Name: Dirigido Método Evolução Saccharomyces cerevisiae: Mutant Biblioteca Criação e Triagem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Aprenda a construir e triar bibliotecas mutantes em Saccharomyces cerevisiae para evolução dirigida. Este método computacional permite identificar regiões-alvo e selecionar mutantes com características desejadas em biotecnologia.

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Este trabalho foi apoiado pelo projeto da Comissão Europeia Indox-FP7-KBBE-2013-7-613549; um Cost-Action CM1303-Systems Biocatalysis; e pelos projetos nacionais Dewry [BIO201343407-R] e Cambios [RTC-2014-1777-3].

1. Construção do mutante Biblioteca <ol><li> Escolher as regiões a ser submetido à transição com a ajuda de algoritmos computacionais com base na estrutura de cristal ou homologia modelos disponíveis 18. <ol><li> Aqui, como alvo duas regiões de AAO de Pleurotus eryngii de mutagénese aleatória e recombinação (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), enquanto amplifica o restante do gene (844 pb) por PCR de alta fidelidade (Figura 1). Nota: Vários segmentos podem ser estudados por MORPHING de forma independente ou combinada 16. </li></ol></li><li> Ampliar as áreas visadas por PCR mutagênico. Criar áreas entre os segmentos (~ 50 pb cada) sobreposto por sobreposição de reacções de PCR das regiões definidas. <ol><li> Prepare PCR mutagénica de segmentos-alvo num volume final de 50 uL contendo uma cadeia molde de ADN (0,92 ng / uL), 90 nM de senso de oligo (RMLN para o segmento de MI e AAO-PA para o segmento M-II), 90 nM de uminiciador ntisense (AAO-92C para o segmento de MI e rMLC para segmento H-II), dNTPs 0,3 mM (0,075 mM de cada), 3% (v / v) de dimetilsulfóxido (DMSO), MgCl 1,5 mM, MnCl2 0,05 mM de 2 e 0,05 U / ul de polimerase de ADN de Taq. Sequências de iniciadores são detalhadas na Figura 1. </li><li> Usar o seguinte programa de PCR: 95 ° C durante 2 min (1 ciclo); 95 ° C durante 45 seg, 50 ° C durante 45 seg, 74 ° C durante 45 segundos (28 ciclos); e 74 ° C durante 10 min (1 ciclo). </li></ol></li><li> Amplificar as regiões não-mutagénicos com ultra-alta polimerase fidelidade e incluem as áreas correspondentes que se sobrepõem os segmentos mutagénicos e / ou saliências vector linearizado. <ol><li> Prepare misturas reaccionais num volume final de 50 ul contendo: molde de ADN (de 0,2 ng / uL), 250 nM de oligo sentido HFF, 250 nM de oligo anti-sentido de HFR, dNTPs 0,8 mM (0,2 mM cada), 3% (v / v) de dimetilsulfóxido (DMSO) e 0,02 U / ul de polimerase de ADN iproof. sequências de iniciadores são detalhados em &lt;strong&gt; Figura 1. </li><li> Usar o seguinte programa de PCR: 98 ° C durante 30 seg (1 ciclo); 98 ° C durante 10 seg, 55 ° C durante 25 seg, 72 ° C durante 45 segundos (28 ciclos); e 72 ° C durante 10 min (1 ciclo). Nota: Com condições descritas no 1.2 e 1.3 sobreposições de 43 bp (região plasmídeo-M1); 46 bp (região de região-HF M1); 47 pb (região-M2 região HF) e 61 pb (M2 região plasmídeo) são concebidos (Figura 1) para favorecer no splicing in vivo em leveduras. </li><li> Purifica-se todos os fragmentos de PCR (mutagénicos e não mutagénicos) com um kit de extracção de gel comercial de acordo com o protocolo do fabricante. </li></ol></li><li> Linearizar o vector de modo a que as regiões de cerca de 50 pb que flanqueia são criados que são homólogas às 5&#39;- e 3&#39;- extremidades do gene alvo. <ol><li> Prepara-se uma mistura de reacção contendo linearização 2 ug de ADN, 7,5 U de BamHI, 7,5 L Xho I, 20 ug de BSA e 2 ul de tampão Bam HI 10x num volume final de 20 ul. </li><li> Incubar a mistura de reacção a 37 ° C durante 2 h e 40 min. Posteriormente, proceder a inactivação a 80 ° C durante 20 min. </li></ol></li><li> Purifica-se o vector linearizado por extracção em gel de agarose a fim de evitar a contaminação com o plasmídeo circular residual (Figura 2). <ol><li> Carregar a mistura reaccional para a digestão mega-poço de um baixo ponto de fusão do gel de agarose semi-preparativa (0,75%, w: v), bem como uma alíquota (5 pi) da mistura de reacção na adjacentes bem como um repórter. </li><li> eletroforese Run DNA (5 V / cm entre os eletrodos, 4 ᵒC) e separar o gel de agarose correspondente ao mega-bem e armazená-lo em 4 ᵒC em 1x TAE. </li><li> Manchar a faixa com a escada de peso molecular e o repórter. Visualizar as bandas sob a luz UV. Nick a posição onde os linearizadas lugares vetor. Observação: Como a qualidade do vector linearizado purificado é um critifator de cal para a recombinação de sucesso e montagem em levedura, evitar manchas gel para eletroforese de DNA semi-preparativa. O uso de corantes e exposição aos raios UV para a extração de gel pode afectar a estabilidade do vector de ADN, comprometer a eficiência de recombinação in vivo. Como alternativa aos corantes EtBr tóxicos, Gel corantes SYBR vermelha e são comumente usados ​​para a coloração do gel. </li><li> Na ausência de luz UV, identificar o vector linearizado no fragmento mega poço utilizando a orientação dos entalhes na pista repórter coradas de modo que ele pode ser isolado. </li><li> Extrair o vector linearizado a partir de agarose e purificá-lo com um gel extraction kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante. Nota: O uso de altas cópia vectores vaivém epissomal com marcadores de antibióticos e de auxotrofia: Neste exemplo, aplicou-se o uracilo independente e resistência à ampicilina pJRoC30 vector, sob o controlo do promotor de levedura GAL1. </li></ol></li><li> Preparar um mi equimolarxture dos fragmentos de PCR e misturá-lo com o vector linearizado numa proporção de 2: 1, com não menos do que 100 ng do plasmídeo linearizado (teste diferentes rácios de biblioteca equimolar / vector aberto para conseguir bons rendimentos de transformação). <ol><li> Medir a absorvância dos fragmentos de PCR e o vector linearizado a 260 nm e 280 nm para determinar a concentração e pureza. </li></ol></li><li> Transformar células competentes de levedura com a mistura de ADN utilizando um kit de transformação de levedura comercial (ver Tabela para o abastecimento) de acordo com as instruções do fabricante. <ol><li> Aqui, use uma protease deficiente e URA3 - S. dependentes cerevisiae, BJ5465. Transformar as células com o vector parental circularizado como um padrão interno durante o rastreio (ver abaixo). Além disso, o fundo vá transformando o vector linearizado na ausência de fragmentos de PCR. Nota: Em caso de detecção de níveis iniciais de secreção baixos, use S.cerevisiae protease estirpes deficientes como BJ5465 para promover o acúmulo de proteína ativa em sobrenadantes de cultura. Se a enzima alvo é submetido a hiperglicosilação, a utilização de estirpes de glicosilação-deficiente (por exemplo, Δ Kre2 que só é capaz de prender pequenas oligómeros de manose) poderia ser uma opção adequada. </li></ol></li><li> Placa as células transformadas em SC placas de abandono e incubar-los a 30 ° C durante três dias. Plate (em SC drop-out placas suplementadas com uracil) URA3 - S. cerevisiae células com falta do plasmídeo como um controlo negativo para o rastreio (ver abaixo). </li></ol> 2. Alto Throughput Screening Assay (Figura 3) <ol><li> Encher um número apropriado de placas de 96 poços estéreis (23 placas para analisar uma biblioteca de 2.000 clones) com 50 ul de meio mínimo por cavidade com a ajuda de um robot de pipetagem. </li><li> Escolha das colónias individuais a partir do SC-gota a placas e transferi-los para as placas de 96 poços. <ol><li> Em cada prato, inocular número da coluna 6 com o tipo parental como padrão interno e bem H1 com URA3 - S. cerevisiae (células em meio SC suplementado com uracilo) sem plasmídeo como um controlo negativo. Nota: Bem H1 é preenchido especificamente com os meios de abandono suplementadas com uracil. Um meio contendo bem em branco sem células também pode ser preparado como um controle adicional esterilidade. </li></ol></li><li> Cubra as placas com suas tampas e envolvê-los em Parafilm. Incubar as placas durante 48 h a 30 ° C, 225 rpm e 80% de humidade relativa num agitador húmido. </li><li> Remover o Parafilm, adicionar 160 uL de meio de expressão para cada cavidade com a ajuda do robot de pipetagem, voltar a selar as placas e incubar durante mais 24 h. Nota: Minimal médio e médio expressão são preparados como relatado em outros 19. níveis de secreção podem variar em função do gene em estudo e, consequentemente, tele incubação vezes tem de ser optimizada em cada caso, para sincronizar o crescimento celular em todas as cavidades. </li><li> Centrifugar as placas (placas mestres) a 2800 x g durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Transferir 20 uL do sobrenadante dos poços na placa mestra para a placa réplica, utilizando um líquido de manuseamento de múltiplas robótico. Nota: Para favorecer a secreção de enzima é aconselhável substituir o péptido de sinal nativa da proteína alvo por péptidos de sinal vulgarmente utilizados para expressão heteróloga em levedura (por exemplo, o factor de prepro-α líder, o líder do K 1 da toxina assassina de S. cerevisiae, ou mesmo versões quiméricas de ambos os péptidos 13). Alternativamente, o péptido sinal nativo pode ser evoluído exclusivamente para a secreção em levedura. </li><li> Adicionar 20 ul de p -methoxybenzylalcohol 2 mM em 100 mM de tampão fosfato de sódio pH 6,0, com a ajuda do robot de pipetagem. Agitar as placas brevemente com uma de 96 nósLL misturador de placas e incubar durante 30 min à TA. </li><li> Com o robot de pipetagem, adicionar 160 ul do reagente FOX para cada placa de réplica e agita-se brevemente com o misturador (concentração final de mistura FOX no poço: 100 uM de xilenol laranja, 250 ^ M de Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 e mm H 25 2 SO 4). <ol><li> Adicionar vários aditivos para o reagente para aumentar a sensibilidade, tais como co-solventes orgânicos (DMSO, etanol, metanol) ou sorbitol 17. Aqui, amplificar a resposta por adição de sorbitol a uma concentração final de 100 mM (figura 4). </li></ol></li><li> Ler as placas (modo de ponto final, t 0) a 560 nm num leitor de placas. </li><li> Incubar as placas à temperatura ambiente até a cor se desenvolve e medir novamente a absorção (T 1). <ol><li> Calcula-se a actividade relativa da diferença entre o valor Abs após a incubação e a da medição inicial normalizada com base na pareTipo ntal para cada placa (Dt 1 - t 0). </li></ol></li><li> Sujeitar os melhores hits mutantes para dois re-exames consecutivos para excluir falsos positivos. Nota: Tipicamente, re-rastreios incluem isolamento de plasmídeos a partir de levedura, amplificação e purificação em Escherichia coli, seguido de transformação de células de levedura fresca com o plasmídeo 19. Cada clone seleccionado é re-exibido em pentaplicate. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Neste artigo, nós resumimos a maioria das dicas e truques empregados no nosso laboratório para projetar enzimas por evolução dirigida em S. cerevisiae (AAO utilizando como exemplo) de modo que eles podem ser adaptados para utilização com muitos outros sistemas enzima eucariótica, simplesmente seguindo a abordagem comum descrito aqui. Em termos de criação de biblioteca, Metamorfose é um método one-pot rápido para introduzir e recombinar mutações aleatórias em trechos de proteínas peq...

