Visualização e Quantificação de Interações intracelulares de Neisseria meningitidis Humanos e α-actinina por Imagem Confocal

O objetivo geral do experimento a seguir é avaliar o nível de colocalização de bactérias internalizadas, RIA Meningitidis com a proteína do citoesqueleto Alfa Actinina. Isso é conseguido infectando células microvasculares cerebrais humanas cultivadas com uma cultura noturna de bactérias por três a oito horas para permitir que as bactérias entrem nas células-alvo. Como segunda etapa, as células com bactérias intracelulares são lavadas, fixadas e depois permeadas, o que prepara a cultura infectada para a imunocoloração de bactérias internalizadas e alfa actinina intracelular.

Após a imagem confocal e a aplicação do software de colocalização, imagens da colocalização intracelular podem ser observadas e resultados quantificados são obtidos que mostram que Meninga Croci expressando OPC e também a proteína de membrana pode interagir especificamente com a alfa actinina intracelular com base na visualização microscópica confocal e por análise quantitativa de colocalização. Olá, sou Isel Maria, do Laboratório Mata TI do Departamento de Medicina Molecular Celular da Universidade de Bri. Hoje mostraremos um procedimento para estimar o nível de col, proporção de bactérias intracelulares com proteínas do citoesqueleto.

Usamos este procedimento em nosso laboratório para estudar uma interação da meningite por micélio expressando uma proteína OPC de automembrana com a proteína alfa actina do citoesqueleto. Então, vamos começar. Este trabalho precisa ser feito em um laboratório de segurança adequado.

Dois dias antes do procedimento de imunocoloração, inocule a coloração bacteriana de interesse na infusão cérebro-coração. As placas de ágar suplementadas com sangue de cavalo aquecido a 10% crescem durante a noite a 37 graus Celsius em uma atmosfera de 5% de dióxido de carbono no dia anterior à imunocoloração. Use um laço de cultura de 10 microlitros para fazer uma suspensão da cultura bacteriana durante a noite.

Em dois mililitros de PBSB, deixe a suspensão repousar por cinco minutos em temperatura ambiente para permitir que grandes agregados bacterianos se assentem. Em seguida, transfira o mililitro superior da suspensão para um tubo estéril sem perturbar as bactérias solubilizadoras do pellet adicionando um mililitro de hidróxido de sódio molar 1% SDS 0,1 a dois frascos contendo 20 microlitros de suspensão bacteriana e inverta o tubo para misturar. Para estimar o número de bactérias.

Medir o teor de ácidos nucleicos determinando a absorvância da solução. Aos 216 antros, ajusta a suspensão bacteriana à densidade necessária no meio de infecção para infectar as células endoteliais microvasculares do cérebro humano. As células endoteliais microvasculares do cérebro humano ou H-B-M-E-C-A semeadas dois dias antes da coloração imunológica colocaram lamínulas de vidro de 16 milímetros nos poços de uma placa de 12 poços e semearam mares HBME a 50% Confluência nas lamínulas incubam durante a noite a 37 graus Celsius em 5% de atmosfera de dióxido de carbono no dia seguinte.

Infecte as células com a suspensão bacteriana recém-preparada em nosso laboratório. Uma taxa de infecção de 200 a 300 unidades formadoras de colônias por célula-alvo é usada rotineiramente. Incube por três a oito horas a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono no final do período de infecção.

Lave as células três vezes com PBS e fixe 500 microlitros de formaldeído a 2% por 30 a 45 minutos em temperatura ambiente Depois de lavar o formaldeído para, permee as células fixadas com paraldeído incubando em 0,1% Triton X 100 diluído em PBS por 10 minutos. Por fim, lave as amostras três vezes com PBS e proceda à coloração imunológica conforme mostrado. Em seguida, a coloração de bactérias intracelulares e dfor actinina pode ser realizada simultaneamente.

Em placas de 12 poços bloqueiam as lamínulas contendo as células permeáveis com 500 microlitros de 3%B-S-A-P-B-S-T por 30 a 60 minutos. À temperatura ambiente após a lavagem com transferência de PBS, cada lamínula para um novo poço seco na placa de 12 poços nos anticorpos primários contra bactérias e alfa actinina simultaneamente 80 a 100 microlitros de anticorpos por lamínula é suficiente se adicionado com cuidado para cobrir a superfície da lamínula, incubar por uma hora à temperatura ambiente No final da incubação, adicione 200 microlitros de PBS ao, levante a lamínula e coloque-a em um novo poço contendo 500 microlitros de PBS Após cinco minutos, remova o PBS pipetando e, em seguida, adicione PBS fresco. Repita duas vezes e transfira as lamínulas para um novo poço seco.

Em seguida, adicione os anticorpos secundários apropriados conjugados a diferentes fluorocromos diluídos em 1%B-S-A-P-B-S-T Incube a temperatura ambiente por uma hora no escuro no final da incubação, a lavagem é mostrada anteriormente e, em seguida, contracore o DNA com DPI por cinco minutos em temperatura ambiente no escuro no final desta incubação, lave as lamínulas em PBS uma vez e, em seguida, monte com uma gota de montagem. As lamínulas montadas em média devem ser armazenadas no escuro até que estejam prontas para observação. Sob o microscópio, observamos e capturamos imagens de nossas amostras imunomarcadas usando um microscópio confocal de varredura a laser conectado a um microscópio de epifluorescência invertido.

