Name: Mapeamento bacterianas redes funcionais e vias Escherichia Coli Usando sintéticos matrizes genéticas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 6 s
Description: Aprenda a mapear redes funcionais e vias em Escherichia coli usando matrizes genéticas sintéticas eSGA. Este método permite investigar interações genéticas e relações epistáticas em alta escala.

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Este trabalho foi financiado por fundos do Genome Canada, o Instituto Ontário Genomics, e os Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde de bolsas para JG e AG AE é um receptor de Vanier de Bolsas de Pós-Graduação no Canadá.

<ol><li>Bandyopadhyay, S., Kelley, R., Krogan, N. J., Ideker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+maps+of+protein+complexes+from+quantitative+genetic+interaction+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional maps of protein complexes from quantitative genetic interaction data.</a> PLoS Comput. Biol. 4, e1000065(2008).</li>
<li>Costanzo, M., Baryshnikova, A., Myers, C. L., Andrews, B., Boone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charting+the+genetic+interaction+map+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Charting the genetic interaction map of a cell.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22, 66-74 (2011).</li>
<li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+landscape+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327, 425-4231 (2010).</li>
<li>Fiedler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+the+S.+cerevisiae+phosphorylation+network%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional organization of the S. cerevisiae phosphorylation network.</a> Cell. 136, 952-963 (2009).</li>
<li>Roguev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+and+rewiring+of+functional+modules+revealed+by+an+epistasis+map+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conservation and rewiring of functional modules revealed by an epistasis map in fission yeast.</a> Science. 322, 405-4010 (2008).</li>
<li>Schuldiner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+the+function+and+organization+of+the+yeast+early+secretory+pathway+through+an+epistatic+miniarray+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile.</a> Cell. 123, 507-519 (2005).</li>
<li>Wilmes, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+interaction+map+of+RNA-processing+factors+reveals+links+between+Sem1%2FDss1-containing+complexes+and+mRNA+export+and+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">A genetic interaction map of RNA-processing factors reveals links between Sem1/Dss1-containing complexes and mRNA export and splicing.</a> Mol. Cell. 32, 735-746 (2008).</li>
<li>Babu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems-level+approaches+for+identifying+and+analyzing+genetic+interaction+networks+in+Escherichia+coli+and+extensions+to+other+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Systems-level approaches for identifying and analyzing genetic interaction networks in Escherichia coli and extensions to other prokaryotes.</a> Mol. Biosyst. 12, 1439-1455 (2009).</li>
<li>Butland, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((coli+synthetic+genetic+array+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">coli synthetic genetic array analysis.</a> Nat. Methods. 5, 789-7895 (2008).</li>
<li>Typas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+peptidoglycan+synthesis+by+outer-membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of peptidoglycan synthesis by outer-membrane proteins.</a> Cell. 143, 1097-10109 (2010).</li>
<li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+the+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Mol. Syst. Biol. 2, 2006-200008 (2006).</li>
<li>Babu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+interaction+maps+in+Escherichia+coli+reveal+functional+crosstalk+among+cell+envelope+biogenesis+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic interaction maps in Escherichia coli reveal functional crosstalk among cell envelope biogenesis pathways.</a> PLoS Genet. 7, e1002377(2011).</li>
<li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+landscape+of+a+bacterial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phenotypic landscape of a bacterial cell.</a> Cell. 144, 143-156 (2011).</li>
<li>Babu, M., Gagarinova, A., Greenblatt, J., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array-based+synthetic+genetic+screens+to+map+bacterial+pathways+and+functional+networks+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Array-based synthetic genetic screens to map bacterial pathways and functional networks in Escherichia coli.</a> Methods Mol Biol. 765, 125-153 (2011).</li>
<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-665 (2000).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+recombination+system+for+chromosome+engineering+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5978-5983 (2000).</li>
<li>Typas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((quantitative+analyses+of+genetic+interactions+in%5BTitle%5D)+AND+%22E.+coli.+Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">quantitative analyses of genetic interactions in.</a> E. coli. Nat. Methods. 5, 781-787 (2008).</li>
<li>Zeghouf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+Peptide+Affinity+%28SPA%29+system+for+the+identification+of+mammalian+and+bacterial+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Sequential Peptide Affinity (SPA) system for the identification of mammalian and bacterial protein complexes.</a> J. Proteome Res. 3, 463-468 (2004).</li>
<li>Davierwala, A. P., et al. , 1147-1152 (2005).</li>
<li>Breslow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+strategy+enabling+high-resolution+functional+analysis+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome.</a> Nat. Methods. 5, 711-718 (2008).</li>
