nanômetros de espessura.

Manobre um aplicador de cílios fino para prender as seções iniciais, deslizando para fora do fio da faca de diamantes de baixo ângulo e para apoiar e guiar as fitas das seções através do suporte da grade de cobre. Depois que a grade estiver carregada, use uma sonda de prata polida resfriada para pressionar firmemente as fitas. Armazene as grades nas caixas de grade em um transportador seco resfriado a nitrogênio líquido até que o microscópio esteja pronto.

As células bacterianas na grade podem ser visualizadas usando um microscópio de luz criogênica. Aqui, será usado um microscópio invertido personalizado da Nikon, TIB com estágio criogênico FEI modificado. Carregue as grades em cartuchos na estação criogênica e prenda-os usando os anéis de clipe de cobre e, em seguida, coloque o cartucho em um tubo de nitrogênio líquido para transferência.

Carregue até dois cartuchos no estágio criogênico pré-resfriado e mova a grade para a janela de visualização. Em seguida, abaixe a lente condensadora e foque a lente objetiva na grade. Encontre as células e tire fotos.

Para estudo LM e EM correlacionado. A grade é escaneada ao redor da área das células para localizar as células posteriormente em em. Depois de obter a imagem da grade, coloque o cartucho de volta no tubo e mantenha o tubo no nitrogênio líquido até que esteja pronto para ser visualizado em EM para obter um TOM 3D da célula bacteriana.

Uma série de imagens de projeção são tiradas enquanto a amostra é inclinada incrementalmente ao longo de um ou dois Es no crio TEM aqui, o procedimento é demonstrado usando legon com uma carga polar criogênica T-E-M-F-E-I-T-F 30 até seis cartuchos em um suporte de seleção múltipla na estação criogênica. Em seguida, conecte-o ao cartucho TF 30 Polar Select one e insira-o na coluna EM. Inicie a legenda no software cliente no computador EM.

Insira as condições da imagem para a legenda na sessão. Selecione alvos em imagens a partir da ampliação mais baixa e envie-os para a próxima etapa com ampliação mais alta. Em seguida, enfileire todos os alvos para coleta de séries de inclinação e envie todos eles para a etapa final de tomografia.

Adquira uma série de imagens. A amostra será inclinada incrementalmente ao longo de um ou dois eixos no crio TEM. Após a conclusão do experimento, baixe a série de inclinação concluída em uma estação de trabalho local para reconstrução.

Tomo Grahams das células bacterianas são calculados usando software especializado. O programa Raptor é usado para reconstruir Toms automaticamente e e tomo pode ser usado para fazê-lo semi automaticamente. Inspecione a série de inclinação usando o visualizador de mods 3D do Im MOD e descarte qualquer um que, devido ao rastreamento ou outros erros, provavelmente não produzirá.

Um bom tommo raptor é executado distribuído pelas máquinas Linux no laboratório usando as configurações básicas. Leva de 20 minutos a duas horas, dependendo do tamanho do arquivo, para gerar o tomógrafo. Quando o Raptor falha ou um investigador deseja garantir que a reconstrução seja ideal, o EMO pode ser usado para alinhar as imagens cuidadosamente à mão.

Siga as etapas de cada guia na GUI do e tomo para reconstruir o Tom Graham da série Tilt. Usamos um banco de dados interno baseado na web para organizar a pesquisa da loja e distribuir os dados tomográficos. A página de navegação principal apresenta uma imagem em miniatura e um filme semelhante ao YouTube em destaque.

Para cada tomo Graham. Depois que os Tommo, Grahams são obtidos, as características individuais podem ser segmentadas para ajudar a visualizar suas formas. Na segmentação 3D é o processo de atribuir cada elemento da imagem 3D a uma determinada região ou material.

Aqui, um software de espelho é usado para gerar um modelo de superfície no qual cada região é mostrada com uma cor diferente e visualizada em filmes 3D e animações do tomo. Grahams pode ser feito para resumir projetos e ilustrar descobertas em gráficos 3D. Representação. Softwares como Amira ou Kymera podem ser usados para renderizar os quadros estáticos individuais do filme e do comercial.

O software de edição de filmes, como o Adobe Premier, pode ser usado para editar o software comercial de filmes. Maya é usado para gerar a animação. Ele pode pegar as superfícies de Amira, construir quadros-chave e renderizar em um filme.

Aqui, uma série representativa de dados de células inteiras é mostrada para o Spiro Treponema Promesa, seguida por uma visão fatia por fatia do Tom Agram reconstruído. A segmentação da célula T Promesa distingue sua membrana externa, membrana interna e estruturas de superfície, incluindo tigelas de superfície e arcada de gancho de superfície. A bactéria é flagelos e motor ular, cone periplasmático e pillai.

Este modelo mecânico mostra como a espiroqueta treponema Promesa nada e o cilindro interno ou núcleo é fechado por uma bainha externa. Os flagelos se movem como rolos de pintura entre o cilindro interno e a bainha externa. À medida que os flagelos giram, o contador do cilindro interno gira dentro da bainha externa.

Em um ambiente não viscoso, a célula gira inutilmente, mas em ambientes viscosos como aqueles em que o T Promesa é encontrado na natureza, fibras externas ou outros objetos resistem à rotação da bainha externa, acelerando a rotação do cilindro interno e fornecendo materiais que a célula pode empurrar enquanto se perfura para frente. Aqui são mostradas células T promeus reais, observadas através de um microscópio óptico. Acabamos de mostrar como fazer criotomografia eletrônica de células bacterianas.

Claro, percebemos que esse tipo de trabalho requer grandes investimentos. Os microscópios crioeletrônicos e os microscópios de fluorescência são sofisticados e caros, e também devem ser devidamente citados. Por exemplo, a fundação desta sala é uma laje de concreto mecanicamente isolada, com vários metros de espessura, apoiada em solo especialmente compactado.

O sistema de ar condicionado também é projetado sob medida com grandes dutos e curvas suaves para manter uma temperatura constante sem correntes de ar ou turbulência. As cortinas que você vê são colocadas para reduzir o ruído acústico. E, finalmente, verificamos que esta sala está livre de campos eletromagnéticos interferentes.

Embora as operações que mostramos no microscópio sejam agora amplamente automatizadas, os problemas ainda surgem com frequência e exigem diagnóstico especializado. No entanto, esperamos que assistir a este filme tenha ajudado você a apreciar os procedimentos e a instrumentação envolvidos nesse tipo de trabalho. Obrigado pela vossa atenção.