Visualizando Único complexos moleculares In Vivo Usando microscopia de fluorescência avançada

Aqui demonstramos o protocolo para realizar microscopia de fluorescência de molécula única em células bacterianas vivas, permitindo a detecção, rastreamento e quantificação de complexos moleculares funcionais. Este protocolo começa com o cultivo de bactérias que produzem uma proteína marcada com uma molécula fluorescente. Após quatro a seis horas, um pequeno volume de células é extraído do cultivo e os filamentos de seus flagelos são truncados por cisalhamento.

Um lamínula de vidro no interior de uma célula de fluxo é revestida para permitir que as células adiram à superfície. As células são injetadas na célula de fluxo e fixadas por meio de um suporte de gelatina, que é observado em fluorescência utilizando microscopia de excitação a laser. Uma câmera de alta eficiência quântica então registra as imagens claras de campo claro e de fluorescência dos complexos moleculares marcados.

Olá, meu nome é Ian Doy e estou trabalhando com Mark Lee no Departamento de Bioquímica da Universidade de Oxford. Sou Alex Robertson, trabalhando com Mark Lee no departamento de física. Sou Nick De do laboratório de vazamento, também localizado no departamento de física.

Hoje vamos mostrar o procedimento para visualizar complexos moleculares individuais em bactérias vivas utilizando microscopia de fluorescência avançada. Utilizamos este procedimento para estudar isso em um estado funcional. Também estamos utilizando para investigar a dinâmica em tempo real de máquinas biológicas naturais e em escala nanométrica.

Então vamos começar. Para iniciar, descongele 50 microlitros de talos congelados de bactérias de e coli. Estes foram modificados geneticamente.

Para marcar uma proteína com uma molécula de corante fluorescente, inocular cinco mililitros de meio de crescimento LB e cultivar as bactérias sob agitação aeróbica durante a noite a 37 graus Celsius. Na manhã seguinte, coletar 50 microlitros da cultura saturada e repicar em meio mínimo M 63 com glicose, incubando a 30 graus Celsius por quatro a seis horas. Aqui, duas linhagens celulares diferentes são utilizadas.

Uma delas expressa um citocromo transportador de elétrons fundido à GFP. A outra expressa uma proteína envolvida no motor do flagelo bacteriano. Células fundidas à GFP podem ser colhidas diretamente do subcultivo em crescimento, caso sejam visualizadas como amostras imobilizadas, ou podem ser submetidas à cisalhamento para truncar os flagelos bacterianos, caso sejam observadas sob condições ligadas.

Para fragmentar as bactérias, coloque de um a cinco mililitros da subcultura em um dispositivo composto por duas seringas estéreis por meio de tubulação estéril. Alterne o empurrar em cada seringa para forçar a cultura através do tubo estreito cerca de 50 a 100 vezes, dependendo do grau de fragmentação desejado. Em seguida, centrifugue a cultura para obter um pellet celular e, então, ressuspenda as células em meio mínimo para remover fragmentos de flagelos. Assim que as células estiverem prontas, prepare lamínulas de vidro BK sete limpas imergindo-as em uma solução saturada de hidróxido de potássio e etanol por 20 minutos.

Enxágue abundantemente com água desionizada e etanol e deixe secar ao ar por pelo menos uma hora. Em seguida, monte uma célula de fluxo simples para acomodar as células no microscópio. Para isso, desenhe linhas de graxa de parafina em uma lâmina de microscopia de vidro BK sete e, então, crie um sanduíche em túnel colocando uma das lamínulas limpas por cima.

Pressione suavemente com um par de pinças. Isso deve resultar em um volume de célula de fluxo entre cinco e dez microlitros. Para observar células imobilizadas, preencha a célula de fluxo injetando uma solução de 0,1% de poli-L-lisina e deixe incubando à temperatura ambiente por pelo menos um minuto.

Em seguida, lave a câmara de fluxo injetando 100 microlitros de meio mínimo de uma extremidade da câmara de fluxo e, simultaneamente, removendo o meio através da câmara de fluxo com papel absorvente a partir da outra extremidade. Depois disso, adicione 20 microlitros de uma diluição de 1 para 500 de microesferas de látex com diâmetro de 200 nanômetros em meio mínimo para marcar a superfície da lamínula. Coloque a câmara de fluxo em uma câmara de umidade simples e incube à temperatura ambiente por cinco minutos. A câmara de fluxo é invertida de modo que a lamínula fique voltada para baixo.