<li>Babu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+peptide+affinity+purification+system+for+the+systematic+isolation+and+identification+of+protein+complexes+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sequential peptide affinity purification system for the systematic isolation and identification of protein complexes from Escherichia coli.</a> Methods Mol. Biol. 564, 373-400 (2009).</li>
<li>Butland, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+network+containing+conserved+and+essential+protein+complexes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli.</a> Nature. 433, 531-537 (2005).</li>
<li>Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+functional+atlas+of+Escherichia+coli+encompassing+previously+uncharacterized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins.</a> PLoS Biol. 7, (2009).</li>
<li>Anderson, R. P., Roth, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+genetic+duplications+in+phage+and+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Tandem genetic duplications in phage and bacteria.</a> Annu. Rev. Microbiol. 31, 473-505 (1977).</li>
<li>Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+genetic+interactions+and+networks+with+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Exploring genetic interactions and networks with yeast.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 437-449 (2007).</li>
<li>Collins, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+dissection+of+protein+complexes+involved+in+yeast+chromosome+biology+using+a+genetic+interaction+map%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional dissection of protein complexes involved in yeast chromosome biology using a genetic interaction map.</a> Nature. 446, 806-8010 (2007).</li>
<li>Le Meur, N., Gentleman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+synthetic+lethality%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Modeling synthetic lethality.</a> Genome Biol. 9, R135(2008).</li>
<li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li>
<li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+mapping+of+the+yeast+genetic+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global mapping of the yeast genetic interaction network.</a> Science. 303, 808-813 (2004).</li>
<li>Wong, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+biological+networks+to+predict+genetic+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Combining biological networks to predict genetic interactions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 15682-15687 (2004).</li>
<li>van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn-seq%3A+high-throughput+parallel+sequencing+for+fitness+and+genetic+interaction+studies+in+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms.</a> Nat. Methods. 6, 767-772 (2009).</li>
<li>Gagarinova, A., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+genetic+manipulation+methods+for+exploring+bacterial+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Genome-scale genetic manipulation methods for exploring bacterial molecular biology.</a> Mol. Biosyst. 8, 1626-1638 (2012).</li>
<li>Dewey, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+orthology%3A+putting+genomic+evolutionary+relationships+into+context%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Positional orthology: putting genomic evolutionary relationships into context.</a> Brief Bioinform. 12, 401-412 (2011).</li>
<li>St Onge, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+pathway+analysis+using+high-resolution+fitness+profiling+of+combinatorial+gene+deletions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Systematic pathway analysis using high-resolution fitness profiling of combinatorial gene deletions.</a> Nat. Genet. 39, 199-206 (2007).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Temos delineado um protocolo passo a passo para a utilização de triagem eSGA robótico para investigar funções de genes bacterianos em um nível caminho interrogando GI. Esta abordagem pode ser usada para estudar os genes individuais, bem como os sistemas biológicos inteiras em E. coli. Cuidadosamente executar as etapas experimentais descritas acima, incluindo todos os controles apropriados, e rigorosamente análise e validação dos dados de forma independente GI são aspectos fundamentais para o sucesso de eSGA em ...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;forte&gt;I. Antibióticos&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Bioshop</td><td>#CLR201</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td></td><td>#KAN201</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td></td><td># AMP201</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;forte&gt;2. Meio Luria-Bertani&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>pó de LB</td><td>Bioshop</td><td>#LBL405</td><td></td></tr><tr><td>Ágar</td><td>Bioshop</td><td>#AGR003</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;forte&gt;3. Cepas Bacterianas e Plasmídeos&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Estirpe Hfr Cavalli &amp;#955;&lt;sub&gt;vermelho&lt;/sub&gt; sistema (JL238)</td><td>Babu &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pKD3</td><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; Centro de Estoque Genético, Yale</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keio &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; Coleta de receptores F-</td><td>Projeto Nacional de BioRecursos (NBRP) do Japão&lt;sup&gt;11&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hipomórfico &lt;em&gt;E. coli &lt;/em&gt;F-SPA-tag cepas</td><td>Open biosystems; Babu &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;forte&gt;4. Primers&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Primer constantes dessalinizados baseados em