Estabelecer embrionárias de rato Cultura de Células-tronco neurais utilizando o ensaio Neurosphere

O objetivo deste protocolo de vídeo é isolar e expandir as células-tronco neuro do cérebro embrionário de camundongos usando o ensaio neurosfera. O procedimento inclui a colheita de embriões de camundongos E 14, seguida de microdissecção cerebral para colher as eminências ganglionares, dissociação do tecido colhido para obter uma única suspensão celular e, finalmente, plaquear as células em cultura de neurosfera. Olá, sou Hassan Ali, do laboratório do Dr. Brent Frennels no Instituto do Cérebro de Ácaros da Universidade da Flórida.

Hoje vou mostrar como estabelecer uma cultura de neuroesferas a partir do cérebro embrionário de camundongos usando o ensaio de neurosesferas. Usamos rotineiramente este ensaio em nosso laboratório para isolar e expandir células-tronco neurais. Ok, vamos começar.

Anestesiar um rato grávida acasalado pelo tempo. No dia 14 de gestação, realize a luxação cervical e enxágue o abdômen com etanol a 70%. Segure a pele sobre o abdômen usando uma pinça grande e, em seguida, corte a pele e a fáscia subjacente com uma tesoura grande.

Para expor a cavidade abdominal e os cornos uterinos, remova os cornos uterinos que contêm os embriões e transfira-os para um tubo cônico de 50 ml contendo frio ele. Depois de transferir os tecidos uterinos para o capuz PC dois, remova a bainha do tubo de 50 ml e enxágue os tecidos com volume suficiente de bainha fria fresca para remover contaminantes como sangue e cabelo, faça duas a três lavagens como esta. Transfira os tecidos uterinos para uma placa de Petri de 10 centímetros contendo bainha fria.

Abra os chifres uterinos usando uma pequena pinça curva e uma tesoura e transfira os embriões para um novo prato contendo bainha fria. Repita este procedimento até que todos os embriões tenham sido colhidos. Em seguida, coloque os embriões sob o microscópio de dissecação.

Separe as cabeças dos embriões ao nível da medula espinhal cervical e transfira-os para outra placa de Petri contendo bainha fria. Segure a cabeça com uma pinça curva fina usando uma microtesoura. Primeiro, faça um corte horizontal acima do nariz e depois continue a cortar na linha média da testa em direção à parte de trás da cabeça.

Certifique-se de cortar a pele e o crânio e não danificar o cérebro subjacente. Remova o cérebro do crânio empurrando as bordas da seção cortada em um movimento para trás usando a pinça curva. Continue este procedimento até que todos os cérebros sejam removidos dos crânios.

Mantenha o cérebro firme usando a pinça curva de modo que o lado dorsal fique voltado para cima e, em seguida, usando uma microtesoura, corte o córtex de cada hemisfério, dos bulbos olfatórios até a parte de trás do hemisfério. Para expor as eminências ganglionares Segurando o cérebro no lugar, disseque toda a eminência ganglionar com uma pinça angular de 45 graus e transfira-a para outra placa de Petri. A eminência ganglionar é claramente mostrada aqui com suas partes medial e lateral.

Alternativamente, você pode dissecar as eminências ganglionares removendo os tecidos circundantes usando uma pinça fina. Você também pode cortar toda a eminência em uma metade medial e lateral. Se você estiver interessado em cultivar células de qualquer uma dessas regiões.

Repita este procedimento até que todos os cérebros tenham sido microsseccionados. Use um mililitro de meio de células-tronco neurais para coletar pedaços de tecido e transferi-los para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Deixe os aglomerados de tecido assentarem no tubo de 15 mililitros para não deixar nenhum tecido para trás.

Retirar um pouco do meio sobrenadante e lavar o fundo da placa de Petri para transferir qualquer tecido adicional para o tubo de 15 ml. Colocar a ponta da pipeta contra o fundo do tubo. Pipete a suspensão para cima e para baixo três a quatro vezes para quebrar o tecido, obtendo uma suspensão de célula única.

