Name: Estabelecer embrionárias de rato Cultura de Células-tronco neurais utilizando o ensaio Neurosphere (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T20:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Aprenda a isolar e expandir células-tronco neurais de embriões de rato E14 usando o ensaio de neuroesferas. Este método demonstra microdissecação cerebral e cultura in vitro para pesquisa em neurociência e biologia do desenvolvimento.

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Este trabalho foi financiado pelo financiamento da Fundação Overstreet.

1. Configuração básica antes de prosseguir para dissecção: <ol><li> Volume apropriado de meio NSC completo é preparado pela mistura NeuroCult NSC Basal Medium e Suplementos NeuroCult NSC Proliferação na proporção 9:1, respectivamente. </li><li> O meio é aquecido em banho-maria a 37 ° C. </li><li> Frio HEPES-buffered meio mínimo essencial (HEM), com alta concentração de antibióticos (10%) está preparado para dissecção e propósito de lavar roupa. Alternativamente, NSC meio basal com a suplementação de antibióticos também pode ser utilizado para esta finalidade. </li><li> 25-30 mL de HEM frio contendo antibióticos é dispensada em tubos de 50 ml estéril para a coleta dos embriões. </li><li> Vários pratos de plástico Petri 10 centímetros são necessários para manter os embriões e os cérebros durante a dissecção e também para manter o tecido dissecado. </li><li> Os instrumentos cirúrgicos, necessários para remover os embriões (tesouras grandes, pequenas tesouras pontudas, pinças grandes, pequenas pinças curvas) ou para a dissecção do cérebro embrionário (pequeno fórceps, pinças curvas finas, em ângulo de 45 ° pinças finas e pequenas tesouras) são esterilizados usando conta de vidro estufa a 250 ° C ou outros métodos disponíveis autoclave. </li><li> Microscópio de dissecção é limpa com álcool 70% e criar dentro de um fluxo laminar ou capuz PC2. </li></ol> 2. Colheita E14 Cérebro de Rato e Micro-dissecção: <ol><li> Uma vez acoplado rato grávida é anestesiado no dia 14 de gestação de acordo com um protocolo de animais institucional aprovado. </li><li> Deslocamento cervical é realizada para se certificar de que o animal não sofre dor e angústia. </li><li> O rato anestesiado é colocado em sua parte traseira em um lenço de papel absorvente, eo abdômen é lavado com etanol 70% para esterilizar a área. </li><li> A pele sobre o abdômen é apreendido com uma pinça grande, e, em seguida, a pele ea fáscia é cortado com uma tesoura grande para expor a cavidade abdominal e os cornos uterinos. </li><li> O útero são removidos com uma pinça e tesouras pequenas e são transferidos para um tubo contendo 50 ml cônico HEM frio. </li><li> Os tecidos uterinos são transferidos para a capa e depois lavados uma ou duas vezes com volume suficiente de HEM estéril limpa e fria para remover possíveis contaminantes como o sangue e cabelo. </li><li> Os tecidos uterinos são então transferidos para um prato de Petri contendo 10 centímetros HEM frio. </li><li> Os cornos uterinos são abertos usando pequenas pinças e tesouras curvas e os embriões são transferidos para um prato de 10 centímetros novo, que contém HEM frio. </li><li> As cabeças dos embriões são separados ao nível da medula espinhal cervical e transferidos para outra placa de Petri contendo HEM frio. </li><li> Placa de Petri é transferida sob um microscópio de dissecação para remover o cérebro do crânio. </li><li> As cabeças são realizadas com uma pinça fina curva do lado caudal assim como o lado dorsal da cabeça são voltados para cima. Usando micro-tesouras, um primeiro corte horizontal é feita acima dos olhos e, em seguida, continuou na linha mediana da testa para a parte traseira da cabeça. Certifique-se de cortar a pele eo crânio e para não danificar o cérebro subjacente. </li><li> O cérebro é retirado do crânio, pressionando as bordas da seção de corte em um movimento para trás usando a pinça curva. Este procedimento continua até que todos os cérebros são removidos os crânios. </li><li> O cérebro é mantida constante utilizando a pinça curva de modo que o lado dorsal é voltada para cima e em seguida, usando microtesoura um corte é realizado através do córtex de cada hemisfério se estende do bulbo olfatório à parte traseira do hemisfério para expor as eminências ganglionares. </li><li> Usando a pinça curva em uma mão e as pinças de 45 ° angulada no outro, as abas de corte de córtices estão espalhados e as eminências ganglionares são dissecados. </li><li> O tecido dissecado é colocado em um prato de 10 centímetros de Petri estéreis, e este procedimento é repetido até que todos os cérebros foram micro-dissecados. </li><li> Pedaços de tecidos são coletadas utilizando 1 mL de meio de NSC em uma ponta da pipeta 1 mL e transferido para um tubo de centrifugação de 15 mL. </li><li> Tecido é então dissociado