pKD3</td><td></td><td></td><td>F1: 5'-GGCTGACATGGGAATTAGC-3'&#039;&lt;br/&gt; R1: 5'-AGATTGCAGCATTACACGTCTT-3'</td></tr><tr><td>Primeres personalizados dessalinizados</td><td></td><td></td><td>Cm-R: 5'-TTATACGCAAGGCGACAAGG-3'&#039;&lt;br/&gt; Cm-F: 5'- GATCTTCCGTCACAGGTAGG-3'</td></tr><tr><td>Primeres personalizados dessalinizados</td><td></td><td></td><td>F2 e R2: regiões constantes de 20 nt baseadas na sequência pKD3 e regiões de homologia personalizadas de 45 nt&lt;br/&gt; Região constante F2&lt;br/&gt; 5'-CATATGAATATCCTCCTTA-3'&#039;&lt;br/&gt; Região constante R2:&lt;br/&gt; 5'-TGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'S1 e S2: regiões constantes de 27 nt para a amplificação do cassete SPA-Cm e regiões de homologia personalizadas de 45 nt&lt;br/&gt; região constante S1&lt;br/&gt; 5'AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG-3'&#039;&lt;br/&gt; Região constante S2:&lt;br/&gt; 5'- GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3'&#039;&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; KOCO-F e KOCO-C: primers de 20 nt situados a 200 pb do local de deleção do gene não essencial ou do gene essencial&lt;br/&gt; local de inserção da marcação genética SPA</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;forte&gt;5. Reagentes para PCR e Eletroforese&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Taq DNA polimerase</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>tampão PCR 10X</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTPs</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>25 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td># AGA002</td><td></td></tr><tr><td>Corante de carregamento</td><td>NEB</td><td>#B7021S</td><td></td></tr><tr><td>Brometo de etídio</td><td>Bioshop</td><td># ETB444</td><td></td></tr><tr><td>tampão TBE 10X</td><td>Bioshop</td><td># ETB444.10</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Bioshop</td><td># TRS001</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Sigma</td><td># T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA (pH 8,0)</td><td>Sigma</td><td># B6768-500G</td><td></td></tr><tr><td>escada de DNA</td><td>NEB</td><td>#N3232L</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;forte&gt;6. Kits de isolamento e purificação de DNA&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Kit de isolamento e purificação de DNA genômico</td><td>Promega</td><td>#A1120</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid Midi kit</td><td>Qiagen</td><td># 12143</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR purification kit</td><td>Qiagen</td><td>#28104</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;forte&gt;7. Equipamento para PCR, Transformação e Replicação por Pining&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Ciclador térmico</td><td>BioRad, iCycler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eletroforese em gel de agarose</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eletroporador</td><td>Bio-Rad GenePulser II</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cubeta de eletroporação de 0,2 cm</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>42 &amp;deg;banho-maria com agitador aquecido</td><td>Innova 3100</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter TJ-25 centrifugadora</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>32 &amp;deg;C shaker</td><td>New Brunswick Scientific, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>32 &amp;deg;Incubadora de placa C</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Robô de bancada RoToR-HDA</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas com densidade de pinos de 96, 384 e 1.536</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 ou 384 pinos longos</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;forte&gt;8. Equipamentos de Imagem&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Suporte para câmera</td><td>Kaiser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Câmera digital, 10 megapixels</td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caixas de luz, Testrite 16&quot; x 24&quot; unidades</td><td>Testrite</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;forte&gt;9. Reciclagem de Placas ou Almofadas &lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>10% de água sanitária</td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>etanol 70%</td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Água destilada estéril</td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capela de fluxo</td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>lâmpada ultravioleta</td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;forte&gt;10. Material de laboratório&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Tubos de polipropileno de 50 ml</td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tubos microcentrífuga de 1,5 ml</td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>frascos cónicos de 250 ml</td><td>VWR</td><td># 29140-045</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de cultura estéreis de 15 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td># 366052</td><td></td></tr><tr><td>Frascos criogênicos</td><td>VWR</td><td># 479-3221</td><td></td></tr><tr><td>Placas Retangulares</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas microtituladoras de 96 e 384 poços</td><td>Singer Instruments</td><td>Nunc</td><td></td></tr><tr><td>Rolo para selar placas de múltiplos poços</td><td>Sigma</td><td>#R1275</td><td></td></tr><tr><td>placas</td><td>ABgene</td><td># AB-0580</td><td></td></tr><tr><td>Selos adesivos para placas</td><td>Fisher Scientific</td><td># 13-990-14</td><td></td></tr><tr><td>-80 &amp;deg;congelador C</td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mapeamento bacterianas redes funcionais e vias<em&gt; escherichia coli</em&gt; usando sintéticos matrizes genéticas