Evolução molecular dirigida é um método robusto, rápido e fiável para conceber enzimas 1, 2. Através de ciclos iterativos de aleatória mutação, recombinação e selecção, versões melhoradas das enzimas pode ser gerado que actuam sobre novos substratos, em novas reacções, em não-naturais ambientes, ou até mesmo para ajudar a célula de atingir novos objectivos metabólicas 3-5. Entre os anfitriões utilizados na evolução dirigida, levedura Saccharomyces cerevisiae da cervejaria oferece um repertório de soluções para a expressão funcional de proteínas eucarióticas complexas que não estejam disponíveis em vias procariotas 6,7. Utilizado exaustivamente em estudos de biologia celular, este pequeno modelo eucariótico tem muitas vantagens em termos de modificações pós-traducionais, a facilidade de manipulação e transformação eficiência, todos os quais são características importantes de engenheiro enzimas por evolução dirigida 8. Por outro lado, a alta frequênciarecombinação homóloga de ADN em S. cerevisiae acoplado ao seu aparelho à prova de leitura eficiente abre um vasto leque de possibilidades para a criação de biblioteca e montagem de gene in vivo, promovendo a evolução de diferentes sistemas de enzimas individuais para vias artificiais complexos 9-12. Nosso laboratório passou a última década projetando ferramentas e estratégias para a evolução molecular de diferentes ligninases em levedura (Oxirredutases envolvidas na degradação da lignina durante o decaimento de madeira natural) 13-14. Nesta comunicação, nós apresentamos um protocolo detalhado para preparar e bibliotecas mutantes tela em S. cerevisiae para um modelo flavooxidase, -aril-oxidase de álcool (AAO 15) -, que podem ser facilmente convertidos para muitas outras enzimas. O protocolo envolve um método evolução focada-dirigida (MORPHING: Processo mutagênicos Organizado recombinação homóloga in vivo pelo Agrupamento) assistida pelo aparelho celular de levedura 16, umda ensaio de rastreio muito sensível com base na reacção de Fenton, a fim de detectar a actividade AAO secretado para o caldo de cultura 17.

