Imagem diferencial de estruturas biológicas com Duplamente-ressonante Scattering Anti-Stokes Raman coerente (CARS)

A combinação de três único comprimento de onda curto lasers pulsados ​​é usado para gerar espalhamento anti-Stokes Raman coerente (CARS) e CARS duplamente ressonante (DR-CARS). A diferença entre estes sinais fornece maior sensibilidade para a outra forma difíceis de detectar sinais Raman coerente, permitindo que imagens de fraca dispersores Raman.

Este vídeo demonstra um procedimento para realizar imagens diferenciais de duas ressonâncias de ramen associadas a estruturas biológicas com sinais coerentes de espalhamento de ramen. Os três primeiros lasers de pulso curto sincronizados são sobrepostos no tempo e no espaço. Os pulsos sobrepostos são então enviados para um microscópio invertido padrão, que permite a geração de sinais ramen coerentes a partir de objetos microscópicos.

Os sinais são convertidos em imagens usando software comercial para comparar diferentes sinais de ramen produzidos. Os resultados indicam que a diferença entre as imagens obtidas a partir de sinais de ramen de ressonância dupla e individual fornece maior sensibilidade para sinais de ramen fracos. Olá, sou Tyler Weeks, do Centro de Biofotônica da Universidade da Califórnia em Davis.

Eu sou Thomas ER, do Centro de Biofotônica e do Departamento de Medicina Interna da Universidade da Califórnia em Davis. Hoje mostraremos um procedimento para usar o espalhamento antis stokes ramen coerente duplamente ressonante para produzir imagens quimicamente específicas de células. Usamos este procedimento para detectar sinais de moléculas que são muito fracas para serem detectadas diretamente apenas pela espectroscopia coerente antis Stokes Ramon.

Então vamos começar: para gerar carros e sinais de carros Dr simultaneamente, três fontes de laser de pulso curto sintonizáveis e sincronizadas são necessárias para obter esses pulsos sincronizados. Comece com um único laser de pulso curto com uma potência de saída de 10 watts. Um comprimento de onda fixo de 1064 nanômetros, um comprimento de pulso fixo de sete picossegundos e uma taxa de repetição fixa de 76 megahertz.

Usando uma série de placas de meia onda e cubos divisores de feixe polarizador, o feixe é dividido em três partes. Uma placa intermediária combinada com um cubo divisor de feixe polarizador permite o ajuste da quantidade de potência em cada componente do feixe sem alterar sua direção. Normalmente, dois feixes são ajustados para aproximadamente 4,5 watts cada, e o terceiro feixe contém o um watt restante.

Os dois feixes de alta potência são então direcionados para dois osciladores paramétricos ópticos independentes ou OPOs. Os OPOs usam geração de frequência diferente para converter um fóton de alta energia em dois fótons de baixa energia com comprimentos de onda diferentes. Ao controlar a temperatura do cristal usado para obter esse efeito, os comprimentos de onda dos fótons resultantes podem ser controlados com precisão de 0,1 nanômetros.

Ao dobrar a frequência desses sinais, um laser com um comprimento de onda fixo de 1064 nanômetros agora pode ser transformado em um feixe de laser que pode ser ajustado em qualquer lugar entre 780 nanômetros e 910 nanômetros, bombeando dois OPOs separados com a mesma fonte de 1064 nanômetros. Duas fontes de laser sintonizáveis independentes são obtidas que são sincronizadas automaticamente com o laser da bomba original. O terceiro feixe do laser da bomba de 1064 nanômetros é direcionado em torno dos OPOs por uma combinação de espelhos dielétricos para que todos os três feixes possam ser recombinados posteriormente.

Para produzir com eficiência fótons de sinal ramen coerentes, os pulsos recombinados devem ser sobrepostos temporária e espacialmente porque os OPOs contêm cavidades em anel que permitem que cada pulso de laser passe pelo cristal várias vezes que o feixe enviado pelos OPOs percorre uma distância extra, resultando em um atraso considerável em relação ao feixe da bomba original. Essa distância deve ser compensada com um terceiro feixe, introduzindo espelhos extras que forçam esse feixe a percorrer a mesma distância que os outros dois antes de serem recombinados usando espelhos dicróicos para fornecer um ajuste fino do comprimento do caminho. Cada feixe é enviado através de estágios de atraso ajustáveis, que permitem o ajuste da sobreposição temporal dos diferentes pulsos de laser.