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Fenótipos são determinados por uma série complexa de física (por exemplo, proteína-proteína) e funcionais (por exemplo, gene-gene ou genética) interacções (GI) 1. Enquanto interações físicas podem indicar que as proteínas bacterianas estão associadas como complexos, eles não revelam necessariamente via de nível relationships1 funcionais. Telas de GI, em que o crescimento de mutantes duplos tendo dois genes eliminados ou inactivados é medida e comparada com os mutantes correspondentes individuais, pode iluminar dependências epistáticos entre loci e, portanto, proporcionam um meio para consultar e descobrir novas relações funcionais 2. Mapas de grande escala GI foram relatados por organismos eucarióticos como o fermento 3-7, mas a informação GI permanece escassa para procariontes 8, o que dificulta a anotação funcional de genomas bacterianos. Para este fim, e outros desenvolveram alto rendimento quantitativo bacterianas métodos de rastreio de IG 9, 10 </sup&gt;. Aqui, apresentamos os principais passos necessários para realizar E. quantitativa coli Genetic Matriz Sintética procedimento de triagem (eSGA) em um genoma de escala-9, utilizando-se a conjugação bacteriana natural e recombinação homóloga para gerar sistematicamente e medir a aptidão de um grande número de mutantes duplos em um formato de matriz de colónia. Resumidamente, um robô é usado para transferir , através de conjugação, cloranfenicol (Cm) - marcado alelos mutantes de Hfr engenharia (alta freqüência de recombinação) &#39;linhagens doadoras em um conjunto ordenado de canamicina (Kan) - marcadas F-receptor cepas. Normalmente, usamos a perda de função de mutantes simples tendo deleções de genes não essenciais (por exemplo, a recolha de &#39;Keio&#39; 11) e as mutações de genes essenciais hypomorphic (isto é, os alelos que conferem a expressão da proteína reduzida, a estabilidade, ou a actividade de 9, 12, 13) para consultar as associações funcionais de genes essenciais e não essenciais, resvamente. Após a conjugação e subsequente troca genética mediada por recombinação homóloga, os duplos mutantes resultantes são seleccionadas em meio sólido contendo ambos os antibióticos. Depois de conseqüência, as placas são digitalmente fotografada e tamanhos colônia são quantitativamente registados com um sistema interno de tratamento automatizado de imagem 14. IG são reveladas quando a taxa de crescimento de um mutante duplo ou é significativamente melhor ou pior do que 9 esperada. SIG (ou negativo) agravante muitas vezes resultam entre a perda de função de mutações em pares de genes de vias compensatórias que incidem sobre o mesmo processo essencial 2. Aqui, a perda de um único gene é tamponada, tal que um ou outro mutante único é viável. No entanto, a perda de ambas as vias é prejudicial e resulta em letalidade sintética ou de doença (isto é, crescimento lento). Inversamente, aliviando (ou positivos) podem ocorrer interacções entre os genes na mesma via ou a proteína do complexo 2, como odeleção de um ou outro gene sozinho é frequentemente suficiente para perturbar o funcionamento normal da via ou complexo de tal forma que as perturbações adicionais não reduzem a actividade, e, consequentemente, o crescimento adicional. No geral, a identificação sistemática e análise de redes de GI pode fornecer imparciais, mapas globais de relações funcionais entre um grande número de genes, dos quais via de informações em nível de perdida por outras abordagens podem ser inferidas 9.

