Dirigido Método Evolução

O objetivo geral deste protocolo é demonstrar como construir e triar bibliotecas mutantes em Saccharomyces Cerevisiae para experimentos de evolução dirigida. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na criação laboratorial para experimentos focados de evolução dirigida, como, por exemplo, como atribuir regiões sobrepostas durante a montagem e clonagem. A principal vantagem desta técnica é sua simplicidade e robustez, já que, em apenas uma etapa de transformação, é possível obter níveis com boa qualidade.

Este protocolo para criação e triagem de bibliotecas mutantes será demonstrado para uma aril-álcool oxidase fúngica ou AAO. As regiões para evolução direcionada focada são primeiramente escolhidas com a ajuda de algoritmos computacionais com base na estrutura cristalina disponível ou em modelos de homologia da enzima. Duas regiões da AAO serão alvo de mutagênese aleatória e recombinação: a região M1 e a região M2.

A PCR mutagênica será realizada para amplificar as regiões-alvo. Para promover a splicing in vivo em levedura, serão criadas regiões sobrepostas entre segmentos de aproximadamente 50 pares de bases cada, por meio da sobreposição de reações de PCR das regiões definidas. Prepare reações de PCR mutagênica com volume de 50 microlitros, cada uma contendo 46 nanogramas de molde de DNA, 90 nanomolares de cada iniciador sentido e antissentido, 0,3 milimolar de dNTPs, 3% de DMSO, 1,5 milimolar de cloreto de magnésio, 0,5 milimolar de cloreto de manganês e 0,5 unidades por microlitro de DNA polimerase tack.

Utilize o seguinte programa de PCR: 95 graus Celsius por dois minutos, 95 graus Celsius por 45 segundos, 50 graus Celsius por 45 segundos e 74 graus Celsius por 45 segundos, por 28 ciclos, seguido de 74 graus Celsius por 10 minutos. O restante do gene AAO, a região HF, será amplificado por PCR de alta fidelidade com as regiões correspondentes sobrepostas aos segmentos mutagênicos e/ou às extremidades salientes do vetor linearizado incluídas.

Prepare a PCR de alta fidelidade em um volume final de 50 microlitros contendo 10 nanogramas de molde de DNA, 250 nanomolares de cada iniciador sentido e antissentido, 0,8 milimolar de dNTPs, 3% de DMSO e 02 unidades por microlitro de polimerase de DNA iProof de alta fidelidade ultrarrápida. Utilize o seguinte programa de PCR: 98 graus Celsius por 30 segundos, 98 graus Celsius por 10 segundos, 55 graus Celsius por 25 segundos e 72 graus Celsius por 45 segundos durante 28 ciclos, seguido de 72 graus Celsius por 10 minutos.

Todos os fragmentos de PCR são então purificados com um kit comercial de extração de gel, de acordo com o protocolo do fabricante. O próximo passo é linearizar o vetor para criar regiões flanqueadoras de aproximadamente 50 pares de bases que são homólogas às extremidades cinco primas e três primas do gene alvo. Prepare uma mistura de reação de linearização de 20 microlitros contendo 2 microgramas de DNA, 7,5 unidades de BamH1, 7,5 unidades de XhoI, 20 microgramas de BSA e dois microlitros de tampão 10x para BamH1.

Incube a mistura de reação a 37 graus Celsius por duas horas e 40 minutos. Em seguida, inative a reação a 80 graus Celsius por 20 minutos. Para purificar o vetor linearizado e evitar contaminação com o plasmídeo circular residual, carregue a mistura da reação de digestão na mega-trilha de um gel de Agarose de ponto de fusão baixo semipreparativo.

Carregue cinco microlitros da mistura de reação no poço adjacente como repórter. Realize a eletroforese de DNA a quatro graus Celsius e cinco volts por centímetro entre os eletrodos. Em seguida, separe o gel de agarose correspondente ao mega-poco e armazene-o a quatro graus Celsius em um XTAE.

Manche a fileira com a escada de peso molecular e o repórter. Visualize as bandas sob luz UV e faça um pequeno corte na posição onde se encontra o vetor linearizado. Na ausência de luz UV e utilizando como orientação os cortes na fileira do repórter manchado, identifique o vetor linearizado no fragmento do poço gigante e retire-o.