Outro conjunto de placas intermediárias e cubos divisores de feixe polarizador são adicionados a cada feixe para permitir o ajuste da potência do laser de cada feixe de forma independente. Espelhos dicróicos são usados para combinar primeiro os feixes dos dois OPOs e, em seguida, o feixe de 1064 nanômetros deve ser tomado cuidado para garantir que os feixes sejam precisamente sobrepostos no espaço. Isso pode ser verificado comparando a sobreposição dos feixes a poucos centímetros do espelho dicróico com aqueles a aproximadamente um metro do espelho dicróico.

Como a exposição a feixes de laser de alta potência média pode danificar a amostra, os três feixes combinados são enviados através de um modulador óptico elétrico que funciona como um coletor de pulsos, que permite o ajuste da taxa de repetição dos pulsos que chegam à amostra e, portanto, a potência média. Os feixes de laser combinados são então acoplados a um microscópio invertido com uma lente objetiva com alta abertura numérica ou na. O foco apertado gerado pela lente objetiva de alta NA permite a geração mais eficiente de sinais ramen coerentes em escalas de comprimento microscópicas.

A lente objetiva do microscópio é montada em um estágio X, Y, Z pizo, que permite que as imagens sejam obtidas por varredura raster dos feixes através da amostra semelhante à varredura de feixe comercial, microscópios confocais. Agora vamos ver como gerar carros e sinais D-R-F-W-M a interação de três feixes de laser de pulso curto na amostra resulta na geração de vários sinais de mistura de quatro ondas, como carros das várias combinações de dois lasers, bem como carros de três cores e sinais de carros DR da combinação de todos os três lasers. Quando os sinais são relativamente próximos em comprimento de onda, pode ser difícil separá-los para análise.

Por esse motivo, os sinais são passados para um espectrômetro de imagem que também serve como monocromador ou filtro passa-banda para separar espacialmente os sinais em diferentes comprimentos de onda. Um espelho flip acionado eletronicamente dentro do espectrômetro na posição abaixada envia o sinal para um dispositivo acoplado de carga de depleção profunda retroiluminado ou câmera CCD, que fornece informações espectroscópicas em toda a faixa do sinal e nos permite identificar e otimizar os vários sinais de robin coerentes para selecionar o sinal para a imagem. Basta girar a classificação dentro do espectrômetro usando o software de controle e aquisição de dados fornecido pelo fornecedor para centralizar o pico de interesse na câmera CCD.

Em seguida, altere a posição do espelho flip para redirecionar o sinal para uma segunda porta de saída à qual uma única foto de avalanche de contagem de fótons DDE ou um PD está conectada. Raster. Digitalize a lente objetiva e use os sinais gravados no A PD para gerar uma imagem exibindo a taxa de contagem de fótons para cada pixel com o software de aquisição de dados. Repita este procedimento de imagem para cada sinal ramen coerente desejado para que os sinais possam ser comparados durante o pós-processamento.

Agora vamos ver como preparar adequadamente uma amostra para obter imagens claras e reproduzíveis. Algum cuidado deve ser tomado na preparação das amostras. As amostras são normalmente preparadas em lamínulas de vidro de aproximadamente 150 mícrons de espessura.

Essas lamínulas são finas o suficiente para permitir imagens de alta resolução com as lentes objetivas de imersão em água ou óleo de alta NA que são usadas nesses experimentos. Para demonstrar a preparação de uma amostra típica, preparamos seções de aproximadamente 20 mícrons de espessura de tecido muscular de camundongo que são fixadas a uma lâmina de microscópio. Uma gota de 20 microlitros de solução de glicose deuterada de cinco molares é adicionada à amostra.

A solução de glicose deuterada fornece uma assinatura de fundo de ramen única e forte. Uma lamínula de vidro é colocada em cima da amostra e fixada no lugar com esmalte para células e cultura. Podem ser usadas placas de cultura com fundo de vidro que permitem a aquisição de imagens sem a necessidade de separar as células de suas placas de crescimento de cultura de células.