As IS revelam relações funcionais entre genes. De forma semelhante, uma vez que genes na mesma via exibem padrões semelhantes de IS e a similaridade dos perfis de IS representa a congruência de fenótipos, podemos agrupar genes funcionalmente relacionados em vias por meio do agrupamento (clustering) de seus perfis de IS. A integração de redes de IS e de correlação de IS com informações de interação física ou outros dados de associação, como relações de contexto genômico (CG), também pode revelar a organização de módulos f...

Sistemáticas e em grande escala genético sintético telas (gene-gene ou epistasia) interação pode ser usado para explorar a redundância genética e via de cross-talk. Aqui, descrevemos um alto rendimento quantitativo tecnologia de rastreamento genético sintético matriz, denominada eSGA que desenvolvemos para a elucidação de relações epistáticos e explorar redes de interação genéticos em<em&gt; Escherichia coli</em&gt;.

Mapeamento bacterianas redes funcionais e vias<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Usando sintéticos matrizes genéticas

Os fenótipos são determinados por uma série complexa de interações físicas (ex.: proteína-proteína) e funcionais (ex.: gene-gene ou genéticas) (GI)1. Embora...

O objetivo deste procedimento é investigar as relações funcionais entre genes e vias bacterianas. Isso é realizado primeiramente preparando arranjos de ceia coli, cepas mutantes simples que serão conjugadas ou acasaladas. O segundo passo é realizar a conjugação dos mutantes simples em formato de arranjo em placas.Em seguida, selecionam-se os mutantes duplos. O passo final é imaginar as placas de mutantes duplos e quantificar as colônias de mutantes duplos para determinar a aptidão da linhagem. Em última análise, os dados de tamanho das colônias são analisados para calcular escores de interação genética e identificar genes, vias e processos funcionalmente interativos.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a mutagênese aleatória, é que muitas cepas duplas mutantes individuais podem ser criadas. Além disso, as interações entre muitos genes podem ser avaliadas simultaneamente, independentemente do tamanho do gene, essencialidade ou aptidão do mutante de gene único. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de biologia de sistemas, como aquelas relacionadas às funções gênicas e à conversa funcional entre vias e processos.As impl

mapping-bacterial-functional-networks-pathways-escherichia-coli-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Análise de Expressão Gênica Utilizando bacteriana Microarrays

A purificação por afinidade das proteínas marcadas em combinação com espectrometria de massa (STDA) é um método poderoso para o mapeamento sistemático de redes de interacção de proteínas e para a investigação do mecanismo de base de processos biológicos. Aqui, descrevemos um otimizado seqüencial peptídeo afinidade (SPA) APMS procedimento desenvolvido para a...

