Imagem diferencial de estruturas biológicas com Duplamente-ressonante Scattering Anti-Stokes Raman coerente (CARS)

Este vídeo demonstra um procedimento para realizar imagem diferencial de duas ressonâncias Raman associadas a estruturas biológicas com sinais de espalhamento Raman coerente. Primeiro, três lasers de pulso curto sincronizados são sobrepostos no tempo e no espaço. Os pulsos sobrepostos são então enviados a um microscópio invertido padrão, o que permite a geração de sinais Raman coerentes a partir de objetos microscópicos.

Os sinais são convertidos em imagens utilizando software comercial para comparar diferentes sinais de raman produzidos. Os resultados indicam que a diferença entre as imagens obtidas a partir de sinais de raman duplamente e simplesmente ressonantes proporciona uma sensibilidade aprimorada para sinais de raman fracos. Olá, sou Tyler Weeks do Centro de Biofotônica da Universidade da Califórnia em Davis.

Sou Thomas ER do Centro de Biofotônica e do Departamento de Medicina Interna da Universidade da Califórnia, Davis. Hoje vamos mostrar um procedimento para utilizar a espalhamento raman coerente anti-Stokes ressonante duplo para produzir imagens quimicamente específicas de células. Utilizamos este procedimento para detectar sinais de moléculas que são demasiado fracos para serem detectados diretamente pela espectroscopia coerente anti-Stokes Raman sozinha.

Então vamos começar. Para gerar os sinais de carros e Dr carros simultaneamente, são necessárias três fontes a laser de pulsos curtos, ajustáveis e sincronizadas. Para obter esses pulsos sincronizados, comece com um único laser de pulso curto com potência de saída de 10 watts, comprimento de onda fixo de 1064 nanômetros, duração de pulso fixa de sete picosegundos e taxa de repetição fixa de 76 megahertz.

Usando uma série de placas de meia onda e cubos divisores de feixe polarizantes, o feixe é dividido em três partes. Uma placa de meia onda combinada com um cubo divisor de feixe polarizante permite o ajuste da quantidade de potência em cada componente do feixe sem alterar sua direção. Normalmente, dois feixes são ajustados para aproximadamente 4,5 watts cada, e o terceiro feixe contém o watt restante.

Os dois feixes de alta potência são então direcionados para dois osciladores ópticos paramétricos independentes ou OPOs. Os OPOs utilizam geração de frequência diferente para converter um fóton de alta energia em dois fótons de menor energia com comprimentos de onda distintos. Ao controlar a temperatura do cristal usado para obter esse efeito, os comprimentos de onda dos fótons resultantes podem ser controlados com precisão de até 0,1 nanômetro.

Ao dobrar a frequência desses sinais, um laser com comprimento de onda fixo de 1064 nanômetros pode agora ser transformado em um feixe laser que pode ser ajustado em qualquer ponto entre 780 nanômetros e 910 nanômetros, bombeando dois OPOs separados com a mesma fonte de 1064 nanômetros. Obtêm-se duas fontes laser independentemente ajustáveis que são automaticamente sincronizadas com nosso laser de bombeamento original. O terceiro feixe do laser de bombeamento de 1064 nanômetros é desviado ao redor dos OPOs por meio de uma combinação de espelhos dielétricos, de modo que os três feixes possam ser recombinados posteriormente.

Para produzir de forma eficiente fótons de sinal de raman coerentes, os pulsos recombinados devem ser sobrepostos tanto temporal quanto espacialmente, porque os OPOs contêm cavidades em anel que permitem que cada pulso a laser passe várias vezes pelo cristal, fazendo com que o feixe enviado através dos OPOs percorra uma distância adicional, resultando em um atraso considerável em relação ao feixe de bombeamento original. Essa distância deve ser compensada com um terceiro feixe, introduzindo espelhos adicionais que forçam esse feixe a percorrer a mesma distância que os outros dois antes de serem recombinados usando espelhos dicróicos, a fim de proporcionar ajuste fino do comprimento do percurso. Cada feixe é enviado através de estágios de atraso ajustáveis, que permitem o ajuste da sobreposição temporal dos diferentes pulsos a laser.

