Mapeamento bacterianas redes funcionais e vias Escherichia Coli Usando sintéticos matrizes genéticas

O objetivo deste procedimento é investigar as relações funcionais entre genes bacterianos e vias. Isso é feito primeiro preparando uma matriz de ceia coli, cepas mutantes únicas que serão conjugadas ou acasaladas. O segundo passo é conjugar os mutantes únicos em um formato de matriz em placas.

Em seguida, os mutantes duplos são selecionados. A etapa final é obter imagens das placas mutantes duplas e quantizar as colônias mutantes duplas para determinar a aptidão da cepa. Por fim, os dados de tamanho da colônia são analisados para calcular os escores de interação genética e identificar genes, vias e processos que interagem funcionalmente.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a mutagênese aleatória, é que muitas cepas mutantes duplas individuais podem ser criadas. Além disso, as interações entre muitos genes podem ser avaliadas simultaneamente, independentemente do tamanho do gene, essencialidade ou aptidão mutante de um único gene. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia de sistemas, como aquelas relacionadas às funções gênicas e à interferência funcional entre vias e processos.

As implicações desta técnica se estendem à terapia de infecções bacterianas porque o conhecimento sobre a maioria dos genes e processos funcionalmente centrais, bem como a compreensão de quais combinações de genes, vias e processos bacterianos quando perturbados melhoram ou reduzem a aptidão bacteriana ajudará a desenvolver as estratégias de intervenção mais eficazes Para iniciar este protocolo. Aninhado em duas etapas. A amplificação por PCR é empregada para substituir o quadro de leitura aberto alvo por um marcador de resistência ao cloranfenicol do plasmídeo PKD três, conforme descrito no procedimento escrito.

Confirme o produto esperado e a PCR purifique o fragmento obtido seguindo o protocolo do fabricante. Após eluição, o produto de PCR em 30 microlitros de água destilada estéril, diluir para aproximadamente 50 miligramas por concentração de microlitro. O produto purificado é armazenado a menos 20 graus Celsius antes da transformação.

Em seguida, prepare a alta frequência de recombinação ou células competentes HFR Caval para a construção do doador. Primeiro, inocular um mililitro de uma cultura saturada durante a noite da cepa HFR Cavalli em 70 mililitros de meio LB fresco com 35 microlitros de 50 miligramas por mililitro. Ampicilina em balão de 250 mililitros.

Incubar a cultura a 32 graus Celsius agitando suavemente a 220 RPM até obter uma densidade óptica de cerca de 0,5 a 0,6. Em seguida, transfira a cultura para um banho-maria para indução de calor do sistema Lambda Red Recombination a 42 graus Celsius por 15 minutos com agitação a 160 RPM para interromper a indução. Transfira a cultura para um banho-maria gelada por 10 a 20 minutos a 160 RPM.

Certifique-se de manter as células frias até depois da transformação. Após a lavagem e colheita das células por centrifugação, conforme descrito no protocolo escrito, decantar o sene e ressuspender o pellet em 500 microlitros de gelado, 10% de glicerol Eloqua. As células em volumes de 50 microlitros em tubos microcêntricos individuais pré-resfriados de 1,5 mililitro e imediatamente procedem à transformação.

Adicione 100 nanogramas de deleção de genes purificados, às células competentes. Agite o tubo e deixe a suspensão descansar no gelo por cinco minutos. Em seguida, transfira a suspensão para um eletroporation vete electro pré-resfriado, opere a mistura de células imediatamente.

Adicione um mililitro de meio SOC à temperatura ambiente e transfira as células eletroporosas em meio para um tubo de cultura de 15 mililitros. Incube as células a 32 graus Celsius por uma hora com agitação orbital a 220 RPM. Após a incubação, centrifugue as células de 4.400 vezes G por cinco minutos.

À temperatura ambiente, remova aproximadamente 850 microlitros do supinato e suspenda novamente o pellet celular no líquido restante. Espalhe as células em placas LB contendo 17 microgramas por mililitro, cloranfenicol e incube a 32 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, risque dois transformantes individuais em placas de cloranfenicol LB para confirmação de mutantes, risque os mesmos transformantes em placas de micina LB para confirmar que as cepas não são resistentes à micina.

Em seguida, o DNA é amplificado com três conjuntos diferentes de primers de confirmação de nocaute, conforme descrito no protocolo escrito. O primeiro conjunto de primers consiste em um primer frontal de 20 nucleotídeos localizado 200 pares de bases a montante da região alvo e um primer reverso, que é complementar ao de resistência ao cloranfenicol. Espera-se que essa amplificação produza um amplicon de 445 nucleotídeos.

O segundo conjunto inclui um primer para frente, um ajoelhado na sequência de de resistência ao cloranfenicol e um primer de confirmação de flanco reverso, que é projetado para atirar 200 pares de bases a jusante das três extremidades primárias do gene excluído. Espera-se que essa reação de amplificação produza um amplicon de 309 nucleotídeos. A terceira PCR contém primers flanqueadores a montante e a jusante.

Esta reação é necessária para confirmar que a cepa selecionada não é um diplóide da medula com um locus de gene tendo sido substituído pelo e outro duplicado, mas de outra forma uma cópia do gene do tipo selvagem ainda presente. Espera-se que essa amplificação produza um produto de 1,4 KB. A coleção de mutantes de deleção de genes não essenciais e não essenciais é replicada roboticamente para 24 384.