Identificação de complexos de proteínas em<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Utilizando a purificação por afinidade sequencial Peptide em combinação com espectrometria de massa tandem

A concepção de um operão que codifica tanto o aparelho sintético de secreção e os monómeros estruturais de curli fibras é descrito. A superprodução destas amilóides e polímeros aderentes permite um ganho mensurável de aderência...

Engenharia bactérias aderentes pela criação de um único sintético Curli Operon

Este protocolo de cinco dias descreve todos os passos, equipamentos e software suplementar necessário para a criação e execução de um Escherichia coli endógena eficiente baseado TX-TL livre de células sistema de expressão a partir do zero. Com reagentes, o protocolo leva 8 horas ou menos para configurar uma reação, coletar e processar dados.

Protocolos para implementação de uma Escherichia coli Com base TX-TL Expression System-Free Cell para Biologia Sintética

Microscopia localização fotoativado (PALM), combinada com uma única molécula de rastreamento permite a observação direta e quantificação das interações DNA-proteína em células de Escherichia coli ao vivo.

Visualizando interações DNA-proteína em células bacterianas ao vivo usando fotoativado única molécula de Rastreamento

Aqui, apresentamos abordagens fenômicas para a caracterização funcional de genes de fagos putativos. As técnicas incluem um ensaio desenvolvido capaz de monitorar o metabolismo anabólico do hospedeiro, as Placas de Ensaio Multi-fenótipo (MAPs), além do método consagrado de metabolômica, capaz de medir efeitos ao metabolismo catabólico.

Phenomics fago: Abordagens fisiológicas para Caracterizar Novel Proteínas Virais

proteínas efetoras bacterianas são importantes para o estabelecimento de infecções bem-sucedidas. Este protocolo descreve a identificação experimental de parceiros de ligação proteicas de uma proteína efetora bacteriana em seu hospedeiro natural da planta. A identificação dessas interações efetoras através de levedura telas de dois híbridos tornou-se uma ferramenta importante para desvendar as estratégias de patogenicidade moleculares.

Desvendando a função de uma bacteriana Effector de um patógeno não-cultiváveis ​​meio de uma levedura Screen Two-hybrid

Este artigo apresenta uma série de protocolos para o desenvolvimento de células manipuladas e superfícies funcionalizadas que permitem sinteticamente engenharia E. coli para controlar e manipular superfícies de materiais programáveis.

Usando biologia sintética para manipular células vivas que fazem interface com materiais programáveis

Aqui, o poder de uma inserção aleatória de um elemento de DNA não-codificante, mediada por transposon foi usado para resolver a sua posição ideal cromossômica.

Determinação da localização cromossômica ideal para um elemento de DNA em Escherichia coli usando uma nova abordagem mediada por Transposon

A viabilidade de estratégias de sequenciamento do genoma completo (WGS) usando instrumentos de bancada simplificou a interrogação do genoma de cada micróbio de relevância para a saúde pública em um ambiente de laboratório. Uma adaptação metodológica do fluxo de trabalho para WGS bacteriano é descrita e um pipeline de bioinformática para análise também é apresentado.

Caracterização de uma cepa patogênica de Escherichia coli derivada de Oreochromis spp. Fazendas usando sequenciamento de genoma completo

Aqui, é apresentado um protocolo para projetar, construir e fornecer circuito sintético induzível baseado em tetraciclina controlado. O efeito dos circuitos sintéticos na eliminação do parasita e na expressão de citocinas pode ser estudado canalizando o pipeline apresentado. Este protocolo é relevante para pesquisadores que estudam a terapêutica baseada em circuitos sintéticos em doenças infecciosas.

Circuitos imunometabólicos na infecção para o avanço das terapias direcionadas ao hospedeiro

Aprenda a mapear redes funcionais e vias em Escherichia coli usando matrizes genéticas sintéticas eSGA. Este método permite investigar interações genéticas e relações epistáticas em alta escala.

Mapeamento bacterianas redes funcionais e vias

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