<table><tbody><tr><td><forte>1. Meios de cultura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina sal de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td>CAS N&ordm; 69-52-3 M.W. 371,39</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Cloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td>CAS N&ordm; 56-75-7 M.W. 323,13</td></tr><tr><td>D-(+)-Galactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750</td><td>CAS N&ordm; 59-23-4 M.W. 180,16</td></tr><tr><td>D-(+)-glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>CAS N&ordm; 50-99-7 M.W. 180,16</td></tr><tr><td>D-(+)-rafinose pentahidratada</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83400</td><td>CAS N&ordm; 17629-30-0 M.W. 594,51</td></tr><tr><td>Peptona</td><td>Difco</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>fosfato de potássio monobásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td>CAS N&ordm; 7778-77-0 M.W. 136,09</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U1128</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de Levedura</td><td>Difco</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Base de Nitrogênio de Levedura sem Aminoácidos</td><td>Difco</td><td>291940</td><td></td></tr><tr><td>Levedura Sintética Drop-out Medium Suplementos sem uracilo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1501</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>2. Reações de PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>Agilent genomics</td><td>200415-51</td><td>25 mM cada</td></tr><tr><td>iProof DNA polimerase de alta fidelidade</td><td>Bio-rad</td><td>172-5301</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de manganês(II) tetrahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8054</td><td>CAS N&ordm; 13446-34-9 M.W. 197.91</td></tr><tr><td>Taq DNA Polimerase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4545</td><td>Para erro propenso PCR</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>3. Linearização de plasmídeo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BamHI enzima de restrição</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>New England Biolabs</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>XhoI enzima de restrição</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Enzima de restrição não I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>Gel Red</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>Para coloração de DNA</td></tr><<tr><td>strong>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>4. Ensaios FOX< / forte ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>sulfato de ferro (II) de amônio hexahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3754</td><td>CAS N & ordm; 7783-85-9 MW 392.14</td></tr><tr><td>Álcool de Anysil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W209902</td><td>CAS N & ordm; 105-13-5 MW 138.16</td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td>CAS N & ordm; 50-70-4 MW 182.17</td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio 30%</td> <td>Merck Millipore</td><td>1072090250</td><td>FOX curva padrão</td></tr><tr><td>Xilenol Sal dissódico laranja</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52097</td><td>CAS N&ordm; 1611-35-4 MW 716.62</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>5. Agarose gel stuff</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Norgen</td><td>28035</td><td>CAS N&ordm; 9012-36-6</td></tr><tr><td>Gel Red</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>corante de análise de DNA</td></tr><tr><td>GeneRuler 1kb Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0311</td><td>DNA MW corante de carregamento padrão</td></tr><tr><td>6x</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>Agarose de baixa temperatura de fusão</td><td>Bio-rad</td><td>161-3112</td><td>CAS N&ordm; 39346-81-1</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>6. Kits e células</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae cepa BJ5465</td><td>LGC Promochem</td><td>ATTC 208289</td><td>Cepa deficiente em protease com genótipo: MAT&alpha; ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL</td></tr><tr><td>E. coli XL2-Blue células competentes</td><td>Genômica Agilent</td><td>200150</td><td>Para purificação e amplificação de plasmídeos</td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel e Kit</td> <td>de Limpeza de PCRMacherey-Nagel</td><td>740,609,250</td><td>Extração de gel de DNA</td></tr><tr><td>Kit de plasmídeo NucleoSpin</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740,588,250</td><td>Kit de minipreparação de coluna</td></tr><tr><td>Kit de transformação de levedura</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>YEAST1-1KT</td><td>Transportador de DNA incluído (testículos de salmão)</td></tr><tr><td>Miniprep de plasmídeo de levedura Zymoprep I</td><td>Pesquisa Zymo</td><td>D2001</td><td>Extração de plasmídeo de levedura</td></tr><tr><td><forte>Nome</td><td>Company</td><td>Número de catálogo<</td><td>strong>Comentários</td></tr><tr><td>7. Placas</forte>placas de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>96 poços</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655101</td><td>Poliestireno transparente, não estéril (para medições de atividade)</td></tr><tr><td>Placas de 96 poços</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655161</td><td>Poliestireno transparente, estéril (para microfermentações)</td></tr><tr><td>Tampa de placa de 96 poços</td><td>Greiner Bio-One</td><td>656171</td><td>Poliestireno transparente e estéril (para microfermentações)</td></tr></tbody></table>

