Mapeamento bacterianas redes funcionais e vias

O objetivo deste procedimento é investigar as relações funcionais entre genes e vias bacterianas. Isso é realizado primeiramente preparando arranjos de ceia coli, cepas mutantes simples que serão conjugadas ou acasaladas. O segundo passo é realizar a conjugação dos mutantes simples em formato de arranjo em placas.

Em seguida, selecionam-se os mutantes duplos. O passo final é imaginar as placas de mutantes duplos e quantificar as colônias de mutantes duplos para determinar a aptidão da linhagem. Em última análise, os dados de tamanho das colônias são analisados para calcular escores de interação genética e identificar genes, vias e processos funcionalmente interativos.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a mutagênese aleatória, é que muitas cepas duplas mutantes individuais podem ser criadas. Além disso, as interações entre muitos genes podem ser avaliadas simultaneamente, independentemente do tamanho do gene, essencialidade ou aptidão do mutante de gene único. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de biologia de sistemas, como aquelas relacionadas às funções gênicas e à conversa funcional entre vias e processos.

As implicações dessa técnica estendem-se à terapia de infecções bacterianas, pois o conhecimento sobre os genes e processos funcionalmente mais centrais, bem como a compreensão de quais combinações de genes, vias e processos bacterianos, quando perturbados, melhoram ou reduzem a aptidão bacteriana, ajudarão no desenvolvimento das estratégias de intervenção mais eficazes. Para iniciar este protocolo, utiliza-se a amplificação por PCR aninhada em duas etapas para substituir o quadro de leitura aberto alvo por um marcador de resistência à cloranfenicol proveniente do plasmídeo PKD3, conforme descrito no procedimento escrito.

Confirme o produto esperado e purifique o fragmento obtido por PCR seguindo o protocolo do fabricante. Após eluir o produto de PCR em 30 microlitros de água destilada estéril, dilua para uma concentração aproximada de 50 miligramas por microlitro. O produto purificado é armazenado a menos 20 graus Celsius antes da transformação.

Em seguida, prepare as células competentes de alta frequência de recombinação ou HFR Caval para a construção do doador. Primeiro, inocular um mililitro de uma cultura saturada de crescimento noturno da linhagem HFR Cavalli em 70 mililitros de meio LB fresco com 35 microlitros de ampicilina a 50 miligramas por mililitro em um frasco de 250 mililitros.

Incube a cultura a 32 graus Celsius sob agitação suave a 220 RPM até atingir uma densidade óptica de aproximadamente 0,5 a 0,6. Em seguida, transfira a cultura para um banho-maria para indução térmica do sistema de Recombinação Lambda Red a 42 graus Celsius por 15 minutos com agitação a 160 RPM para interromper a indução. Transfira a cultura para um banho de água gelada com gelo por 10 a 20 minutos a 160 RPM.

Certifique-se de manter as células frias até após a transformação. Após lavar e colher as células por centrifugação conforme descrito no protocolo escrito, despreze o sobrenadante e re-suspenda o pellet em 500 microlitros de Eloqua gelado contendo 10% de glicerol. Distribua as células em volumes de 50 microlitros em tubos microcentrífugos de 1,5 mililitro previamente resfriados e prossiga imediatamente para a transformação.

Adicione 100 nanogramas do cassete de deleção gênica purificado às células competentes. Agite suavemente o tubo e deixe a suspensão em gelo por cinco minutos. Em seguida, transfira a suspensão para um eletroporador previamente resfriado e realize imediatamente a eletroporação da mistura celular.

Adicione um mililitro de meio SOC à temperatura ambiente e transfira as células eletroporadas em meio para um tubo de cultura de 15 mililitros. Incube as células a 32 graus Celsius por uma hora com agitação orbital a 220 rpm. Após a incubação, centrifugue as células a 4.400 × g por cinco minutos.

À temperatura ambiente, remova aproximadamente 850 microlitros do sobrenadante e re-suspenda o pellet celular no líquido restante. Espalhe as células em placas de LB contendo 17 microgramas por mililitro de cloranfenicol e incube a 32 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, faça estrias de dois transformantes individuais em placas de LB com cloranfenicol para confirmação do mutante; faça também estrias dos mesmos transformantes em placas de LB com canamicina para confirmar que as linhagens não são resistentes à canamicina.

Em seguida, o DNA é amplificado com três conjuntos diferentes de primers de confirmação de interrupção gênica conforme descrito no protocolo escrito. O primeiro conjunto de primers consiste em um primer direto de 20 nucleotídeos localizado 200 pares de bases a montante da região alvo e um primer reverso, complementar ao cassete de resistência à cloranfenicol. Espera-se que essa amplificação produza um amplicon de 445 nucleotídeos.

O segundo conjunto inclui uma primer direta, voltada para a sequência do cassete de resistência à cloranfenicol, e uma primer reversa de confirmação a montante, projetada para 200 pares de bases a jusante da extremidade três prime do gene deletado. Espera-se que esta reação de amplificação produza um amplicon de 309 nucleotídeos. A terceira PCR contém ambas as primers a montante e a jusante.

Essa reação é necessária para confirmar que a linhagem selecionada não é um diploide medular com um lócus gênico tendo sido substituído pelo cassete e outra cópia gênica duplicada, mas ainda presente e de tipo selvagem. Espera-se que essa amplificação produza um produto de 1,4 KB. A coleção de mutantes com deleção única de gene não essencial em e coli ke io é replicada por pino robótico para 24 384.