Um outro conjunto de placas de meia onda e cubos divisores de feixe polarizantes é adicionado a cada feixe para permitir o ajuste independente da potência do laser em cada um. Espelhos dicróicos são utilizados primeiramente para combinar os feixes provenientes dos dois OPOs, e então o feixe de 1064 nanômetros; é necessário ter cuidado para garantir que os feixes estejam exatamente sobrepostos no espaço. Isso pode ser verificado comparando a sobreposição dos feixes a poucos centímetros do espelho dicróico com a sobreposição a aproximadamente um metro do espelho dicróico.

Como a exposição a feixes a laser de alta potência média pode danificar a amostra, os três feixes combinados são enviados através de um modulador eletro-óptico que funciona como um seletor de pulsos, o qual permite o ajuste da taxa de repetição dos pulsos que chegam à amostra e, consequentemente, da potência média. Os feixes de laser combinados são então acoplados a um microscópio invertido com uma lente objetiva de alta abertura numérica ou NA. O foco apertado gerado pela lente objetiva de alto NA permite a geração mais eficiente de sinais de Raman coerente em escalas microscópicas.

A lente objetiva do microscópio é montada em uma platina piezoelétrica X, Y, Z, o que permite obter imagens por meio de uma varredura em raster dos feixes sobre a amostra, de forma semelhante aos microscópios confocais comerciais com varredura de feixe. Agora vamos ver como gerar sinais CARS e D-R-F-W-M: a interação de três feixes a laser de pulso curto na amostra resulta na geração de diversos sinais de mistura de quatro ondas, como CARS a partir das várias combinações de dois lasers, bem como sinais CARS de três cores e CARS DR provenientes da combinação dos três lasers. Quando os sinais são relativamente próximos em comprimento de onda, pode ser difícil separá-los para análise.

Por esse motivo, os sinais são direcionados a um espectrômetro de imagem que também atua como monocromador ou filtro de passagem de banda, separando espacialmente os sinais em diferentes comprimentos de onda. Um espelho basculante acionado eletronicamente dentro do espectrômetro, na posição abaixada, envia o sinal a uma câmera de dispositivo acoplado por carga ou CCD, iluminada pela parte traseira e com camada de depleção profunda, que fornece informações espectroscópicas em toda a faixa de sinal, permitindo-nos identificar e otimizar os diversos sinais coerentes de robin para selecionar o sinal a ser imageado. Basta girar a grade dentro do espectrômetro utilizando o software de controle e aquisição de dados fornecido pelo fabricante para centralizar o pico de interesse na câmera CCD.

Em seguida, altere a posição do espelho reversível para desviar o sinal para uma segunda saída, à qual está acoplado um fotodiodo avalancha de contagem de fóton único ou um PD. Realize uma varredura raster do objetivo e, então, utilize os sinais registrados no PD-A para gerar uma imagem exibindo a taxa de contagem de fótons para cada pixel com o software de aquisição de dados. Repita este procedimento de imagem para cada sinal Raman coerente desejado, de modo que os sinais possam ser comparados durante o pós-processamento.

Agora vamos ver como preparar adequadamente uma amostra para obter imagens nítidas e reprodutíveis. É necessário ter alguns cuidados no preparo das amostras. As amostras são tipicamente preparadas em lamínulas de vidro com cerca de 150 mícrons de espessura.

Essas lamínulas são finas o suficiente para permitir a obtenção de imagens de alta resolução com objetivas de imersão em água ou óleo de alta abertura numérica (NA), que são utilizadas nestes experimentos. Para demonstrar o preparo de uma amostra típica, preparamos seções com aproximadamente 20 mícrons de espessura de tecido muscular de camundongo fixadas em uma lâmina de microscopia. Uma gota de 20 microlitros de solução de glicose deuteriorada cinco molar é adicionada à amostra.

A solução de glicose deuteriorada fornece uma assinatura de fundo ramen única e forte. Uma lamínula de vidro é colocada sobre a amostra e fixada com esmalte para células e cultivo. Pode-se usar placas de cultivo com fundo de vidro, que permitem a obtenção de imagens sem a necessidade de destacar as células de suas placas de crescimento para cultivo celular.

Agora vamos ver como determinar os picos de rum e os picos adequados para os carros do Dr. Para aproveitar adequadamente o efeito de realce duplamente ressonante, é necessário conhecer os espectros de raman de ambas as substâncias ressonantes de raman. Normalmente, esses são 2.845 centímetros inversos associados aos lipídios e 2.121 centímetros inversos para o modo de alongamento do CD associado à glicose deuteriorada.