Em seguida, deixar a suspensão repousar durante um minuto, de modo a que os aglomerados não associados precipitem a transferência de quase toda a suspensão celular para outro tubo de 15 ml. Em seguida, adicione um mililitro de meio de células-tronco neuro aos aglomerados restantes e dissocie-os em células individuais. Puxe o conteúdo dos tubos.

Em seguida, centrifugar a suspensão a 700 rpm ou 110 g durante cinco minutos. Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em um mililitro de meio completo de células-tronco neuro. Pegue 10 microlitros da suspensão celular e misture bem com 90 microlitros de azul trian.

Em seguida, pegue 10 microlitros desta suspensão e transfira-a para um hemocitômetro. Execute uma contagem de células. Transferir um total de 20 ml de meio completo de células estaminais neurais para um cónico de 50 ml, a fim de formar um balão T 80 em placa.

Em seguida, misturar a suspensão celular e adicionar uma quantidade adequada de células para uma densidade total de 200 000 células por mililitro ou 4 milhões de células por balão T 80. Adicionar EGF a uma concentração final de 20 nanogramas por mililitro. Misture as células que estão em meio completo de células-tronco neurais com fator de crescimento e transfira a suspensão celular para um frasco T 80.

Rotule o frasco e observe as células ao microscópio para garantir que você tenha uma única suspensão celular sem aglomerados de tecido. Transfira o frasco para uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de CO2 por cinco a sete dias. Após cinco a sete dias, avaliar o balão ao microscópio.

A essa altura, as neuroesferas se formaram e devem ter entre 150 e 200 mícrons de diâmetro e estão prontas para serem subcultivadas. Recolher o conteúdo do balão num tubo de cultura de tecidos esterilizado de tamanho adequado, centrifugar o tubo e rejeitar o sobrenadante. Ressuspenda as esferas em um mililitro médio de tripsina pré-quente e coloque o tubo em banho-maria a 37 graus por dois minutos.

Em seguida, adicione um volume igual de inibidor de tripsina e misture bem, mas delicadamente, para interromper a atividade da tripsina Centrifugue novamente e remova o snat. Em seguida, ressuspenda as células em um mililitro de meio de células-tronco neurais completo e faça uma contagem de células conforme mencionado anteriormente. Para colocar um balão T 1 75, transferir um total de 40 ml de meio completo de células estaminais neurais para um tubo cónico de 50 ml.

Em seguida, misturar as células e adicionar uma quantidade adequada de células para uma densidade total de 50 000 células por M ou 2 milhões de células por balão T 1 75. Em seguida, adicione EGF a uma concentração final de 20 nanogramas por mil. Misturar as células que se encontram em meio de células estaminais neurais completo com factor de crescimento e transferir a suspensão celular para um balão T 1 75.

Rotular o balão e transferi-lo para uma incubadora durante cinco a sete dias. Este é um exemplo de cultura primária de células-tronco neurais E 14. Três dias após o revestimento, as setas mostram aglomerados proliferantes de células-tronco neurais.

Você também pode ver células que estão ligadas ao substrato e são diferenciadas. Este é um exemplo de cultura primária de células-tronco neuros E 14 sete dias após o plaqueamento. Como você pode ver, existem esferas de vários tamanhos.

Existem também células que são diferenciadas. A quantidade de detritos é muito menor do que a esfera neurológica adulta primária. Culturas. Além disso, as esferas não são compactadas e têm micro pontas ao redor da periferia, indicando que as esferas são saudáveis e viáveis.

A esfera não deve crescer muito, pois pode ficar escura devido à morte celular no centro. Esferas grandes também podem se ligar ao substrato e se diferenciar. Este é um exemplo de neuroesferas E 14 da Passagem um cinco dias após o plaqueamento.

Aqui, novamente, você pode ver os micro Spikes na periferia das esferas. Acabamos de mostrar como cultivar neuroesferas a partir de eminências ganglionares de camundongos E 14 seguindo os mesmos procedimentos descritos aqui. Você também pode cultivar neuroesferas de outras razões do cérebro, como córtex e mesencéfalo.

Obrigado por assistir e boa sorte com suas culturas neurosesferas.