Extraia o vetor linearizado do agarose e purifique-o utilizando um kit comercial de extração de gel, conforme o protocolo do fabricante. Posteriormente, o vetor linearizado purificado é misturado aos fragmentos de PCR e essa mistura de DNA é utilizada para transformar células de levedura competentes, usando um kit comercial de acordo com as instruções do fabricante. Plaque as células transformadas em placas SC sem suplementação e incube-as a 30 graus Celsius por três dias.

Para se preparar para este ensaio, escolha colônias individuais das placas de meio seletivo SC e transfira-as para placas de 96 poços contendo 50 microlitros de meio mínimo por poço. Em cada placa, inocule a coluna de número seis com o tipo parental como padrão interno. Como controle negativo, inocule o poço H1, preenchido com meio SC suplementado com uracil, com células ESI viscerais URA3 negativas sem plasmídeo.

Cubra as placas com suas tampas, envolva-as com filme plástico e incube a 30 graus Celsius em um agitador úmido por 48 horas. Após 48 horas, adicione 160 microlitros de meio de expressão a cada poço e resele as placas. Incube por mais 24 horas.

Após centrifugar as placas, utilize um robô multiestações para manipulação de líquidos para transferir 20 microlitros do sobrenadante dos poços de cada placa para uma placa réplica. Adicione 20 microlitros de álcool p-metoxibenzílico 2 milimolar e tampão fosfato de sódio 100 milimolar pH 6,0 a cada poço. Agite brevemente as placas com um agitador para placa de 96 poços e incube-as por 30 minutos à temperatura ambiente.

Em seguida, adicione 160 microlitros do reagente FOX a cada placa de réplica e agite brevemente com o misturador. Leia as placas a 560 nanômetros em um leitor de placas. Incube as placas à temperatura ambiente até que a cor se desenvolva.

Meça novamente a absorção. A atividade relativa é calculada a partir da diferença entre o valor de absorção após a incubação e o da medição inicial, normalizada ao tipo parental para cada placa. Esta imagem representativa de gel mostra o vetor linearizado na fileira dois, o segmento PCR M1 na fileira três, o segmento PCR M2 na fileira quatro, o segmento PCR HF na fileira cinco e o vetor reconstituído in vivo, linearizado com NHE um, na fileira seis.

Este próximo gel mostra a mini-preparação de plasmídeo do vetor remontado na linha dois, o plasmídeo linearizado com NHE um na linha três, o plasmídeo linearizado com BamH um e XHO um na linha quatro, e o plasmídeo linearizado obtido por extração em gel e purificação na linha cinco. As cargas mutacionais foram ajustadas por meio da amostragem de bibliotecas mutantes com diferentes paisagens, calculando-se o número de clones com menos de 10% da atividade da enzima parental e posterior verificação por sequenciamento de uma amostra aleatória de variantes ativas e inativas. Uma avaliação do limite de detecção deste ensaio mostrou que o ensaio foi linear na presença de sorbitol, representado por círculos pretos.

Na ausência de sorbitol, representada pelos quadrados brancos, a linearidade foi mais persistente, mas a resposta foi mais fraca. Foi observada uma correlação linear entre a concentração de AAO e a absorbância. Uma biblioteca mutante de 2.000 clones foi construída e triada com este ensaio.

O quadrado sombreado indica os mutantes de AAO com secreção e atividade notavelmente melhoradas contra o álcool p-metoxibenzílico. Uma vez dominado, as bibliotecas de mutantes podem ser produzidas em aproximadamente quatro horas, se o procedimento for realizado corretamente. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de atribuir áreas sobrepostas adequadas para cada família de PCR e vetor linearizado, para o spliceamento e clonagem in vivo em uma única etapa de transformação.

Seguindo uma abordagem semelhante, outros métodos como amostragem de DNA in vivo, biblioteca de mutagênese por saturação ou montagem de DNA podem ser realizados para construir bibliotecas de mutantes e/ou vias metabólicas. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de bioengenharia explorarem atividades, estabilidades ou até inventarem infinitos tipos de interação. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar este dispositivo de Saccharomyces cerevisiae para construção e triagem de bibliotecas.