Um ensaio de poliacrilamida-baseado formato multi bem para estudar o efeito da rigidez da matriz extracelular sobre a infecção bacteriana das células aderentes

O objetivo geral desta metodologia é permitir a caracterização do efeito da rigidez da matriz extracelular na infecção bacteriana de células aderentes de forma altamente quantitativa. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo emergente da biomecânica hospedeiro-patógeno, como qual é o papel das forças mecânicas na modulação da suscetibilidade à infecção bacteriana das células hospedeiras. Essa técnica ajuda a criar sequências de vídeo com lapso de tempo de alta resolução, ao mesmo tempo em que rastreia várias condições e automatiza certos procedimentos.

Para realizar a ativação do vidro de pratos de 24 poços, adicione 500 microlitros de hidróxido de sódio tumalo por poço de 13 milímetros de diâmetro e incube as placas em temperatura ambiente por uma hora. Descarte o hidróxido de sódio e use água ultrapura para enxaguar os poços uma vez. Em seguida, adicione 500 microlitros de trietoxissilano a dois por cento em etanol a 95% em cada poço e incube-os por cinco minutos.

Com água, enxágue os poços uma vez. Em seguida, adicione 500 microlitros de glutaraldeído a 0,5% em cada poço e incube as placas por 30 minutos. Depois de enxaguar uma vez com água, seque as placas a 60 graus Celsius sem a tampa.

Para fabricar hidrogéis de rigidez ajustável, prepare soluções aquosas que contenham de três a 10 por cento de uma solução de acrilamida a 40% e 06 a 6 por cento de uma solução de bisacrilamida a dois por cento, dependendo da rigidez desejada do hidrogel. Depois disso, adicione a água. Para cada rigidez, a Solução Um é livre de contas, enquanto a Solução Dois contém microesferas fluorescentes de 03% a 0,1 micrômetro.

Desgaseifique as soluções um e dois por vácuo por 15 minutos para eliminar o oxigênio que inibirá a polimerização. Em seguida, agindo rapidamente, adicione 0,43% TEMED e 0,6% da solução APS padrão de 10 gramas por mililitro à Solução Um. Adicione 3,6 microlitros da solução ao centro de cada poço do prato de 24 poços.

Use imediatamente lamínulas circulares de 12 milímetros para cobrir os poços e deixe a solução descansar por 20 minutos para polimerizar totalmente. Bata suavemente uma agulha de seringa em uma superfície dura para criar um pequeno gancho em sua ponta para facilitar a remoção das lamínulas e, em seguida, use a agulha para levantar as lamínulas. Em seguida, adicione 0,43% TEMED e 0,6% da solução APS estoque de 10 gramas por mililitro à Solução Dois.

Em seguida, deposite 2,4 microlitros da mistura em cima das lamínulas circulares de 12 milímetros. Coloque as lamínulas circulares com uma gota da Solução Dois em cima da primeira camada de poliacrilamida e use uma pinça para pressionar suavemente para baixo para garantir que a espessura da segunda camada seja mínima. Em seguida, deixe a Solução Dois polimerizar por 20 minutos.

Adicione 500 microlitros de HEPES 50 milimolares pH 7,5 a cada um dos poços e use a agulha da seringa e a pinça para remover as lamínulas de vidro. Para esterilizar os hidrogéis, coloque-os em uma capa de cultura de tecidos e exponha-os aos raios UV por uma hora. Agora, prepare uma mistura de 0,5% em peso por volume de Sulfo-SANPAH e um por cento de DMSO e 50 HEPES milimolares pH 7,5.

Adicione 200 microlitros da solução à superfície superior dos hidrogéis. Em seguida, trabalhando rapidamente, exponha-os a 302 nanômetros UV por 10 minutos para ativá-los. Use um mililitro de HEPES 50 milimolar pH 7,5 para lavar os hidrogéis duas vezes, repetindo se necessário para remover qualquer excesso de reticulante.

Proteja os hidrogéis com 200 microlitros de colágeno I de cauda de rato a 0,25 miligramas por mililitro e HEPES 50 milimolares. Incube os hidrogéis com o colágeno em temperatura ambiente durante a noite. Antes de semear as células de interesse nos hidrogéis, adicione um mililitro de meio e equilibre-as a 37 graus Celsius por uma hora.

Para semear células endoteliais microvasculares humanas, após a cultura e preparação de uma suspensão celular de acordo com o protocolo de texto, remova o meio dos hidrogéis e adicione um mililitro de suspensão celular a cada poço. Depois de preparar uma cultura noturna de L. monocytogenes de acordo com o protocolo de texto, transfira um mililitro da cultura para um tubo de microcentrífuga e gire-o a 2.000 vezes g em temperatura ambiente por quatro minutos. Depois de usar PBS de grau de cultura de tecidos para lavar o pellet duas vezes, use um mililitro de PBS para ressuspender o pellet.