Bem, microplaca contendo 80 microlitros de meio LB líquido por poço. Suplementado com 50 microgramas por mililitro de canamicina para acomodar a cepa de controle de borda, que foi utilizada como controle positivo e auxiliou na normalização da placa, bem como na quantificação automatizada de colônias. Remova o meio inoculado dos poços mais externos de cada placa e transfira-o para novas placas, deixando os poços mais externos vazios.

Da mesma forma, crie pontos de controle negativo removendo quaisquer duas cepas de uma localização diferente dentro de cada placa e transferindo as cepas para uma nova placa. Em seguida, preencha os poços vazios, incluindo os poços de controle de borda e os poços de controle negativo, com meio LV contendo 17 microgramas por mililitro de cloranfenicol. Espera-se que esses pontos de controle negativo estejam vazios no receptor e, portanto, nas placas de mutante duplo.

Eles servem para garantir que não houve erros de processamento ou manipulação das placas durante a numeração, a obtenção de imagens ou o pinning das placas. Após o preparo da cepa positiva da borda conforme descrito no procedimento escrito, as cepas do arranjo, bem como a cepa positiva da borda, são cultivadas durante a noite a 32 graus Celsius com agitação orbital de 190 RPM; no dia seguinte, preencha os poços da borda com aproximadamente 80 microlitros da cultura de crescimento noturno. As placas montadas podem ser utilizadas para cruzamento conforme descrito na próxima seção.

Alternativamente, para armazenamento de longo prazo, cada poço nas placas receptoras é suplementado com glicerol a 15% e o meio e o glicerol são misturados. As placas são então armazenadas a menos 80 graus Celsius. Inicie o procedimento de conjugação cultivando a linhagem doadora HFR, portadora da deleção do gene de interesse marcada com o cassete de resistência à cloranfenicol, durante a noite a 32 graus Celsius em meio líquido LB rico contendo 17 microgramas por mililitro de cloranfenicol.

O conjunto de mutantes receptores ordenados por TH foi disposto em densidade de 3 colônias por placa de 84 colônias em placas sólidas de LB, suplementadas com 50 microgramas por mililitro de canamicina. Paralelamente, o mutante doador da cepa interrogada foi pinado em densidade de 3 colônias por placa de 84 colônias no mesmo número de placas de LB.

Suplementado com 17 microgramas por mililitro de cloranfenicol. Incube as placas durante a noite a 32 graus Celsius para conjugação das cepas. Pinote o doador a partir das placas doadoras de 84 colônias durante a noite em placas de LB sólido.

Em seguida, plaque as cepas de uma única placa receptora de colônias 384 de cultivo noturno sobre os doadores recém-plaqueados. Incube as placas de conjugação plaqueadas a 32 graus Celsius por 16 a 24 horas. Em seguida, plaque cada placa de conjugação em densidade 384 em uma única placa sólida de LB contendo cloranfenicol.

E pode a micina repetir esse processo até que todas as placas de conjugação tenham sido pinadas? Incube as placas da primeira seleção recém-pinadas por 16 a 36 horas a 32 graus Celsius. Após a incubação, repine cada placa da primeira seleção em uma segunda placa de seleção dupla com drogas no formato 1536 SPOT, de modo que cada colônia da primeira seleção seja representada por quatro colônias.

No segundo placa de seleção, incubar as placas por 16 a 36 horas. A 32 graus oss fotografar as placas finais de seleção de duplo mutante para medir quantitativamente a aptidão de crescimento dos mutantes e analisar as interações entre pares de genes. Como genes na mesma via exibem padrões de IG estreitamente correlacionados, genes funcionalmente relacionados podem ser agrupados por meio de agrupamento segundo a similaridade geral dos seus perfis de escores S.

A similaridade do perfil GI representa a congruência dos fenótipos após a mutação de dois genes e deve indicar se os dois genes atuam na mesma via ou em vias sobrepostas. É mostrada aqui a distribuição dos coeficientes de correlação entre os perfis GI de pares de genes que codificam proteínas que interagem fisicamente versus pares de genes escolhidos aleatoriamente. Um exemplo de um gráfico de dispersão de perfis genéticos correlacionados para dois transportadores que formam um complexo heterotrimerizado necessário para a excreção de espermatozoides é apresentado, assim como um gene de levedura da linhagem ecoline.

Interações atenuantes com perfis de GI altamente correlacionados tendem a codificar vias que estão fisicamente associadas ou que atuam de forma coerente em uma mesma via bioquímica comum. Aqui é apresentado um exemplo representativo no qual os componentes das vias funcionalmente redundantes de biossíntese de enxofre-ferro ISC e SUF, que participam conjuntamente em um processo essencial, formam agrupamentos distintos que são ligados entre si por extensas interações agravantes. Uma medida estatística pode ser utilizada para identificar qualquer enriquecimento significativo de interações entre combinações específicas de vias, integrando redes de GI com interações físicas e outros dados de associação funcional, como contexto genômico.

As relações podem revelar a organização de módulos funcionais de ordem superior que definem sistemas biológicos centrais em bactérias. A análise de agrupamento também pode ser aplicada a redes GI para prever as funções de genes anotados. Como os algoritmos de agrupamento variam.

No entanto, atribuições funcionais putativas determinadas por meio de agrupamento exigem verificação experimental independente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de incluir todos os controles positivos e negativos necessários. Outros métodos, como proteômica, experimentos complementares bioquímicos e genômica química, podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre funções gênicas específicas, bem como sobre a natureza das relações funcionais entre genes e vias metabólicas.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como construir linhagens duplo-mutantes, montar arranjos de receptores e realizar telas ESGA para investigar as relações funcionais entre genes e processos em *E. coli*.