As microesferas não ligadas são então removidas por meio da capilaridade com 100 microlitros de meio mínimo utilizando papel-toalha. Para observar células presas, omita o passo de incubação com poli-L-lisina, preencha a câmara de fluxo com solução de anticorpo Anti-Flag gellan a cinco microgramas por mililitro e, em seguida, coloque-a em uma câmara úmida por 10 minutos. Após a incubação, lave a câmara de fluxo por capilaridade com papel-toalha.

Em seguida, retire 20 microlitros da cultura celular através da câmara de fluxo com papel absorvente, utilizando a amostra cisalhada para observar células ligadas ou a amostra não cisalhada para visualizar células imobilizadas; a câmara de fluxo é invertida e colocada na câmara de umidade por 20 minutos. As células não ligadas são então removidas por capilaridade com 100 microlitros de meio mínimo. Coloque uma gota de óleo de imersão no centro da superfície superior do lamínula.

Coloque cuidadosamente a câmara de fluxo sobre o porta-amostras do microscópio de fluorescência construído sob medida. Isso deve estabelecer contato óptico com a lente objetiva de alta abertura numérica. Em seguida, ligue a câmera multiplicadora de elétrons do microscópio e configure a câmera para ser resfriada a menos 70 graus Celsius.

O software é configurado para adquirir imagens a uma taxa de quadros típica de 25 hertz. No modo de transferência de quadro. Ligue a iluminação de campo claro e coloque a imagem em foco.

Selecione uma célula ou grupo de células apropriado para ser imagem com base na posição aderida com seu eixo longo paralelo à superfície do lamínula. Ajuste o foco para garantir que as microesferas de látex de 200 nanômetros aderidas à superfície do lamínula estejam levemente nítidas. Adquira uma sequência de imagens em campo claro para registrar o contorno do corpo celular.

A iluminação em campo claro é então desligada e o ganho da câmera é ajustado ao máximo para a aquisição de imagens por fluorescência de reflexão interna total, também conhecida como turf. Inicie a aquisição da câmera e abra o obturador do laser para excitar as proteínas fluorescentes dentro das bactérias. Os parâmetros de intensidade do laser e velocidade de aquisição precisam ser otimizados para o sistema biológico específico.

As amostras em estudo são iluminadas até o branqueamento fotográfico, o que normalmente leva cerca de 10 segundos. Após a coleta dos dados, as imagens são inseridas em um programa de análise desenvolvido especialmente, que detecta automaticamente as posições dos pontos fluorescentes nas células com uma precisão de alguns nanômetros e extrai seu tamanho e brilho. O brilho do traçado de branqueamento fotográfico em relação ao tempo do complexo molecular atrativo é então usado para estimar a estequiometria utilizada.

Usando este método, a imagem das células visualizadas em campo claro é muito distinta, de modo que os contornos dos corpos celulares aparecem escuros contra um corpo celular acinzentado claro, utilizando fluorescência com células imobilizadas. Pontos distintos de intensidade, com largura tipicamente entre 250 e 300 nanômetros, podem ser observados aqui em cores falsas. Células saudáveis presas por tethers podem ser vistas girando ao redor do ponto de fixação do tether em imagens de campo claro sob excitação fluorescente.

Alguns complexos moleculares também podem ser observados no ponto de fixação, indicando uma localização da proteína marcada com o motor de Geller. Essas manchas são complexos moleculares individuais. O número desses complexos observados dependerá do modo de iluminação utilizado e de quantos dos complexos estão realmente presentes na célula em um determinado momento.

Se a densidade de pontos for inicialmente muito alta, como é o caso dos citocromos marcados utilizados aqui, então a realização de um branqueamento FRAP inicial pode melhorar o contraste da imagem. A mobilidade dos pontos depende do sistema biológico específico em estudo. Acabamos de mostrar como visualizar complexos moleculares individuais utilizando microscopia de fluorescência avançada.

Ao realizar este procedimento, é importante não submeter as células a forças de cisalhamento, pois isso pode comprometer a funcionalidade do motor flagelar. Também é importante não deixar as células em lâminas de microscópio por mais de uma hora, pois elas podem ficar deficientes em oxigênio. A automatização é necessária para encontrar as melhores condições de imagem.

Pode ser útil usar GFP purificada isoladamente para determinar a potência correta do laser para o seu sistema microscópico específico. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.