Para iniciar o procedimento CLSM com uma gota de imersão na objetiva e colocar a tampa da lâmina da amostra, deslizar para baixo na platina do microscópio, definir o microscópio para um modo visual e encontrar a área de interesse usando as oculares do microscópio, agora estamos prontos para usar o software Leica. Selecione o modo de aquisição XY zed. Selecione o formato cinco 12 por cinco 12 para estudos de colocalização.

Quanto maior a resolução, mais precisa é a imagem. Em seguida, selecione o modo X bidirecional, que aumentará a velocidade de digitalização e ajudará a reduzir o branqueamento de fotos. Defina as configurações de varredura sequencial.

Clique na função SEC e selecione entre as linhas. Selecione feixes de laser de acordo com os fluorocromos conjugados aos anticorpos secundários. 4 0 5 nanômetros para DPI 4 88 nanômetros Para Alexa, Fluor 4 88 e 5 61 nanômetros.

Para trixy, ative o tubo fotomultiplicador um, dois e três, respectivamente. Configure a parte superior e inferior da pilha ou série Z. Em seguida, defina o tamanho do passo Zed para 0,2 micrômetros.

RIA Mencius é um diplo occus e, como cada caucus tem um diâmetro aproximado de 0,5 micrômetros, um tamanho de passo Z de 0,2 micrômetros aumenta a probabilidade de escanear cada caucus pelo menos duas vezes. Defina os parâmetros finais de varredura selecionando a média da linha de três para melhorar a relação sinal-ruído clicando em iniciar. Imagens coradas duplas ou triplas são obtidas por varredura sequencial em diferentes comprimentos de onda e usando o modo entre linhas para cada canal para eliminar a diafonia entre os diferentes cromóforos.

Para uma indicação de colocalização de dois fluorocromos, selecione a função de sobreposição para mesclar os canais selecionados em uma única imagem. Por exemplo, quando Alexa 4 88 e trissy Fluor Chromes colocalizam a cor amarela aparecerá na imagem sobreposta para Uma reconstrução 2D necessária para visualizar uma possível colocalização compila a pilha ou série Zed usando a função de projeção máxima. Após adquirir a pilha ou série Z, processe seus dados para obter uma imagem ortogonal para visualização da localização intracelular de vários elementos.

A quantificação da colocalização é realizada usando o software Vol City da provisão IMP. Para começar a criar uma biblioteca com imagens CLSM, selecione o foco estendido na imagem na barra superior. Esta ferramenta combinará Zacks em uma imagem 2D a ser analisada.

Agora selecione a ferramenta COLOCALIZAÇÃO. Os dois canais a serem analisados devem ter a mesma profundidade de cor. Selecione a área que será quantificada.

Defina o limite para remover qualquer plano de fundo. Crie a saída de colocalização selecionando gerar colocalização. As estatísticas de colocalização serão geradas para as regiões de interesse selecionadas anteriormente.

Em seguida, selecione os coeficientes de mander R e ny. Finalmente, exporte ou estatistice os valores para um documento do Excel para apresentação de dados mostrados aqui resultados de imagem confocal representativa de células endoteliais do cérebro humano infectadas com meninga cockeye por oito horas. A localização das bactérias é mostrada em vermelho.

Embora a localização da alfa-actinina seja mostrada em verdes, as setas indicam regiões onde um alto grau de acúmulo de alfa-actinina parece ter ocorrido ao redor das bactérias. Nesta imagem de sobreposição, existem várias regiões nas quais a cor laranja amarela aparece, sugerindo colocalização entre meninga occi e alfa actinina. Nesta próxima imagem, a dissecção óptica de uma monocamada H-B-M-E-C infectada indica colocalização em torno de bactérias intracelulares localizadas na base de uma célula.

Quando imagens tridimensionais de monocamadas H-B-M-E-C infectadas foram processadas, uma visão oblíqua da superfície apical mostra uma bactéria Durant corada de vermelho indicada pela seta vermelha onde várias bactérias localizadas em direção às superfícies basais das células endoteliais indicadas pela seta amarela. Uma localização basal distintamente alaranjada e amarela pode ser vista mais claramente nesta seção transversal do endon XZ. Em contraste com o distante, experimentos com actinina nos quais a marcação de bactérias internalizadas e menton ou actina foi realizada revelam colocalização ocasional com actina, mas rara colocalização com fermentação em células HBME.

Como observado nos experimentos anteriores, Retin estava concentrado em torno de várias bactérias internalizadas indicadas pelas setas brancas. Os dados também foram analisados para obter sobreposição relativa. O coeficiente R, que de acordo com Manda, representa o verdadeiro grau de colocalização IE, o número de pixels que colocalizam em comparação com o número total de pixels e valores de NY para alfa actinina, menting e actina geral em H-B-M-E-C infectados com OPC expressando meningococos, foi obtido maior que 25% de sobreposição de rédea em um meningococo.

O coeficiente e Y é uma medida da frequência de uma moeda do sinal de rédea mais abundante cada vez que ocorre o sinal de cacau de meninga menos abundante. Esta medida mostra um nível impressionante de ocorrência de alfa actinina nas proximidades da meninga internalizada. Nós apenas mostramos como visualizar e quantificar a introdução de bactérias internalizadas com elementos citoesqueletos dentro deste experimento.

É importante lembrar de seguir estritamente os protocolos de fixação e tronco imunológico para manter a integridade das estruturas e evitar um fundo alto. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.