Estabelecer embrionárias de rato Cultura de Células-tronco neurais utilizando o ensaio Neurosphere
11 de janeiro de 2011
Este protocolo de vídeo demonstra a aplicação do ensaio neurosphere para o isolamento e expansão de células-tronco neurais do eminências ganglionares do dia 14 de embriões de rato-cérebro.
O objetivo deste protocolo em vídeo é isolar e expandir células-tronco neurais do cérebro de camundongo embrionário utilizando o ensaio de neuroesferas. O procedimento inclui a coleta de embriões de camundongo E14, seguida por microdissecação cerebral para obter as eminências ganglionares, dissociação do tecido coletado para obter uma suspensão de células únicas e, finalmente, o plaqueamento das células em cultura de neuroesferas. Olá, sou Hassan Ali do laboratório do Dr. Brent Frenzel, no Instituto Cerebral da Universidade da Flórida.
Hoje vou mostrar como estabelecer um cultivo de neuroesferas a partir do cérebro de camundongo embrionário utilizando o ensaio de neuroesferas. Utilizamos rotineiramente este ensaio em nosso laboratório para isolar e expandir células-tronco neurais. Pronto, vamos começar.
Anestesie uma camundonga prenhe acasalada no tempo determinado. No dia 14 de gestação, realize a dislocação cervical e lave o abdômen com etanol a 70%. Segure a pele sobre o abdômen usando pinças grandes e, em seguida, corte a pele e a fáscia subjacente com tesouras grandes.
Para expor a cavidade abdominal e os cornos uterinos, remova os cornos uterinos contendo os embriões e transfira-os para um tubo cônico de 50 ml contendo hem frio. Após transferir os tecidos uterinos para a cabine de segurança biológica classe II, remova o hem do tubo de 50 ml e lave os tecidos com volume suficiente de hem fresco e frio para remover contaminantes como sangue e pelos, realizando duas a três lavagens dessa forma. Transfira os tecidos uterinos para uma placa de Petri de 10 centímetros contendo hem frio.
Abra os cornos uterinos usando pinças curvas pequenas e tesoura e transfira os embriões para um novo recipiente contendo hem frio. Repita este procedimento até que todos os embriões tenham sido coletados. Em seguida, coloque os embriões sob o microscópio estereoscópico.
Seccione as cabeças dos embriões ao nível da medula espinhal cervical e transfira-as para outro recipiente de Petri contendo hem frio. Segure a cabeça com pinças curvas finas usando tesouras microcirúrgicas. Primeiro, faça um corte horizontal acima do nariz e, em seguida, continue cortando na linha média, da testa em direção à parte posterior da cabeça.
Certifique-se de cortar a pele e o crânio sem danificar o cérebro subjacente. Remova o cérebro do crânio empurrando as bordas da seção cortada em movimento para trás, utilizando a pinça curva. Continue este procedimento até que todos os cérebros sejam removidos dos crânios.
Segure o cérebro firmemente com a pinça curva de modo que o lado dorsal esteja voltado para cima e, com tesoura microcirúrgica, corte o córtex de cada hemisfério desde os bulbos olfatórios até a parte posterior do hemisfério. Para expor as eminências ganglionares, mantendo o cérebro fixo, dissecar toda a eminência ganglionar com pinça em ângulo de 45 graus e transferi-la para outro recipiente de Petri. A eminência ganglionar é claramente visível aqui, com suas partes medial e lateral.
Alternativamente, você pode dissecar as eminências ganglionares removendo os tecidos circundantes usando pinças finas. Você também pode cortar toda a eminência em uma metade medial e lateral, caso tenha interesse em cultivar células de uma dessas regiões.
Repita este procedimento até que todos os cérebros tenham sido microdissecados. Use um mililitro de meio de células-tronco neurais para coletar os fragmentos de tecido e transfira-os para um tubo cônico de 15 mililitros. Deixe os agregados de tecido sedimentarem no tubo de 15 mililitros para não deixar nenhum tecido para trás.
Remova parte do meio sobrenadante e lave a base da placa de Petri para transferir qualquer tecido adicional para o tubo de 15 ml. Posicione a ponteira da pipeta contra o fundo do tubo. Pipete a suspensão para cima e para baixo de três a quatro vezes para dissociar o tecido, obtendo uma suspensão de células isoladas.
Em seguida, deixe a suspensão repousar por um minuto para que os agregados não associados precipitem; transfira quase toda a suspensão celular para outro tubo de 15 ml. Em seguida, adicione um mililitro de meio de células-tronco neurais aos agregados remanescentes e dissocie-os em células individuais. Aspire o conteúdo dos tubos.
