Visualizando a actina e microtúbulos citoesqueleto na célula B sinapse imune usando microscopia de depleção (STED) emissão estimulada

O objetivo geral deste protocolo é corar citoesqueletos de actina e microtúbulos na sinapse imune de células B para depleção de emissão estimulada, ou microscopia STED, e obter imagens de sua estrutura, organização em relações espaciais. Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre a organização do citoesqueleto durante a ativação das células B, incluindo a reorganização dos citoesqueletos de actina e microtúbulos durante a formação da sinapse imune. A principal vantagem da microscopia STED multicolorida é que ela permite a aquisição simultânea de imagens do citoesqueleto de actina, da rede de microtúbulos e das principais proteínas associadas ao citoesqueleto em resolução em escala nanométrica.

Embora esse método possa fornecer informações sobre a ativação de células B, ele também pode ser aplicado à formação de sinapses imunes de outros tipos de células imunes, como natural killer e células T. Geralmente, os indivíduos novos neste método descobrirão que otimizar as configurações do microscópio para a imagem simultânea e vários fluoróforos usando STED exigirá alguma prática. Demonstrando este procedimento junto com Jia e Madison estarão Kate Choi e Caitlin Pritchard.

Comece centrifugando 2,5 vezes 10 elevado à 6ª células de linfoma B A20 por cada transfecção e ressuspendendo as células em 100 microlitros de reagente de transfecção suplementado com um a 2,5 microgramas do DNA plasmático de interesse. Misture as soluções suavemente e transfira cada alíquota de células para poços individuais de uma placa de seis poços. Ajuste o volume em cada poço para dois mililitros com meio completo de 37 graus Celsius e coloque as células em uma incubadora de 37 graus Celsius por 18 horas.

Na manhã seguinte, mergulhe 1,5 lamínulas de vidro redondas de 18 milímetros em 100% de metanol e deixe as lamínulas secarem completamente por cerca de 10 minutos. Coloque as lamínulas secas em poços individuais de uma placa de cultura de tecidos de 12 poços e adicione 400 microlitros de anticorpo G de imunoglobulina G anti-camundongo de cabra no centro de cada lamínula para que uma bolha se forme no centro e se espalhe para as bordas sem pingar no poço. Incube as lamínulas em temperatura ambiente por 30 minutos.

Em seguida, enxágue as lamínulas com um mililitro de PBS estéril por poço, três vezes, para remover quaisquer anticorpos não ligados. Após a última lavagem, armazene cada lamínula em um mililitro de PBS fresco e estéril até a semeadura celular. Quando as células transfectadas estiverem prontas, colete-as em um tubo cônico de 15 mililitros por centrifugação e ressuspenda os pellets em um mililitro de solução salina tamponada com HEPES modificada suplementada com FBS.

Após a contagem, dilua as células para uma concentração de duas por 10 elevado a 5ª células por mililitro e solução salina tamponada com HEPES modificada mais FBS e use uma pinça para transferir cada lamínula para um pedaço de filme de parafina. Adicione 250 microlitros de células a cada lamínula e incube as lamínulas a 37 graus Celsius por 15 minutos no escuro para permitir que as células se espalhem pelas superfícies revestidas com antiimunoglobulina G. No final da incubação, retire o excesso de soro fisiológico de cada lâmina e cubra cada lamínula com 350 microlitros de fixador, cuidando para que toda a superfície seja coberta.

Após 10 minutos no escuro à temperatura ambiente, use uma micropipeta para aspirar cuidadosamente o fixador da borda de cada lamínula e lave as lamínulas com 500 microlitros de permeabilização e tampão de bloqueio. Em seguida, permeabilize e bloqueie as células com 250 microlitros de permeabilização fresca e tampão de bloqueio por 10 minutos em temperatura ambiente no escuro. Em seguida, remova o excesso de tampão e rotule as células com 50 microlitros do anticorpo primário de interesse por 30 minutos no escuro à temperatura ambiente.