completamente, mas com cuidado, pressionando a ponta da pipeta no fundo do tubo e pipetar a suspensão para cima e para baixo. Desta forma, os aglomerados são quebrados em uma única célula. Pipetagem é realizado 3-4 vezes para que uma suspensão leitosa como é alcançado. Então, a suspensão é deixada em repouso por 1-2 minutos, de modo a clumps não dissociada precipitados. </li><li> Quase a suspensão célula inteira é transferida para outro tubo e depois outro de 1 mL de meio de NSC é adicionado ao clumps restantes e dissociado a única célula, como descrito. </li><li> O conteúdo dos tubos são reunidos e centrifugados por 5 minutos em temperatura ambiente, a 700rpm (110g). </li><li> O sobrenadante é aspirado off até o pellet real, e as células são ressuspendidas em 1 mL de meio de NSC completa. </li><li> O meio é gentilmente pipetado cima e para baixotem uma suspensão celular homogênea único. </li><li> 10 L da suspensão de células é misturado com 90 mL de azul de tripano para realizar uma contagem de células. </li><li> Finalmente, as células são banhados na densidade de 2x10 5 células / mL em meio NSC completo suplementado com 20ng / mL fator de crescimento epidérmico (EGF). 5 mL médio é usado para T25, T75 para 20 mL e 40 mL para frascos T175. </li><li> Neurospheres são formados em 5-7 dias, quando incubados a 37 ° C em uma incubadora umidificada com 5% de CO 2. Em 6-7 dias, as esferas devem medir entre 150-200 microns e estará pronto para subcultura (passagem). </li></ol> 3. Passaging e Expansão da NSCs embrionárias: <ol><li> Quando o neurospheres estão prontos para subcultura (150-200 m de diâmetro), o meio com esferas suspensão é removido dos frascos, colocado em um tubo de cultura apropriada estéril tamanho do tecido, e centrifugado a 700 rpm (110 g) por 5 min em temperatura ambiente. </li><li> O sobrenadante é descartado e as esferas são suspensas em 1 mL de 0,05% de tripsina-EDTA. </li><li> A suspensão de células é, então, incubadas em banho-maria a 37 ° C por 2-3 min, em seguida, um volume igual de inibidor de tripsina de soja é usado para interromper a atividade de tripsina. </li><li> A suspensão de células é suavemente pipetado cima e para baixo para garantir que a tripsina foi completamente inativada. </li><li> A suspensão celular é centrifugado a 700 rpm (110g) por 5 min. Então, o sobrenadante é removido e as células são ressuspendidas em 1 mL de meio de NSC completa. </li><li> 10 L da suspensão de células é misturado com 90 mL de azul de tripano para realizar uma contagem de células. </li><li> As células são banhados em uma concentração de 5x10 4 células / mL em meio NSC completo suplementado com 20ng / mL EGF em um frasco apropriado cultura dimensão do tecido. 5 mL médio é usado para T25, T75 para 20 mL e 40 mL para frascos T175. </li><li> Neurospheres secundário são formados em 5-7 dias, quando incubados a 37 ° C em uma incubadora umidificada com 5% de CO 2. </li></ol> 4. Resultados representativos: No ensino primário cultura NSC embrionárias, a maioria das células vai se tornar hipertrófica e anexar aos pratos de cultura de tecidos em placas. Embora a maioria das células vão morrer ou diferenciar, depois de 2-3 dias, as células proliferativas fazer pequenos aglomerados de células que irá separar a partir do substrato (Figura 1). Formação de grandes agregados esferoidais nas primeiras 48 horas de cultura não deve ser confundida com esferas primárias. Formação de agregados depende principalmente da quantidade de detritos e pedaços de tecido não-dissociada da cultura. Neurospheres verdadeiros são os fase brilhante e tornar-se mais esférico à medida que aumenta de tamanho (Figura 2). Microspikes pequena aparece na superfície externa das esferas viável e saudável (Figura 3). Depois de 5-7 dias, as esferas devem ser redondos, mas não compactado, e deve medir entre 150 e 200 m de diâmetro. Se neurospheres são permitidos a crescer muito grande (após 90-10 dias em cultura), eles podem formar agregados ou tornar-se de cor escura por causa da morte de células no centro das esferas (ver vídeo). Neurospheres grande poderia, eventualmente, começam a se diferenciar in situ (fixação ao substrato e migrando para a periferia). Também é difícil dissociar neurospheres grande e subcultura-los. <img src="/files/ftp_upload/2457/2457fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Primário E14 cultura NSC três dias após o plaqueamento. Setas mostram a proliferação de agrupamentos NSCs. Ampliação original; 20x <img src="/files/ftp_upload/2457/2457fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Primária E14 cultura NSC 7 dias após o plaqueamento. Ampliação original; 10x <img src="/files/ftp_upload/2457/2457fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Passage um E14 neurospheres cinco dias após o plaqueamento. Observe a picos de micro-(setas) na periferia das esferas. Ampliação original; 20x