Em seguida, centrifugue a suspensão a 700 RPM ou 110 G durante cinco minutos. Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em um mililitro de meio completo para células-tronco neurais. Retire 10 microlitros da suspensão celular e misture bem com 90 microlitros de azul de trian.
Em seguida, retire 10 microlitros dessa suspensão e transfira para um hemocitômetro. Realize uma contagem celular. Transfira um volume total de 20 ml de meio completo para células-tronco neurais para um tubo cônico de 50 ml para semear um frasco T 80.
Em seguida, misture a suspensão celular e adicione uma quantidade apropriada de células para uma densidade total de 200.000 células por mililitro ou 4 milhões de células por frasco T 80. Adicione EGF numa concentração final de 20 nanogramas por mililitro. Misture as células que estão no meio completo para células-tronco neurais com fator de crescimento e transfira a suspensão celular para frascos T 80.
Rotule o frasco e examine as células ao microscópio para garantir que você tenha uma suspensão de células únicas sem agregados de tecido. Transfira o frasco para uma incubadora a 37 graus Celsius com 5%CO2 por cinco a sete dias. Após cinco a sete dias, avalie o frasco ao microscópio.
Neste momento, neuroesferas já se formaram e devem ter entre 150 e 200 mícrons de diâmetro, estando prontas para serem subcultivadas. Colete o conteúdo do frasco em um tubo estéril de cultura de tecidos de tamanho apropriado, centrifugue o tubo e descarte o sobrenadante. Re-suspenda as esferas em um mililitro médio de tripsina pré-aquecida e coloque o tubo em banho-maria a 37 graus por dois minutos.
Em seguida, adicione um volume igual de inibidor de tripsina e misture bem, mas suavemente, para interromper a atividade da tripsina. Centrifugue novamente e remova o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda as células em um mililitro de meio completo para células-tronco neurais e realize uma contagem celular conforme mencionado anteriormente. Para semear um frasco T175, transfira um total de 40 ml de meio completo para células-tronco neurais para um tubo cônico de 50 ml.
Em seguida, misture as células e adicione uma quantidade apropriada de células para uma densidade total de 50.000 células por M ou 2 milhões de células por frasco T175. Em seguida, adicione EGF numa concentração final de 20 nanogramas por mililitro. Misture as células que estão no meio completo de células-tronco neurais com o fator de crescimento e transfira a suspensão celular para um frasco T175.
Rotule o frasco e transfira-o para uma incubadora por cinco a sete dias. Este é um exemplo de cultura primária de células-tronco neurais E 14. Três dias após o plaqueamento, as setas indicam aglomerados de células-tronco neurais em proliferação.
Você também pode observar células aderidas ao substrato e diferenciadas. Este é um exemplo de cultura primária de células-tronco neurais E 14 sete dias após o plaqueamento. Como é possível ver, há esferas de diversos tamanhos.
Existem também células que estão diferenciadas. A quantidade de detritos é muito menor do que nas culturas de neuroesferas primárias de adultos. Além disso, as esferas não são compactas e apresentam microespinhos na periferia, indicando que estão saudáveis e viáveis.
A esfera não deve ser permitida crescer demais, pois pode escurecer devido à morte celular no centro. Esferas grandes podem também aderir ao substrato e se diferenciar. Este é um exemplo de neuroesferas do Passe um E 14 cinco dias após o plaqueamento.
Aqui novamente, é possível observar as microspículas na periferia das esferas. Acabamos de mostrar como cultivar neuroesferas a partir dos eminências ganglionares de camundongo E14 seguindo os mesmos procedimentos descritos aqui. Você também pode cultivar neuroesferas a partir de outras regiões do cérebro, como córtex e mesencéfalo.
Obrigado por assistir e boa sorte com seus cultivos de neuroesferas.
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Visão Geral
Este protocolo em vídeo demonstra a aplicação do ensaio de neuroesferas para o isolamento e expansão de células-tronco neurais provenientes das eminências ganglionares do cérebro de camundongos no dia embrionário 14. O procedimento inclui a coleta de embriões de camundongo E14, microdissecação cerebral e o plaqueamento de células em cultura de neuroesferas.
Principais Componentes do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Biologia das Células-Tronco
- Biologia do Desenvolvimento
Contexto
- As células-tronco neurais são fundamentais para o desenvolvimento e reparo do cérebro.
- A eminência ganglionar é uma fonte importante dessas células durante o desenvolvimento embrionário.
- O ensaio de neuroesferas permite o isolamento e a expansão de células-tronco neurais in vitro.
- Essa técnica é amplamente utilizada em pesquisas para estudar as propriedades das células-tronco neurais.