No final da incubação, lave a lamínula três vezes com 500 microlitros de tampão de coloração por lavagem e adicione 50 microlitros do anticorpo secundário apropriado a cada lamínula por 30 minutos em temperatura ambiente. Depois de lavar o anticorpo secundário, adicione 10 microlitros de reagente de montagem a uma lâmina de microscópio e monte as lamínulas em lâminas de microscópio individuais, com o lado da célula voltado para baixo. Em seguida, deixe as lâminas secarem durante a noite no escuro para imagens do dia seguinte.

Para obter imagens das células com microscopia STED, primeiro ligue o microscópio STED. Ative os lasers na lâmpada de iluminação de epifluorescência e abra o software do microscópio. Defina os parâmetros para os lasers de depleção STED e carregue a primeira amostra no microscópio.

Usando a ocular, concentre-se manualmente na amostra para selecionar uma célula com uma expressão moderada de GFP. Amplie a célula selecionada e selecione a região de interesse a ser fotografada. Ajuste o foco para que o plano XY da célula mais próximo da lamínula esteja em foco.

Em seguida, na guia Adquirir do software, marque a opção Entre quadros no painel Varredura sequencial para definir a aquisição de imagem para aquisição de quadro sequencial. Defina a potência do laser STED para cada fluoróforo e use a barra deslizante para ajustar as potências do laser de acordo com os fluoróforos usados no experimento. Para aumentar a resolução e reduzir o sinal de fundo, abra as configurações de aquisição e use o menu suspenso para selecionar um valor maior que um para aumentar a média da linha e/ou do quadro.

Verifique a opção de ganho para cada fluoróforo e os valores específicos para ganho de tempo para adquirir o sinal fluorescente apropriado para STED com controle de tempo e aumente a potência do laser STED para melhorar a resolução. É fundamental otimizar o ganho de tempo de aquisição para a amostra de microscópio e os fluoróforos usados para melhorar a resolução sem perder muito do sinal fluorescente. Em seguida, adquira manualmente várias imagens para garantir a reprodutibilidade e desconvolucionar as imagens usando um pacote de software de deconvolução de acordo com as instruções do fabricante.

Para células de linfoma B A20, dissemina-se em anticorpos de imunoglobulina NT imobilizados. A microscopia STED usada em conjunto com o software de deconvolução fornece imagens de maior resolução das estruturas do citoesqueleto do que a microscopia confocal sozinha. Embora a deconvolução de imagens confocais produza uma melhoria substancial na resolução da imagem, as imagens STED deconvolvidas fornecem informações estruturais mais detalhadas do que as imagens confocais deconvolvidas.

O STED de cor única também pode ser usado para adquirir imagens tridimensionais de super-resolução de toda a rede de citoesqueletos de células B. Nessas imagens STED multicoloridas, a coloração do anel periférico da actina dendrítica pode ser observada em conjunto com a coloração dos microtúbulos. Ao usar células transfectadas com proteínas de fusão fluorescentes, atingir níveis ideais de expressão e evitar artefatos devido à superexpressão são considerações significativas, enquanto uma expressão muito baixa da proteína de fusão fluorescente também resulta em imagens de baixa qualidade.

O foco cuidadoso, para incluir toda a região de interesse, também é essencial. Por exemplo, nesta imagem, apenas partes da rede de microtúbulos estavam dentro do plano focal mais próximo da lamínula, impedindo uma análise completa da amostra. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em dois dias.

Um dia para a preparação e coloração da amostra e um dia para a imagem STED. É importante lembrar de titular a quantidade de plasma a ser usada para transfectar as células, de modo que você obtenha uma expressão suficiente de proteína fluorescente para detecção durante a imagem, evitando artefatos de superexpressão. Após este procedimento, a expressão de diferentes proteínas de fusão fluorescentes pode ser induzida para facilitar a localização de outras proteínas que regulam a dinâmica e organização do citoesqueleto, ou para visualizar a distribuição subcelular de proteínas envolvidas em outros processos celulares.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar a microscopia STED para a imagem de estruturas do citoesqueleto e proteínas envolvidas na formação de sinapses imunológicas. Não se esqueça de que trabalhar com fixadores como o glutaraldeído pode ser extremamente perigoso e que precauções como trabalhar em uma capela de exaustão química devem sempre ser tomadas ao usar esses tipos de reagentes.