Mutagênese e Funcional Protocolos de Seleção para a Evolução Dirigida de proteínas em E. coli

O objetivo geral deste procedimento é criar uma biblioteca de mutantes aleatórios para uma determinada sequência de DNA alvo e identificar e caracterizar rapidamente os mutantes usando seleção funcional semiquantitativa. Isso é feito primeiro transformando um plasmídeo com uma coli, uma origem de replicação contendo a sequência alvo na cepa mutante. Depois de plaquear e incubar as células durante a noite, elas são colhidas e o plasmídeo alvo é isolado para obter a biblioteca mutante, a biblioteca mutante é então transformada em uma cepa de leitura para caracterizar as mutações na segunda parte do protocolo, Uma placa de crescimento gradiente é construída e as culturas bacterianas da cepa de leitura são carregadas em uma placa de Petri separada contendo aer mole.

A etapa final do procedimento é carimbar a transferência dessas culturas bacterianas para o gradiente. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram mudanças no perfil fenotípico de uma determinada sequência-alvo por meio de diferenças no crescimento em um gradiente de drogas. Este vídeo apresenta um método para a evolução dirigida de proteínas em e coli.

Esse processo imita a evolução natural na geração de bibliotecas aleatórias de nutrientes, seguida por uma seleção que restringe essa diversidade. Assim, melhora nossa capacidade de gerar novas atividades bioquímicas para fins industriais ou biomédicos. Este procedimento tem dois componentes, a geração de biblioteca de mutantes aleatórios e a seleção funcional para obter mutações de ganho de função demonstrando que este procedimento será de Jennifer Allen, uma técnica do meu laboratório.

Antes do início deste protocolo, as células JS 200 eletrocompetentes expressando uma variante de baixa fidelidade da DNA polimerase um ou pólo de baixa fidelidade, que havia sido previamente preparada conforme descrito no protocolo escrito, essas células contêm um alelo sensível à temperatura do pólo um, de modo que a atividade do pólo um de baixa fidelidade predomina a 37 graus Celsius, construir. Um plasmídeo alvo contendo uma coli, uma origem de replicação com a sequência alvo clonada adjacente à origem da replicação, pólo de baixa fidelidade, um inicia coli, uma replicação de plasmídeo. Introduzindo assim mutações para iniciar a mutagênese.

Combine 40 microlitros de células eletrocompetentes e entre 30 a 250 nanogramas de DNA plasmático alvo em uma lacuna de dois milímetros. Pulso veterinário de eletroporação, a mistura no eletro a 1800 volts. Verificar a constante de tempo ou TC para assegurar condições de uniformização para cada amostra.

Idealmente, TC é igual a cinco a seis milissegundos. Deixe a mistura de DNA celular se recuperar em um mililitro de caldo LB por 40 minutos a 37 a Celsius, agitando a 250 RPM. Obtenha uma placa de Petri agro LV de 100 milímetros pré-aquecida a 37 graus Celsius contendo antibióticos apropriados para selecionar para ambas as placas de plasmídeos as células recuperadas em uma diluição apropriada para obter uma concentração próxima ao gramado, que é definida como um número distinto, mas incontável, de colônias, conforme mostrado neste exemplo.

Após a incubação durante a noite, colha as colônias bacterianas das placas de Petri com caldo LB. Isole o plasmídeo, o DNA das células colhidas, o plasmídeo resultante. O DNA constitui a biblioteca mutante aleatória.

Execute uma digestão de restrição cortando a biblioteca de plasmídeos com uma enzima de restrição que lineariza o plasmídeo alvo e o pólo. Um plasmídeo executa um gel aro analítico no DNA do plasmídeo isolado para confirmar a qualidade e a quantidade. Uma vez verificados os plasmídeos, digerir um micrograma da biblioteca com uma enzima de restrição que lineariza o plasmídeo do pólo um, mas não corta o plasmídeo alvo.

Após a conclusão do resumo de restrição, limpe a biblioteca usando um kit de purificação de DNA. Finalmente, transforme a biblioteca limpa em uma cepa de leitura para caracterizar as mutações. Para iniciar a preparação do gradiente, marque 10 pistas espaçadas uniformemente em uma borda da parte inferior da placa de Petri quadrada.

Coloque o prato em uma inclinação de forma que a borda inferior marcada seja elevada sete milímetros. Despeje 25 mililitros de ágar lb quente bem misturado com uma concentração apropriada do agente de seleção no prato inclinado. Esta é a camada inferior do gradiente.