Bem, microplaca contendo 80 microlitros de meio LB líquido por poço. Suplementado com 50 microgramas por mililitro de lata de micina para abrir espaço para a cepa de controle de borda, que faltava como controle positivo e auxiliava nas normalizações das placas, bem como na quantização automatizada de colônias. Retirar o meio inoculado dos alvéolos mais exteriores de cada placa e transferi-lo para novas placas, deixando os alvéolos mais exteriores vazios.

Da mesma forma, crie pontos de controle negativo, removendo quaisquer duas cepas de um local diferente dentro de cada placa e transferindo as cepas para uma nova placa. Em seguida, encha os poços vazios, incluindo os poços de controle de borda e os poços de controle negativo com meio LV contendo 17 microgramas por mililitro de cloranfenicol. Espera-se que esses pontos de controle negativo estejam vazios no receptor e, portanto, placas duplas mutantes.

Eles servem para garantir que não haja erros de processamento ou manuseio de chapas ao numerar imagens ou fixar as chapas. Depois de preparar a cepa positiva de borda conforme descrito no procedimento escrito, as cepas de matriz, bem como a cepa positiva de borda, são cultivadas durante a noite a 32 graus Celsius com agitação orbital de 190 RPM no dia seguinte, encha os poços de borda com aproximadamente 80 microlitros da cultura noturna. As placas montadas podem ser usadas para acoplamento conforme descrito na próxima seção.

Alternativamente, para armazenamento de longo prazo, cada poço nas placas receptoras é suplementado com 15% de glicerol e a mídia e o glicerol são misturados. As placas são então armazenadas a 80 graus Celsius negativos. Comece o procedimento de acasalamento cultivando a cepa doadora HFR, com a deleção do gene de consulta marcada com de resistência ao cloranfenicol durante a noite a 32 graus Celsius em meio líquido LB rico com 17 microgramas por mililitro de pino de cloranfenicol.

O TH ordenou a coleta de mutantes do receptor em 3 84 densidade de colônia em placas LB sólidas. Suplementado com 50 microgramas por mililitro de lata de micina. Em paralelo, fixe a cepa mutante de consulta do doador em 3 84 densidade de colônia no mesmo número de placas LB.

Suplementado com 17 microgramas por mililitro de cloranfenicol. Incube as placas durante a noite a 32 graus Celsius para conjugar as cepas. Prenda o doador das placas doadoras de 3 84 colônias durante a noite em placas LB sólidas.

Em seguida, fixe as cepas de uma única placa receptora de 3 84 colônias durante a noite sobre os doadores recém-fixados. Incube as placas de conjugação fixadas a 32 graus Celsius por 16 a 24 horas. Em seguida, fixe cada placa de conjugação de densidade 384 em uma única placa LB sólida contendo cloranfenicol.

E a micina pode repetir esse processo até que todas as placas de conjugação tenham sido fixadas? Incube as primeiras placas de seleção recém-fixadas por 16 a 36 horas a 32 graus Celsius. Após a incubação, fixe novamente cada primeira placa de seleção em uma segunda placa dupla de seleção de medicamentos no formato 1536 SPOT para que cada primeira colônia de seleção seja representada por quatro colônias.

Na segunda placa de seleção, incubar as placas por 16 a 36 horas. A 32 graus, fotografe as placas finais de seleção de mutantes duplos para medir quantitativamente a aptidão de crescimento dos mutantes e analisar as interações entre os pares de genes. Como os genes na mesma via exibem padrões gastrointestinais intimamente correlacionados, os genes funcionalmente relacionados podem ser agrupados agrupando-os de acordo com a semelhança geral de seus perfis de pontuação S.

A similaridade do perfil gastrointestinal representa a congruência dos fenótipos após a mutação de dois genes e deve ser indicativa de se os dois genes atuam na mesma via ou na via sobreposta. Aqui é mostrada a distribuição dos coeficientes de correlação entre os perfis GI de pares de genes que codificam proteínas que interagem fisicamente versus pares de genes desenhados aleatoriamente. Um exemplo de um gráfico de dispersão de perfis genéticos correlacionados para dois transportadores que formam um complexo heterotrimérico necessário para a excreção de espermatozóides é mostrado como com a exibição do gene ecoline de levedura.

Aliviar as interações com perfis gastrointestinais altamente correlacionados tende a codificar vias que estão fisicamente associadas ou que atuam de forma coerente em uma via bioquímica comum. Aqui é mostrado um exemplo representativo onde os componentes das vias de biossíntese de enxofre de ferro ISC e SUF funcionalmente redundantes, que participam conjuntamente de um processo essencial, formam clusters distintos que estão ligados entre si por extensas interações agravantes. Uma medida estatística pode ser usada para encontrar qualquer enriquecimento significativo para interações entre combinações específicas de vias, integração de redes GI com interações físicas e outros dados de associação funcional, como contexto genômico.

Os relacionamentos podem revelar a organização de módulos funcionais de ordem superior que definem os principais sistemas biológicos das bactérias. A análise de cluster também pode ser aplicada a redes GI para prever as funções de genes anotados. Como os algoritmos de agrupamento variam.

No entanto, atribuições funcionais putativas determinadas por meio de agrupamento requerem verificação experimental independente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de incluir todos os aspectos positivos e negativos necessários após este procedimento. Outros métodos, como proteômica, experimentos de acompanhamento bioquímico e genômica química, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre funções genéticas específicas, bem como a natureza das relações funcionais entre genes e vias.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como construir cepas mutantes duplas, montar matrizes de receptores e realizar telas ESGA para investigar as relações funcionais entre genes e processos em e coli.