Visualizando Único complexos moleculares In Vivo Usando microscopia de fluorescência avançada

Aqui demonstramos o protocolo para realizar microscopia de fluorescência de molécula única em células bacterianas vivas para permitir que complexos moleculares funcionais sejam detectados, rastreados e quantificados. Este protocolo começa com o crescimento de bactérias, que produzem uma proteína marcada em uma molécula de corante fluorescente. Após quatro a seis horas, um pequeno volume de células é extraído da cultura e seus filamentos de flagelos truncados por cisalhamento.

Uma lamínula de vidro dentro de uma célula de fluxo é revestida para permitir que as células grudem na superfície. As células são injetadas na célula de fluxo e amarradas por meio de um toco gelar, que é visualizado em fluorescência usando microscopia de excitação a laser. Uma câmera de alta eficiência quântica registra as imagens de campo claro e fluorescência dos complexos moleculares marcados.

Olá, meu nome é Ian Doy e estou trabalhando com Mark Lee no Departamento de Bioquímica da Universidade de Oxford. Eu sou Alex Robertson trabalhando com Mark Lee no departamento de física. Eu sou Nick De, do laboratório de vazamentos, também baseado no departamento de física.

Hoje mostraremos o procedimento para visualizar complexos moleculares únicos em bactérias vivas usando microscopia de fluorescência avançada. Usamos este procedimento para estudar o isso em um estado funcional. Também estamos usando para investigar a dinâmica em tempo real da máquina biológica natural e da escala de lentes nanométricas.

Então vamos começar. Para começar, descongele 50 microlitros de talos congelados da bactéria E coli. Estes foram modificados geneticamente.

Para marcar uma proteína com uma molécula de corante fluorescente, inocule cinco mililitros de meio de crescimento LB e cultive a bactéria tremendo aeróbica durante a noite a 37 graus Celsius. Na manhã seguinte, pegue 50 microlitros da cultura saturada e subcultive-a em meios de cultura de glicose M 63 no mínimo incube a 30 graus Celsius por quatro a seis horas. Aqui, duas cepas celulares diferentes são usadas.

Um expressa um citocromo transportador de elétrons fundido à GFP. O outro expressa uma proteína envolvida no motor dos flagelos bacterianos. Fundidas às células GFP podem ser colhidas diretamente da subcultura em crescimento se forem vistas como amostras imobilizadas, ou podem ser cortadas para truncar flagelos bacterianos se forem vistas em condições amarradas.

Para cortar as bactérias, coloque de um a cinco mililitros da subcultura em um dispositivo que consiste em duas seringas estéreis por tubulação estéril. Empurre alternadamente cada bomba de seringa para forçar a cultura através do tubo estreito cerca de 50 a 100 vezes, dependendo da extensão do cisalhamento adquirido Em seguida, centrifugue a cultura para pellet as células e, em seguida, ressuspenda as células em meio mínimo para remover fragmentos de flagelos. Quando as células estiverem prontas, prepare as lamínulas de vidro BK limpas, imergindo-as em uma solução saturada de hidróxido de potássio e etanol por 20 minutos.

Enxágüe abundantemente em água deionizada e etanol e deixe secar ao ar por pelo menos uma hora. Em seguida, construa uma célula de fluxo simples para abrigar as células no microscópio. Para fazer isso, desenhe linhas de graxa de parafina em uma lâmina de microscópio de sete vidros BK e, em seguida, crie um sanduíche de túnel colocando uma das lamínulas limpas por cima.

Pressione suavemente com uma pinça. Isso deve dar um volume de célula de fluxo de cinco a 10 microlitros. Para observar as células imobilizadas, encha a célula de fluxo injetando uma solução de poli L lisina a 0,1% e deixe-a incubar à temperatura ambiente por pelo menos um minuto.

Em seguida, lave a célula de fluxo injetando 100 microlitros de mídia mínima de uma extremidade da célula de fluxo e, simultaneamente, absorvendo a mídia através da célula de fluxo com papel de seda da outra depois, o WIC jogou 20 microlitros de uma diluição em 500 de microesferas de látex de 200 nanômetros de diâmetro em mídia mínima para marcar a superfície da lamínula. Colocar a célula de fluxo numa câmara de humidade simples e incubar à temperatura ambiente durante cinco minutos. A célula de fluxo é invertida de modo que a lamínula fique voltada para baixo.