Certifique-se de que o ágar LB cubra a placa de Petri de forma que a extremidade marcada elevada da placa contenha aproximadamente um milímetro de ágar LB e a parte abaixada contenha cerca de oito milímetros. Cubra a placa com a tampa KU para ventilação e deixe o agri endurecer por 10 a 15 minutos. Depois que a camada inferior do ágar LB endurecer, mova o prato para uma superfície plana.

Em seguida, despeje 25 mililitros de ágar lb quente sem o agente de seleção para cobrir a primeira superfície agrícola, certificando-se de cobrir toda a camada inferior. Cubra a placa com a tampa KU para ventilação e, em seguida, deixe o agri endurecer por 10 a 15 minutos para realizar a transferência de bactérias do carimbo. Primeiro, obtenha culturas bacterianas da cepa de leitura e dilua-as para ter densidades celulares idênticas com uma densidade óptica de 600 nanômetros inferior a 1,0.

Em seguida, transfira dois mililitros de ágar líquido macio equilibrado a 42 graus Celsius para o fundo de uma placa de Petri redonda de 100 milímetros, pipete 40 microlitros da cultura bacteriana para o mais macio e misture balançando a placa. Cubra a borda longa da lâmina do microscópio de vidro com a mistura mais macia. Em seguida, alinhe a borda revestida do slide com a marca inferior no prato gradiente.

Toque a corrediça na superfície do ágar. Um toque suave é suficiente para transferir uma fita do ágar macio para a superfície gradiente. A lâmina é então reservada para limpeza e reutilização.

Repita este processo. As amostras restantes, controles experimentais devem ser incluídos em cada prato gradiente. Se vários gradientes estiverem sendo executados, incube o prato gradiente de cima para baixo durante a noite a 37 graus Celsius vezes e as temperaturas de incubação podem diferir para diferentes cepas bacterianas de leitura, mas durante a noite a 37 graus Celsius é normalmente suficiente para o crescimento visível.

Por fim, crie imagens e analise o crescimento celular conforme descrito no protocolo escrito. Mostrado. Aqui estão as imagens de uma cepa de leitura transformada com PGF UV não silenciado ou uma biblioteca mutante PG FPUV que foram realizadas. Quatro rodadas de mutagênese colônias escuras ou fracas indicam plasmídeo contendo mutações inativadoras de GFP.

Esta figura representa a frequência de mutações ao longo da sequência neutra do plasmídeo alvo em intervalos de 100 pares de bases. Observe que as mutações ocorrem em toda a sequência de plasmídeos, mas na frequência mais alta mais próxima da origem da replicação. Aqui, o crescimento de mutantes é mostrado contra um gradiente de drogas.

A distância cultivada em direção ao topo do gradiente indica perfil diferencial de resistência a drogas entre os mutantes. Neste exemplo, bibliotecas de plasmídeos da desmetilase oxidativa humana ABH dois foram rastreadas para mutantes com resistência aumentada ao metilmetano sulfonato usando gradientes de seleção de drogas. Dois. Tais bibliotecas que representam duas e quatro iterações do protocolo de mutagênese são mostradas em comparação com o tipo selvagem parental e o vetor vazio.

A linha branca denota o limite acima do qual as colônias mutantes individuais foram isoladas. Para análise fenotípica posterior, os mutantes beta-lactamase, R 1 64 H e E 1 0 4 KR 1 64 HG 2 67 R previamente identificados usando mutagênese P um de baixa fidelidade e seleção astri e m são mostrados em 0,4 micrograma por mililitro e quatro microgramas por mililitro. A proteção do gradiente de cefotaxima contra a cefotaxima é indicativa da atividade da betalactamase de espectro estendido.

Observe que a enzima beta-lactamase do tipo selvagem não confere proteção em relação às células que expressam um vetor vazio. Portanto, esses mutantes representam a adaptação ou a evolução de uma nova atividade bioquímica. Aqui apresentamos uma poderosa combinação de mutagênese e seleção funcional para esta geração de novas atividades bioquímicas.

Uma seleção funcional pode ser obtida por meio da seleção de medicamentos ou por meio da complementação genética, e capitaliza nossa capacidade de gerar grande diversidade genética. A patogênese pode ter que ser restrita a uma determinada sequência para otimizar as atividades proteicas preexistentes ou para a patogênese direcionada ao local. Isso pode ser feito facilmente por clonagem.

Além disso, a mutagênese pode ser dissociada de uma seleção funcional para obter ataques de assinatura ou pegadas mutacionais.