dirigido método evolução<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em&gt;: mutant biblioteca criação e triagem

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Evolução dirigida em Saccharomyces cerevisiae oferece muitas vantagens atraentes no projecto enzimas para aplicações biotecnológicas, um processo que envolve a construção, clonagem e expressão de bibliotecas de mutantes, acoplada a alta frequência de recombinação homóloga de ADN in vivo. Aqui, apresentamos um protocolo para criar e bibliotecas mutantes tela em leveduras com base no exemplo de um fúngica oxidase aril-álcool (AAO) para melhorar a sua actividade total. Dois segmentos de proteína foram sujeitos a evolução focalizado dirigido por mutagénese aleatória de ADN e na recombinação in vivo. Saliências de ~ 50 pb que flanqueia cada segmento permitiu a remontagem correcta do gene AAO-fusão num vector linearizado dando origem a um total de plasmídeo de replicação autónoma. Bibliotecas mutantes enriquecidos com variantes funcionais da AAO foram rastreados em S. cerevisiae sobrenadantes com um ensaio de elevado débito sensível com base na reacção de Fenton. O processo geral dea construção da biblioteca em S. cerevisiae aqui descrito pode ser facilmente aplicado a evoluir muitos outros genes eucarióticos, evitando reacções adicionais de PCR in vitro de recombinação de DNA e ligação etapas.

AAO de P. eryngii é um flavooxidase extracelular que abastece as peroxidases fúngicas com H 2 O 2 para começar a atacar a lignina. Dois segmentos de AAO foram submetidos a evolução focada-dirigido por MORPHING, a fim de melhorar a sua actividade e a sua expressão em S. cerevisiae 19. Independentemente das enzimas estrangeiras abrigadas por S. cerevisiae, o problema mais crítico, quando a construção de bibliotecas de mutantes em ...

Apresentamos um protocolo detalhado para construir e rastrear bibliotecas mutantes para campanhas de evolução dirigida em Saccharomyces cerevisiae.