Objetivo do Estudo
- Isolar células-tronco neurais do cérebro de camundongo embrionário.
- Expandir essas células para pesquisas e aplicações futuras.
- Demonstrar o ensaio de neuroesferas como um método confiável para cultura de células-tronco.
Métodos Utilizados
- Coleta de embriões de camundongo E14.
- Microdissecação do cérebro para obter as eminências ganglionares.
- Dissociação do tecido para criar uma suspensão de células simples.
- Plaqueamento de células em condições de cultura de neuroesferas.
Resultados Principais
- Isolamento bem-sucedido de células-tronco neurais das eminências ganglionares.
- Estabelecimento de culturas de neuroesferas que podem ser expandidas.
- Demonstração da viabilidade e proliferação das células isoladas.
- Potencial para aplicações adicionais na pesquisa em neurociência.
Conclusões
- O ensaio de neuroesferas é um método eficaz para o isolamento e expansão de células-tronco neurais.
- Este protocolo pode ser utilizado em diversos contextos de pesquisa.
- Estudos futuros podem explorar o potencial de diferenciação dessas células.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O ensaio de neuroesferas permite o isolamento e a expansão de células-tronco neurais de camundongos embrionários, fornecendo uma fonte renovável de células multipotentes para a validação de alvos no sistema nervoso central em estágios iniciais e estudos mecanicistas. Um cultivo confiável de neuroesferas sustenta a confiança preditiva em modelos neurais relevantes para doenças, facilitando decisões ajustadas ao risco em pipelines de descoberta com foco em neurobiologia. Essa capacidade sustenta a continuidade translacional, desde a descoberta até a pesquisa pré-clínica, em portfólios de neurodegeneração e medicina regenerativa.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação da biologia de células-tronco neurais e mecanismos de vias em um sistema in vitro controlado.
- Permite a validação funcional de alvos ao fornecer progenitores neurais multpotentes para ensaios posteriores.
- Facilita a desmistificação mecanicista de alvos do SNC por meio de estudos reprodutíveis de expansão e diferenciação.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Fornece culturas padronizadas de células-tronco neurais para triagem quantitativa de compostos e ensaios fenotípicos.
- Garante reprodutibilidade e escalabilidade de ensaios baseados em células neurais para fluxos de trabalho de alto rendimento.
- Permite a preparação de sistemas biológicos validados para avaliação confiável de compostos neuroativos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se a modelos neurais relevantes para doenças, facilitando a descoberta e validação de biomarcadores translacionais.
- Apóia a continuidade desde a fase inicial de descoberta até a validação pré-clínica em programas voltados para o SNC.
- Reduz o risco biológico ao permitir avaliação preditiva da diferenciação neural e viabilidade.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio de neuroesferas posiciona o cultivo de células-tronco neurais na interface entre descobertas iniciais e pesquisas pré-clínicas, apoiando fluxos de trabalho desde a verificação de hipóteses até a identificação de compostos promissores na descoberta de fármacos para o sistema nervoso central.
- Biologia da Descoberta: Fornece uma plataforma para testes baseados em hipóteses das vias de desenvolvimento neural e diferenciação.
- Triagem: Oferece resultados quantitativos e reprodutíveis para avaliação de compostos em contextos neurais.
- Análises: Permite a medição da formação, tamanho e viabilidade de neuroesferas como parâmetros quantitativos.
- Pesquisa Translacional: Conecta estudos in vitro de células-tronco neurais com modelos pré-clínicos in vivo para alinhamento de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um recurso reutilizável de células-tronco neurais para múltiplos projetos de descoberta e validação.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos no sistema nervoso central.
- Valor Operacional: Padroniza fluxos de trabalho com células-tronco neurais para garantir reprodutibilidade e escalabilidade entre equipes.
- Valor Estratégico: Melhora a qualidade das decisões de avanço ou interrupção de projetos e a eficiência no uso de capital em portfólios de neurobiologia.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização e o avanço ajustados ao risco de programas de descoberta no sistema nervoso central.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em dissecação de cérebro embrionário e técnicas de cultivo de células-tronco neurais.
- Requer acesso a instalações estéreis de cultura de tecidos e instrumentação para contagem quantitativa de células.
- Necessita padronização entre equipes quanto à densidade celular, suplementação com fatores de crescimento e condições de cultivo.
- Pode ser necessária adaptação para diferentes regiões cerebrais ou estágios de desenvolvimento, conforme suportado pelo protocolo.
- É essencial monitorar cuidadosamente o tamanho e a viabilidade dos neuroesferoides para prevenir diferenciação ou morte celular.