As contas não encadernadas são então lavadas absorvendo 100 microlitros de mídia mínima com papel de seda. Para observar as células amarradas, pule a etapa de incubação de poli L lisina, encha a célula de fluxo com cinco microgramas por mililitro de solução de anticorpo gelana Anti-Flag e coloque-a em uma câmara de umidade por 10 minutos. Após a incubação, lave a célula de fluxo absorvendo com papel de seda.

Em seguida, WIC 20 microlitros da cultura de células através da célula de fluxo com papel de seda, usando a amostra cisalhada para observar as células amarradas ou a amostra não compartilhada para visualizar as células imobilizadas, a célula de fluxo é invertida e colocada na câmara de umidade por 20 minutos. As células não ligadas são então lavadas por absorção de 100 microlitros de meio mínimo. Coloque uma gota de óleo de imersão no centro da superfície superior da lamínula.

Coloque a célula de fluxo suavemente no suporte de amostra do microscópio de fluorescência personalizado. Isso deve fazer contato óptico com a lente objetiva de alta abertura numérica. Em seguida, ligue a câmera multiplicadora de elétrons do microscópio e configure a câmera para ser resfriada a 70 graus Celsius negativos.

O software está configurado para adquirir imagens a uma taxa de quadros típica de 25 hertz. No modo de transferência de quadros. Ligue a iluminação de campo claro e coloque a imagem em foco.

Selecione uma célula ou grupo de células adequado para ser fotografado com base em sua presa ao seu eixo longo. Paralelamente à superfície da lamínula, ajuste o foco para garantir que as contas de látex de 200 nanômetros presas à superfície da lamínula estejam apenas em foco. Adquira uma sequência de imagens em campo claro para registrar o contorno do corpo celular.

A iluminação do campo claro é então desligada e o ganho da câmera é ativado ao máximo para imagens usando fluorescência de reflexão interna total, também conhecida como grama. Inicie a aquisição da câmera e abra o obturador do laser para excitar as proteínas fluorescentes dentro das bactérias. Os parâmetros de intensidade do laser e velocidade de aquisição precisam ser otimizados para o sistema biológico específico.

As amostras em estudo são iluminadas até o branqueamento da foto, o que normalmente leva cerca de 10 segundos. Uma vez que os dados foram coletados, as imagens são alimentadas em um programa de análise escrito personalizado, que detecta automaticamente as posições dos pontos fluorescentes nas células com uma precisão de alguns nanômetros e extrai seu tamanho e brilho. O brilho do traço de fotobranqueamento em relação ao tempo de atração do complexo molecular é então usado para estimar o uso da estequiometria.

Usando este método, a imagem das células vistas em campo claro é muito distinta, de modo que os perímetros dos corpos celulares são escuros contra um corpo celular cinza branco usando fluorescência com células imobilizadas. Pontos distintos de intensidade de 250 a 300 nanômetros de largura podem ser vistos aqui exibidos em cores falsas. Células amarradas saudáveis podem ser vistas girando em torno do ponto de fixação da corda em imagens de campo claro sob excitação fluorescente.

Alguns complexos moleculares também podem ser vistos no ponto de fixação, indicando uma localização da proteína tankada com o motor Geller. Essas manchas são complexos moleculares individuais. O número deles que são vistos dependerá do modo de iluminação usado e de quantos dos complexos estão realmente presentes na célula a qualquer momento.

Se a densidade das manchas for inicialmente muito alta, como é o caso dos citocromos marcados usados aqui, a realização de um alvejante inicial pode melhorar o contraste da imagem. A mobilidade das manchas depende do sistema biológico específico. Em estudo, acabamos de mostrar como visualizar complexos moleculares únicos usando microscopia de fluorescência avançada.

Ao fazer este procedimento, é importante não ter células de cisalhamento, pois isso pode prejudicar a funcionalidade do motor de sinalização. Também é importante não deixar as células nas lâminas do microscópio por mais de uma hora, pois elas podem ficar sem oxigênio. A automatização é necessária para encontrar as melhores condições de imagem.

Pode ajudar usando apenas GFP purificado para determinar a potência correta do laser para o seu sistema de microscópio específico. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.