Prepare a mistura de infecção combinando 10 ou 50 microlitros da suspensão bacteriana com um mililitro de meio completo MCDB 131 para uma multiplicidade de infecção, ou MOI, de aproximadamente 50 bactérias por célula hospedeira ou 10 bactérias por célula hospedeira. Remova o meio dos poços das placas de 24 poços, tomando cuidado para não romper os hidrogéis ou as células. Use um mililitro de meio completo MCDB 131 para lavar as células uma vez e, em seguida, adicione um mililitro da bactéria a cada poço.

Coloque a tampa nos pratos e embrulhe-os com filme plástico de polietileno para evitar vazamentos. Centrifugue as placas a 2.000 vezes g por 10 minutos para sincronizar a invasão e, em seguida, incube as culturas a 37 graus Celsius por 30 minutos. Com o meio completo MCDB 131, lave as amostras quatro vezes e devolva-as à incubadora de cultura de tecidos.

Após mais 30 minutos, substitua o meio por meio MCDB 131 completo suplementado com 20 microgramas por mililitro de gentamicina. Para realizar a citometria de fluxo, oito horas após a infecção, remova o meio dos poços da placa de 24 poços e use PBS de cultura de tecidos para lavar os poços uma vez. Após a remoção do PBS, adicione 200 microlitros de mistura de tripsina EDTA colagenase a cada poço.

Coloque o prato na incubadora de cultura de tecidos por 10 minutos para permitir o descolamento total das células. Depois de pipetar suavemente cada poço oito vezes, adicione 200 microlitros de meio completo para neutralizar a tripsina. Transfira os 400 microlitros de solução celular de cada poço para um tubo de poliestireno de cinco mililitros com uma tampa de filtro de célula de 35 micrômetros.

Analise as amostras por citometria de fluxo. Depois de semear células HMEC-1 em hidrogéis de Pa e tratar com gentamicina de acordo com o protocolo de texto, incubar a placa por cinco horas para permitir que o promotor ActA ligue e conduza a expressão do quadro de leitura aberto mTagRFP. Quatro horas após a infecção, misture um microlitro de um miligrama por mililitro de corante Hoechst com um mililitro de meio L-15 completo e adicione-o a cada poço para corar os núcleos.

Depois de incubar as células por 10 minutos, substitua o meio por um mililitro de meio completo L-15 suplementado com 20 microgramas por mililitro de gentamicina. Visualize várias posições a cada cinco minutos usando um recurso de foco automático para monitorar como as bactérias LM se espalham através das monocamadas HMEC-1 semeadas em hidrogéis de rigidez variável. Conforme relatado neste gráfico, as medições de AFM foram realizadas para confirmar a rigidez exata dos hidrogéis de Pa preparados usando o protocolo neste vídeo.

Aqui, as células HMEC-1 em matrizes de diferentes rigidezes foram infectadas com uma cepa LM que expressa um marcador fluorescente após a internalização que permite apenas a detecção de bactérias intracelulares. As células foram fechadas usando o gráfico de dispersão para frente versus lado e uma segunda etapa de gating excluiu as células que exibiam autofluorescência. A análise por citometria de fluxo revelou que a infecção por LM foi aproximadamente duas vezes maior em hidrogéis rígidos de 70 quilopascal versus 0,6 quilopascal.

Para testar se o aumento da adesão do LM ao HMEC-1, o aumento da invasão do LM no HMEC-1, ou ambos, foram responsáveis pelo aumento da suscetibilidade à infecção logo após a infecção com LM expressando constitutivamente GFP, as células HMEC-1 foram fixadas e as bactérias aderidas foram coradas com anticorpos. Como mostrado aqui, havia significativamente mais bactérias aderindo ao HMEC-1 quando as células hospedeiras residem em géis rígidos em comparação com os géis moles. Consistente com os dados de citometria de fluxo, há significativamente mais bactérias internalizadas pelo HMEC-1 quando as células hospedeiras residem em gel rígido em comparação com as cápsulas moles.

Uma vez dominado, este ensaio pode ser feito em aproximadamente três dias, pois há longas etapas de incubação necessárias entre elas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ser o mais estéril possível para garantir que os hidrogéis e as células hospedeiras estejam livres de contaminação. Após este procedimento, outros métodos, como a microscopia de força atômica, também podem ser incorporados para responder a perguntas como como a rigidez das células hospedeiras muda após a infecção e se esse efeito depende da rigidez da matriz.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da mecanobiologia explorarem o papel das interações biomecânicas do patógeno da célula hospedeira usando diferentes células hospedeiras, como as células epiteliais, e diferentes patógenos bacterianos, como Rickettsia parkeri. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como fabricar hidrogéis de rigidez ajustável em placas de vários poços e como realizar o ensaio de infecção. Não se esqueça de que trabalhar com bactérias patogênicas pode ser perigoso.

Portanto, cuidados como inserir barreiras entre o local de entrada e o patógeno, bem como evitar a geração de aerossóis devem ser sempre tomados durante a realização deste procedimento.