Agora vamos ver como determinar o rum e os picos adequados para os carros Dr. Para aproveitar adequadamente o efeito de aprimoramento duplamente ressonante, os espectros de ramen de ambas as substâncias ressonantes de ramen devem ser conhecidos. Normalmente, são 2.845 centímetros inversos associados a lipídios e 2.121 centímetros inversos para o modo de estiramento de CD associado à glicose deuterada.

O espalhamento ramen coerente é alcançado quando a diferença de frequência entre dois lasers corresponde à frequência de uma vibração molecular. Ajustando um OPO para 817 nanômetros, ele sondará o modo C de 2.845 centímetros inversos quando combinado com o feixe de laser de 1064 nanômetros e, ajustando o outro OPO para 868 nanômetros, ele sondará o centímetro inverso de 2.121 quando combinado com o feixe de 1064 nanômetros. No modo espectroscópico, o microscópio do carro nos permite observar três sinais ramen coerentes de interesse, um sinal de carro sondando a vibração de alongamento CH, um sinal de carro sondando o modo de alongamento de CD e um sinal de carro DR sondando ambos no diagrama mostrado aqui, setas tracejadas indicam fótons do laser nos OPOs e setas sólidas indicam o sinal resultante.

As linhas horizontais sólidas indicam a energia da vibração do ramen e dão uma representação visual de que nos carros DR misturando os mesmos três fótons de entrada simultaneamente sonda duas vibrações ramen diferentes. A intensidade do sinal para cada pico precisará ser otimizada ajustando em etapas finas em torno desses locais de pico. Aqui, selecionamos cada pico e tiramos imagens de vermes elgan do mar em uma solução de glicose reduzida, extrair informações adicionais com base nessas três imagens obtidas individualmente requer um processamento de imagem bastante simples.

Primeiro, as imagens devem ser normalizadas. Um método prático de normalização depende do fato de que os lipídios são hidrofóbicos. Isso significa que em regiões de lipídios de alta densidade, a ressonância do CD da glicose deve contribuir muito pouco para o sinal de ressonância dupla.

Por outro lado, em regiões de solução de glicose pura, as ressonâncias CH dos lipídios também devem contribuir muito pouco. Com isso em mente, normalize a imagem do carro DR e a imagem do carro obtida na ressonância CD da solução de glicose deuterada para uma região bem fora do verme de CL egan que não deve exibir ressonância CH. Em seguida, identifique uma região dentro do verme na imagem do carro ressonante CH que seja rica em lipídios e normalize-a para a região correspondente dentro da imagem do carro DR normalizada.

Para que esse método funcione corretamente, suponha que nas profundezas dessa região não haja glicose deuterada. Esta é uma suposição segura, uma vez que os lipídios são hidrofóbicos e não se misturam com a solução. Agora, subtraindo a imagem do carro ressonante CH normalizado da imagem do carro DR normalizado, apenas o sinal ressonante do CD amplificado permanece da mesma forma, subtraindo a imagem do carro ressonante do CD normalizado da imagem normalizada do Dr.FWM.

Apenas o sinal de ressonância de ch amplificado permanece mostrado aqui é o espectro de ramen para um ácido oleico modificado que inclui uma modificação de alcina, as fortes ressonâncias de CH em 2.845 centímetros inversos e a ressonância alpina em 2.121 centímetros inversos são bem isoladas da região da impressão digital, que é a região de picos densamente compactados, tornando-os marcadores ideais para imagens de ramen coerentes. Este é um espectro típico de sinais ramen coerentes gerados quando três lasers de pulso curto são sobrepostos dentro da amostra. As setas apontam para os processos responsáveis por cada sinal, representados por diagramas de energia.

Estes são resultados típicos da imagem de vermes de C Elgin usando carros e carros DR. A linha superior usou os três sinais que acabamos de mostrar para obter imagens de um verme em uma solução de glicose reduzida. Na segunda linha, as imagens foram devidamente normalizadas e na terceira linha as imagens de diferença foram produzidas Subtraindo cada uma das imagens do carro da imagem do carro DR, acabamos de mostrar como realizar imagens de diferença Raman com base em microscopia antis Raman coerente duplamente ressonante.

Ao fazer este procedimento, lembre-se de que é importante certificar-se de que os feixes estejam sobrepostos e sincronizados corretamente. Além disso, ao alternar entre diferentes sinais coerentes, certifique-se de não bater ou mover a amostra, pois isso afetará a análise. Então é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.