A dispersão Raman coerente é alcançada quando a diferença de frequência entre dois lasers corresponde à frequência de uma vibração molecular. Ao ajustar um OPO para 817 nanômetros, ele sondará o modo C de 2.845 centímetros inversos ao ser combinado com o feixe a laser de 1.064 nanômetros; ao ajustar o outro OPO para 868 nanômetros, ele sondará o modo de 2.121 centímetro inverso ao ser combinado com o feixe a laser de 1.064 nanômetros. No modo espectroscópico, o microscópio CARS permite observar três sinais Raman coerentes de interesse: um sinal CARS que sonda a vibração de alongamento CH, um sinal CARS que sonda o modo de alongamento CD e um sinal CARS-DR que sonda ambos. No diagrama apresentado aqui, setas tracejadas indicam fótons provenientes dos lasers nos OPOs e setas contínuas indicam o sinal resultante.

As linhas horizontais sólidas indicam a energia da vibração Raman e fornecem uma representação visual de que, em espectros Raman de dispersão coerente, a mistura simultânea dos mesmos três fótons de entrada sonda duas vibrações Raman diferentes. A intensidade do sinal para cada pico precisará ser otimizada mediante ajustes em pequenos passos ao redor dessas posições de pico. Aqui, selecionamos cada pico e adquirimos imagens de vermes marinhos do gênero *C. elegans* em uma solução de glicose desacetilada; extrair informações adicionais com base nessas três imagens obtidas individualmente exige um processamento de imagem relativamente simples.

Primeiro, as imagens devem ser normalizadas. Um método prático para normalização baseia-se no fato de que os lipídios são hidrofóbicos. Isso significa que em regiões com alta densidade de lipídios, a ressonância CD da glicose deve contribuir muito pouco para o sinal de ressonância dupla.

Por outro lado, em regiões de solução pura de glicose, as ressonâncias CH dos lipídios também devem contribuir muito pouco. Com isso em mente, normalize a imagem do carro DR e a imagem do carro obtida na ressonância CD da solução de glicose deuteriorada para uma região bem fora do verme CL egan que não deve exibir ressonância CH. Em seguida, identifique uma região dentro do verme na imagem ressonante CH do carro que seja rica em lipídios e normalize-a para a região correspondente dentro da imagem normalizada do carro DR.

Para que este método funcione corretamente, considere que, profundamente nesta região, não há glicose deuteriorada presente. Essa é uma suposição segura, já que os lipídios são hidrofóbicos e não se misturarão com a solução. Agora, subtraindo-se a imagem normalizada do sinal ressonante CH da imagem normalizada do sinal ressonante DR, apenas o sinal ressonante CD amplificado permanece, de forma análoga à subtração da imagem normalizada do sinal ressonante CD da imagem normalizada Dr.FWM.

Apenas o sinal ressonante de CH amplificado permanece. Aqui é mostrado o espectro Raman para um ácido oleico modificado que inclui uma modificação alquínica: as fortes ressonâncias de CH em 2.845 cm⁻¹ e a ressonância alquínica em 2.121 cm⁻¹ estão ambas bem isoladas da região de impressão digital, que é a região com picos densamente agrupados, tornando-as marcadores ideais para imageamento Raman coerente. Este é um espectro típico de sinais Raman coerentes gerados quando três lasers de pulso curto se sobrepõem dentro da amostra. As setas indicam os processos responsáveis por cada sinal, conforme representado por diagramas de energia.

Estes são resultados típicos do imageamento de vermes de C. Elgin utilizando carros DR e carros. A primeira linha utilizou os três sinais mostrados anteriormente para imagear um verme em uma solução de glicose reduzida. Na segunda linha, as imagens foram normalizadas adequadamente e, na terceira linha, foram produzidas as imagens de diferença subtraindo-se cada imagem do carro da imagem do carro DR. Acabamos de mostrar como realizar imageamento de diferença Raman com base na microscopia coerente anti-Stokes Raman duplamente ressonante.

Ao realizar este procedimento, lembre-se de que é importante garantir que os feixes estejam sobrepostos e sincronizados corretamente. Além disso, ao alternar entre diferentes sinais coerentes, certifique-se de não tocar nem mover a amostra, pois isso afetará a análise. Assim sendo, é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.