Dirigido Método Evolução<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Biblioteca Criação e Triagem

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

O objetivo geral deste protocolo é demonstrar como construir e triar bibliotecas mutantes em Saccharomyces Cerevisiae para experimentos de evolução dirigida. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na criação laboratorial para experimentos focados de evolução dirigida, como, por exemplo, como atribuir regiões sobrepostas durante a montagem e clonagem. A principal vantagem desta técnica é sua simplicidade e robustez, já que, em apenas uma etapa de transformação, é possível obter níveis com boa qualidade.Este protocolo para criação e triagem de bibliotecas mutantes será demonstrado para uma aril-álcool oxidase fúngica ou AAO. As regiões para evolução direcionada focada são primeiramente escolhidas com a ajuda de algoritmos computacionais com base na estrutura cristalina disponível ou em modelos de homologia da enzima. Duas regiões da AAO serão alvo de mutagênese aleatória e recombinação: a região M1 e a região M2.A PCR mutagênica será realizada para amplificar as regiões-alvo. Para promover a splicing in vivo em levedura, serão criadas regiões sobrepostas entre segmentos de aproximadamente 50 pares de bases cada, por meio da sobreposição de reações de PCR das regiões definidas. Prepare reações de PCR mutagênica com volume de 50 microlitros, cada uma contendo 46 nanogramas de molde de DNA, 90 nanomolares de cada iniciador sentido e antissentido, 0,3 milimolar de dNTPs, 3% de DMSO, 1,5 milimolar de cloreto de magnésio, 0,5 milimolar de cloreto de manganês e 0,5 unidades por microlitro de DNA polimerase tack.Utilize o seguinte programa de PCR: 95 graus Celsius por dois minutos, 95 graus Celsius por 45 segundos, 50 graus Celsius por 45 segundos e 74 graus Celsius por 45 segundos, por 28 ciclos, seguido de 74 graus Celsius por 10 minutos. O restante do gene AAO, a região HF, será amplificado por PCR de alta fidelidade com as regiões correspondentes sobrepostas aos segmentos mutagênicos e/ou às extremidades salientes do vetor linearizado incluídas.Prepare a PCR de alta fidelidade em um volume final de 50 microlitros contendo 10 nanogramas de molde de DNA, 250 nanomolares de cada iniciador sentido e antissentido, 0,8 milimolar de dNTPs, 3% de DMSO e 02 unidades por microlitro de polimerase de DNA iProof de alta fidelidade ultrarrápida. Utilize o seguinte programa de PCR: 98 graus Celsius por 30 segundos, 98 graus Celsius por 10 segundos, 55 graus Celsius por 25 segundos e 72 graus Celsius por 45 segundos durante 28 ciclos, seguido de 72 graus Celsius por 10 minutos.Todos os fragmentos de PCR são então purificados com um kit comercial de extração de gel, de acordo com o protocolo do fabricante. O próximo passo é linearizar o vetor para criar regiões flanqueadoras de aproximadamente 50 pares de bases que são homólogas às extremidades cinco primas e três primas do gene alvo. Prepare uma mistura de reação de linearização de 20 microlitros contendo 2 microgramas de DNA, 7,5 unidades de BamH1, 7,5 unidades de XhoI, 20 microgramas de BSA e dois microlitros de tampão 10x para BamH1.Incube a mistura de reação a 37 graus Celsius por duas horas e 40 minutos. Em seguida, inative a reação a 80 graus Celsius por 20 minutos. Para purificar o vetor linearizado e evitar contaminação com o plasmídeo circular residual, carregue a mistura da reação de digestão na mega-trilha de um gel de Agarose de ponto de fusão baixo semipreparativo.Carregue cinco microlitros da mistura de reação no poço adjacente como repórter. Realize a eletroforese de DNA a quatro graus Celsius e cinco volts por centímetro entre os eletrodos. Em seguida, separe o gel de agarose correspondente ao mega-poco e armazene-o a quatro graus Celsius em um XTAE.Manche a fileira com a escada de peso molecular e o repórter. Visualize as bandas sob luz UV e faça um pequeno corte na posição onde se encontra o vetor linearizado. Na ausência de luz UV e utilizando como orientação os cortes na fileira do repórter manchado, identifique o vetor linearizado no fragmento do poço gigante e retire-o.Extraia o vetor linearizado do agarose e purifique-o