<ol><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>Morshead, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+in+the+adult+mammalian+forebrain%3A+a+relatively+quiescent+subpopulation+of+subependymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells.</a> Neuron. 13, 1071-1082 (1994).</li>
<li>Craig, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+growth+factor+expansion+of+endogenous+subependymal+neural+precursor+cell+populations+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo growth factor expansion of endogenous subependymal neural precursor cell populations in the adult mouse brain.</a> J Neurosci. 16, 2649-2658 (1996).</li>
<li>Golmohammadi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+the+frequency+and+distribution+of+stem+and+progenitor+cells+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain.</a> Stem Cells. 26, 979-987 (2008).</li>
<li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., BA, R. eynolds <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+and+neurospheres--re-evaluating+the+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship.</a> Nat Methods. 2, 333-336 (2005).</li>
<li>Louis, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+neural+stem+and+progenitor+cells+in+the+neural+colony-forming+cell+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay.</a> Stem Cells. 26, 988-996 (2008).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O ensaio neurosphere é o método de escolha para o isolamento e expansão de células-tronco neurais 05/01 devido à sua simplicidade e reprodutibilidade. Este ensaio é uma ferramenta inestimável para a geração em larga escala de células indiferenciadas células do SNC precursor, o que poderia ser usado para ambos in vitro e in vivo. Deve ser enfatizado que neurospheres poderiam ser gerados a partir de ambos os bona fide células-tronco neurais e progenitores mais restrito. Portanto, o cálculo da ...

* Para fazer HEM, misture 110L pacote de MEM and160ml de HEPES 1M e obter um volume de 8,75 L com água destilada. Definir o pH final para 7,4 e armazená-lo a 4 ° C.

estabelecer embrionárias de rato cultura de células-tronco neurais utilizando o ensaio neurosphere

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

Em mamíferos, as células-tronco atua como uma fonte de células indiferenciadas para manter gênese ea renovação celular em diferentes tecidos e órgãos, durante o tempo de vida do animal. Eles podem potencialmente substituir as células que são perdidas no processo de envelhecimento ou em processo de lesão e doença. A existência de células-tronco neurais (NSCs) foi primeiramente descrita por Reynolds e Weiss (1992) no adulto sistema central de mamíferos nervoso central (SNC), utilizando um novo sistema de cultura sem soro, o ensaio neurosphere (NSA). Com este ensaio, também é possível isolar e ampliar NSCs de diferentes regiões do SNC embrionárias. Estes, NSCs vitro expandidas são multipotentes e podem dar origem aos três principais tipos de células do SNC. Enquanto a NSA parece relativamente simples de executar, atenção para os procedimentos demonstrado aqui é necessário para alcançar resultados confiáveis ​​e consistentes. Este vídeo demonstra praticamente NSA para gerar e expandir NSCs partir do dia 14 de embriões de rato-tecido cerebral e fornece detalhes técnicos para que se possa atingir culturas neurosphere reprodutível. O procedimento inclui a colheita E14 embriões de camundongos, microdissecção cérebro para colher as eminências ganglionares, a dissociação do tecido colhido em meio NSC para ganhar uma suspensão de células individuais, e, finalmente, cultivo de células em cultura NSA. Depois de 5-7 dias em cultura, o que resulta neurospheres primários são várias passagens para expandir ainda mais o número do NSCs para futuros experimentos.