utilizando um kit comercial de extração de gel, conforme o protocolo do fabricante. Posteriormente, o vetor linearizado purificado é misturado aos fragmentos de PCR e essa mistura de DNA é utilizada para transformar células de levedura competentes, usando um kit comercial de acordo com as instruções do fabricante. Plaque as células transformadas em placas SC sem suplementação e incube-as a 30 graus Celsius por três dias.Para se preparar para este ensaio, escolha colônias individuais das placas de meio seletivo SC e transfira-as para placas de 96 poços contendo 50 microlitros de meio mínimo por poço. Em cada placa, inocule a coluna de número seis com o tipo parental como padrão interno. Como controle negativo, inocule o poço H1, preenchido com meio SC suplementado com uracil, com células ESI viscerais URA3 negativas sem plasmídeo.Cubra as placas com suas tampas, envolva-as com filme plástico e incube a 30 graus Celsius em um agitador úmido por 48 horas. Após 48 horas, adicione 160 microlitros de meio de expressão a cada poço e resele as placas. Incube por mais 24 horas.Após centrifugar as placas, utilize um robô multiestações para manipulação de líquidos para transferir 20 microlitros do sobrenadante dos poços de cada placa para uma placa réplica. Adicione 20 microlitros de álcool p-metoxibenzílico 2 milimolar e tampão fosfato de sódio 100 milimolar pH 6,0 a cada poço. Agite brevemente as placas com um agitador para placa de 96 poços e incube-as por 30 minutos à temperatura ambiente.Em seguida, adicione 160 microlitros do reagente FOX a cada placa de réplica e agite brevemente com o misturador. Leia as placas a 560 nanômetros em um leitor de placas. Incube as placas à temperatura ambiente até que a cor se desenvolva.Meça novamente a absorção. A atividade relativa é calculada a partir da diferença entre o valor de absorção após a incubação e o da medição inicial, normalizada ao tipo parental para cada placa. Esta imagem representativa de gel mostra o vetor linearizado na fileira dois, o segmento PCR M1 na fileira três, o segmento PCR M2 na fileira quatro, o segmento PCR HF na fileira cinco e o vetor reconstituído in vivo, linearizado com NHE um, na fileira seis.Este próximo gel mostra a mini-preparação de plasmídeo do vetor remontado na linha dois, o plasmídeo linearizado com NHE um na linha três, o plasmídeo linearizado com BamH um e XHO um na linha quatro, e o plasmídeo linearizado obtido por extração em gel e purificação na linha cinco. As cargas mutacionais foram ajustadas por meio da amostragem de bibliotecas mutantes com diferentes paisagens, calculando-se o número de clones com menos de 10% da atividade da enzima parental e posterior verificação por sequenciamento de uma amostra aleatória de variantes ativas e inativas. Uma avaliação do limite de detecção deste ensaio mostrou que o ensaio foi linear na presença de sorbitol, representado por círculos pretos.Na ausência de sorbitol, representada pelos quadrados brancos, a linearidade foi mais persistente, mas a resposta foi mais fraca. Foi observada uma correlação linear entre a concentração de AAO e a absorbância. Uma biblioteca mutante de 2.000 clones foi construída e triada com este ensaio.O quadrado sombreado indica os mutantes de AAO com secreção e atividade notavelmente melhoradas contra o álcool p-metoxibenzílico. Uma vez dominado, as bibliotecas de mutantes podem ser produzidas em aproximadamente quatro horas, se o procedimento for realizado corretamente. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de atribuir áreas sobrepostas adequadas para cada família de PCR e vetor linearizado, para o spliceamento e clonagem in vivo em uma única etapa de transformação.Seguindo uma abordagem semelhante, outros métodos como amostragem de DNA in vivo, biblioteca de mutagênese por saturação ou montagem de DNA podem ser realizados para construir bibliotecas de mutantes e/ou vias metabólicas. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de bioengenharia explorarem atividades, estabilidades ou até inventarem infinitos tipos de interação. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar este dispositivo de Saccharomyces cerevisiae para construção e triagem de bibliotecas.