Este protocolo de vídeo demonstra a aplicação do ensaio neurosphere para o isolamento e expansão de células-tronco neurais do eminências ganglionares do dia 14 de embriões de rato-cérebro.

Estabelecer embrionárias de rato Cultura de Células-tronco neurais utilizando o ensaio Neurosphere

Em mamíferos, as células-tronco atuam como uma fonte de células indiferenciadas para manter a gênese e a renovação celular em diferentes tecidos e órgãos ao longo da vida...

O objetivo deste protocolo em vídeo é isolar e expandir células-tronco neurais do cérebro de camundongo embrionário utilizando o ensaio de neuroesferas. O procedimento inclui a coleta de embriões de camundongo E14, seguida por microdissecação cerebral para obter as eminências ganglionares, dissociação do tecido coletado para obter uma suspensão de células únicas e, finalmente, o plaqueamento das células em cultura de neuroesferas. Olá, sou Hassan Ali do laboratório do Dr. Brent Frenzel, no Instituto Cerebral da Universidade da Flórida.Hoje vou mostrar como estabelecer um cultivo de neuroesferas a partir do cérebro de camundongo embrionário utilizando o ensaio de neuroesferas. Utilizamos rotineiramente este ensaio em nosso laboratório para isolar e expandir células-tronco neurais. Pronto, vamos começar.Anestesie uma camundonga prenhe acasalada no tempo determinado. No dia 14 de gestação, realize a dislocação cervical e lave o abdômen com etanol a 70%. Segure a pele sobre o abdômen usando pinças grandes e, em seguida, corte a pele e a fáscia subjacente com tesouras grandes.Para expor a cavidade abdominal e os cornos uterinos, remova os cornos uterinos contendo os embriões e transfira-os para um tubo cônico de 50 ml contendo hem frio. Após transferir os tecidos uterinos para a cabine de segurança biológica classe II, remova o hem do tubo de 50 ml e lave os tecidos com volume suficiente de hem fresco e frio para remover contaminantes como sangue e pelos, realizando duas a três lavagens dessa forma. Transfira os tecidos uterinos para uma placa de Petri de 10 centímetros contendo hem frio.Abra os cornos uterinos usando pin&ccedil;as curvas pequenas e tesoura e transfira os embri&otilde;es para um novo recipiente contendo hem frio. Repita este procedimento at&eacute; que todos os embri&otilde;es tenham sido coletados. Em seguida, coloque os embri&otilde;es sob o microsc&oacute;pio estereosc&oacute;pico.Seccione as cabeças dos embriões ao nível da medula espinhal cervical e transfira-as para outro recipiente de Petri contendo hem frio. Segure a cabeça com pinças curvas finas usando tesouras microcirúrgicas. Primeiro, faça um corte horizontal acima do nariz e, em seguida, continue cortando na linha média, da testa em direção à parte posterior da cabeça.Certifique-se de cortar a pele e o crânio sem danificar o cérebro subjacente. Remova o cérebro do crânio empurrando as bordas da seção cortada em movimento para trás, utilizando a pinça curva. Continue este procedimento até que todos os cérebros sejam removidos dos crânios.Segure o cérebro firmemente com a pinça curva de modo que o lado dorsal esteja voltado para cima e, com tesoura microcirúrgica, corte o córtex de cada hemisfério desde os bulbos olfatórios até a parte posterior do hemisfério. Para expor as eminências ganglionares, mantendo o cérebro fixo, dissecar toda a eminência ganglionar com pinça em ângulo de 45 graus e transferi-la para outro recipiente de Petri. A eminência ganglionar é claramente visível aqui, com suas partes medial e lateral.Alternativamente, você pode dissecar as eminências ganglionares removendo os tecidos circundantes usando pinças finas. Você também pode cortar toda a eminência em uma metade medial e lateral, caso tenha interesse em cultivar células de uma dessas regiões.Repita este procedimento até que todos os cérebros tenham sido microdissecados. Use um mililitro de meio de células-tronco neurais para coletar os fragmentos de tecido e transfira-os para um tubo cônico de 15 mililitros. Deixe os agregados de tecido sedimentarem no tubo de 15 mililitros para não deixar nenhum tecido para trás.Remova parte do meio sobrenadante e lave a base da placa de Petri para transferir qualquer tecido adicional para o tubo de 15 ml. Posicione a ponteira da pipeta contra o fundo do tubo. Pipete a suspensão para cima e para baixo de três a quatro vezes para dissociar o tecido, obtendo uma suspensão de células isoladas.Em seguida, deixe a suspensão repousar por um minuto para que os agregados não associados precipitem; transfira quase toda a suspensão celular para outro tubo de 15 ml. Em seguida, adicione um mililitro de meio de células-tronco neurais aos agregados remanescentes e dissocie-os em células individuais. Aspire o conteúdo dos tubos.Em seguida, centrifugue a suspensão a 700 RPM ou 110 G durante cinco minutos. Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em um mililitro de meio completo para células-tronco neurais. Retire 10 microlitros da suspensão celular e misture bem com 90 microlitros de azul de trian. Em seguida, retire 10 microlitros dessa suspensão e transfira para um hemocitômetro. Realize uma contagem celular. Transfira um volume total de 20 ml de meio completo para células-tronco neurais para um tubo cônico de 50 ml para semear um frasco T 80.Em seguida, misture a suspensão celular e adicione uma quantidade apropriada de células para uma densidade total de 200.000 células por mililitro ou 4 milhões de células por frasco T 80. Adicione EGF numa concentração final de 20 nanogramas por mililitro. Misture as células que estão no meio completo para células-tronco neurais com fator de crescimento e transfira a suspensão celular para frascos T 80.Rotule o frasco e examine as células ao microscópio para garantir que você tenha uma suspensão de células únicas sem agregados de tecido. Transfira o frasco para uma incubadora a 37 graus Celsius com 5%CO2 por cinco a sete dias. Após cinco a sete dias, avalie o frasco ao microscópio.Neste momento, neuroesferas já se formaram e devem ter entre 150 e 200 mícrons de diâmetro, estando prontas para serem subcultivadas. Colete o conteúdo do frasco em um tubo estéril de cultura de tecidos de tamanho apropriado, centrifugue o tubo e descarte o sobrenadante. Re-suspenda as esferas em um mililitro médio de tripsina pré-aquecida e coloque o tubo em banho-maria a 37 graus por dois minutos.Em seguida, adicione um volume igual de inibidor de tripsina e misture bem, mas suavemente, para interromper a atividade da tripsina. Centrifugue novamente e remova o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda as células em um mililitro de meio completo para células-tronco neurais e realize uma contagem celular conforme mencionado anteriormente. Para semear um frasco T175, transfira um total de 40 ml de meio completo para células-tronco neurais para um tubo cônico de 50 ml.Em seguida, misture as células e adicione uma quantidade apropriada de células para uma densidade total de 50.000 células por M ou 2 milhões de células por frasco T175. Em seguida, adicione EGF numa concentração final de 20 nanogramas por mililitro. Misture as células que estão no meio completo de células-tronco neurais com o fator de crescimento e transfira a suspensão celular para um frasco T175.Rotule o frasco e transfira-o para uma incubadora por cinco a sete dias. Este é um exemplo de cultura primária de células-tronco neurais E 14. Três dias após o plaqueamento, as setas indicam aglomerados de células-tronco neurais em proliferação.Você também pode observar células aderidas ao substrato e diferenciadas. Este é um exemplo de cultura primária de células-tronco neurais E 14 sete dias após o plaqueamento. Como é possível ver, há esferas de diversos tamanhos.Existem também células que estão diferenciadas. A quantidade de detritos é muito menor do que nas culturas de neuroesferas primárias de adultos. Além disso, as esferas não são compactas e apresentam microespinhos na periferia, indicando que estão saudáveis e viáveis.A esfera não deve ser permitida crescer demais, pois pode escurecer devido à morte celular no centro. Esferas grandes podem também aderir ao substrato e se diferenciar. Este é um exemplo de neuroesferas do Passe um E 14 cinco dias após o plaqueamento.Aqui novamente, é possível observar as microspículas na periferia das esferas. Acabamos de mostrar como cultivar neuroesferas a partir dos eminências ganglionares de camundongo E14 seguindo os mesmos procedimentos descritos aqui. Você também pode cultivar neuroesferas a partir de outras regiões do cérebro, como córtex e mesencéfalo.Obrigado por assistir e boa sorte com seus cultivos de neuroesferas.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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