directed-evolution-method-saccharomyces-cerevisiae-mutant-library

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aqui demonstramos um protocolo simples para criar uma biblioteca aleatória mutante para uma seqüência alvo. Nós mostramos como esse método, que é realizado in vivo em Escherichia coli, pode ser acoplado com seleções funcional para evoluir novas atividades enzimáticas.

Mutagênese e Funcional Protocolos de Seleção para a Evolução Dirigida de proteínas em E. coli</em

Nós desenvolvemos abrangente, imparcial genome-wide telas para entender gene de drogas e interações gene-ambiente. Métodos para a triagem dessas coleções mutantes são apresentados.

Competitiva Screens Genomic de Bibliotecas Yeast Barcoded

Um método de evolução dirigida novo específico para o domínio da engenharia termoestabilidade foi desenvolvido e, consequentemente, para as enzimas bacteriolytic validado. Depois de apenas uma rodada de mutagénese ao acaso, uma enzima evoluiu bacteriolytic, PlyC 29C3, exibido duas vezes maior do que a actividade residual quando comparada com a proteína de tipo selvagem, após incubação a temperatura elevada.

Novo método de triagem para a evolução dirigida de enzimas termoestáveis ​​Bacteriolytic

Este artigo descreve uma metodologia detalhada para o mutagenesis aleatório de um gene alvo no fermento de fissão. Como exemplo, temos como alvo rpt4 +, que codifica uma subunidade do proteossomo 19S e tela para as mutações que desestabilizam a heterocromatina.

Gene-alvo Mutagenesis aleatório para selecionar heterocromatina-desestabilizando Proteassoma mutantes no fermento de fissão

Este artigo apresenta um método baseado em acasalamento para facilitar a triagem de superexpressão em leveduras brotamento usando uma biblioteca de matriz do plasmídeo.

Rastreio de biblioteca superexpressão de acasalamento-baseado no fermento

Apresentamos um protocolo de tela simples supressor em fissão fermento. Este método é eficiente, livre de mutagênico e seletiva para as mutações que ocorrem frequentemente em um único locus genômico.  O protocolo é apropriado para isolar supressores que aliviar defeitos de crescimento em cultura líquida que são causados por uma mutação ou uma droga.

Uma tela de supressor de Deep-sequenciamento-assistida, espontânea na fissão levedura Schizosaccharomyces pombe

Endonucleases de restrição com nova especificidade de seqüência podem ser desenvolvidas a partir de enzimas que reconhecem uma seqüência parcialmente degenerada. Aqui fornecemos um protocolo detalhado que usamos com sucesso para alterar a especificidade da seqüência da enzima NlaIV. Os ingredientes-chave do protocolo são a compartimentação in vitro da reação de transcrição/tradução e a seleção de variantes com novas especificidades de seqüência.

In Vitro Evolução dirigida de uma endonuclease de restrição com especificidade mais rigorosa

Este trabalho descreve um protocolo para uma triagem genética supressora de múltiplas cópias em Schizosaccharomyces pombe. Esta tela usa uma biblioteca de plasmídeos em todo o genoma para identificar clones supressores de um fenótipo de perda de função associado a uma cepa mutante de consulta. Novos supressores genéticos do mutante nulo ell1 foram identificados usando esta tela.

Triagem Genética para Identificação de Supressores Multicópia em Schizosaccharomyces pombe

As interações de biomoléculas, como as interações proteína-proteína, são a base molecular das funções biológicas. Se mutantes de interação nula/prejudicada que especificamente não possuem a interação relevante puderem ser isolados, eles ajudarão muito a entender a(s) função(ões) dessa interação. Este artigo apresenta uma maneira eficiente de isolar mutantes nulos de interação/prejudicados.

Isolando mutantes de interação nula/prejudicada usando o ensaio de dois híbridos de levedura

Este protocolo descreve as etapas essenciais para a realização de campanhas de seleção de exibição de superfície de levedura para enriquecer as variantes de proteína que se ligam a um antígeno de interesse.

Engenharia de proteínas por exibição de superfície de levedura

Aprenda a construir e triar bibliotecas mutantes em Saccharomyces cerevisiae para evolução dirigida. Este método computacional permite identificar regiões-alvo e selecionar mutantes com características desejadas em biotecnologia.

Dirigido Método Evolução

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