Dirigido Método Evolução Saccharomyces cerevisiae: Mutant Biblioteca Criação e Triagem
1 de abril de 2016
Apresentamos um protocolo detalhado para construir e rastrear bibliotecas mutantes para campanhas de evolução dirigida em Saccharomyces cerevisiae.
O objetivo geral deste protocolo é mostrar como construir e rastrear bibliotecas mutantes em Saccharomyces Cerevisiae para experimentos de evolução dirigida. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no uso de criação de laboratório para experimentos de evolução direcionada focados, como atribuir áreas sobrepostas para na montagem e clonagem. A principal vantagem desta técnica é a sua simplicidade e robustez, uma vez que em apenas um passo de transformação é algo que pode ser atribuído a níveis com boa qualidade.
Este protocolo para criar e rastrear bibliotecas mutantes será demonstrado para uma aril-álcool oxidase fúngica ou AAO. As regiões para evolução direcionada focada são primeiramente escolhidas com a ajuda de algoritmos computacionais baseados na estrutura cristalina disponível ou modelos de homologia da enzima. Duas regiões de AAO serão direcionadas para mutagênese e recombinação aleatórias: a região M1 e a região M2.
A PCR mutagênica será realizada para amplificar as áreas-alvo. Para promover o splicing in vivo em leveduras, áreas sobrepostas entre segmentos de aproximadamente 50 pares de bases cada serão criadas pela sobreposição de reações de PCR das regiões definidas. Prepare PCRs mutagênicos de volume de 50 microlitros, cada um contendo 46 nanogramas de molde de DNA, 90 nanomolares cada de primers sense e antisense, 0,3 milimolar de DNTPs, 3% de DMSO, 1,5 milimolar de cloreto de magnésio, 05 milimolar de cloreto de manganês e 05 unidades por microlitro de DNA polimerase de aderência.
Use o seguinte programa de PCR. 95 graus Celsius por dois minutos, 95 graus Celsius por 45 segundos, 50 graus Celsius por 45 segundos e 74 graus Celsius por 45 segundos por 28 ciclos e 74 graus Celsius por 10 minutos. O restante do gene AAO, a região HF, será amplificado por PCR de alta fidelidade com as áreas correspondentes sobrepostas aos segmentos mutagênicos e/ou saliências vetoriais linearizadas incluídas.
Preparar a PCR de alta fidelidade em um volume final de 50 microlitros contendo 10 nanogramas de molde de DNA, 250 nanomolares de cada um dos primers sense e antisense, 0,8 milimolar de DNTPs, 3% de DMSO e 02 unidades por microlitro de DNA polimerase de ultra alta fidelidade iProof. Use o seguinte programa de PCR. 98 graus Celsius por 30 segundos, 98 graus Celsius por 10 segundos, 55 graus Celsius por 25 segundos e 72 graus Celsius por 45 segundos por 28 ciclos e 72 graus Celsius por 10 minutos.
Todos os fragmentos de PCR são então purificados com um kit comercial de extração em gel de acordo com o protocolo do fabricante. O próximo passo é linearizar o vetor para criar regiões flanqueadoras de aproximadamente 50 pares de bases que são homólogas às cinco extremidades principais e três primas do gene alvo. Prepare uma mistura de reação de linearização de 20 micolitro contendo 2 microgramas de DNA, 7,5 unidades de BamH-one, 7,5 unidades de XHO-one, 20 microgramas de BSA e dois microlitros de 10x tampão BamH-one.
Incubar a mistura de reação a 37 graus Celsius por duas horas e 40 minutos. Depois disso, desative a reação a 80 graus Celsius por 20 minutos. Para purificar o vetor linearizado para evitar a contaminação com o plasmídeo circular residual, carregue a mistura de reação de digestão no mega-poço de um gel de agarose semi-preparativo de baixo ponto de fusão.
Carregue cinco microlitros da mistura de reação no poço adjacente como um repórter. Execute a eletroforese de DNA a quatro graus Celsius e cinco volts por centímetro entre os eletrodos. Em seguida, separe o gel de agarose correspondente ao mega-poço e armazene-o a quatro graus Celsius em um XTAE.
Manchar a pista com a escada de peso molecular e o repórter. Visualize as bandas sob luz ultravioleta e corte a posição onde o vetor linearizado se coloca. Na ausência de luz ultravioleta e usando a orientação dos cortes na faixa do repórter manchado, identifique o vetor linearizado no fragmento do mega-poço e excise-o.
Extraia o vetor linearizado da Agarose e purifique-o com um kit comercial de extração em gel de acordo com o protocolo do fabricante. Posteriormente, o vetor linearizado purificado é misturado com os fragmentos de PCR e essa mistura de DNA é usada para transformar células de levedura competentes usando um kit comercial de acordo com as instruções do fabricante. Coloque as células transformadas em placas de eliminação SC e incube-as a 30 graus Celsius por três dias.
Para se preparar para este ensaio, pegue colônias individuais das placas de saída SC e transfira-as para placas de 96 poços contendo 50 microlitros de meio mínimo por poço. Em cada placa, inocular a coluna número seis, tendo como padrão interno o tipo parental. Como controle negativo, inocular bem H-one preenchido com meios SC suplementados com uracila com células viscerais ESI URA3 negativas sem plasmídeo.
Cubra as placas com as tampas, embrulhe-as em filme paralímpico e incube a 30 graus Celsius em uma coqueteleira úmida por 48 horas. Após 48 horas, adicione 160 microlitros de meio de expressão a cada poço e feche novamente as placas. Incubar por mais 24 horas.
Após a centrifugação das placas, use uma multiestação robótica de manuseio de líquidos para transferir 20 microlitros do sobrenadante dos poços em cada placa para uma réplica da placa. Adicione 20 microlitros de dois milimolares de álcool P-metoxibenzílico e 100 milimolares de tampão fosfato de sódio ph 6,0 a cada poço. Mexa as placas brevemente com um misturador de placas de 96 poços e incube-as por 30 minutos em temperatura ambiente.
Em seguida, adicione 160 microlitros do reagant FOX a cada placa de réplica e mexa brevemente com a batedeira. Leia as placas a 560 nanômetros em um leitor de placas. Incube as placas em temperatura ambiente até que a cor se desenvolva.
Meça novamente a absorção. A atividade relativa é calculada a partir da diferença entre o valor de absorção após a incubação e o da medição inicial normalizada para o tipo parental para cada placa. Esta imagem de gel representativa mostra o vetor linearizado na pista dois, o segmento de PCR M1 na pista três, o segmento de PCR M2 na pista quatro, o segmento de PCR HF na pista cinco e o vetor remontado in vivo linearizado com NHE um na pista seis.
Este próximo gel mostra a mini-preparação do plasmídeo do vetor remontado na pista dois, o plasmídeo linearizado com NHE um na pista três, o plasmídeo linearizado com BamH um e XHO um na pista quatro e o plasmídeo linearizado obtido por extração e limpeza de gel na pista cinco. As cargas mutacionais foram ajustadas por amostragem de bibliotecas mutantes com diferentes paisagens, calculando o número de clones com menos de 10% da atividade enzimática parental e verificação adicional por sequenciamento de uma amostra aleatória de variantes ativas e não ativas. Uma avaliação do limite de detecção deste ensaio mostrou que o ensaio foi linear na presença de sorbitol representado por círculos pretos.
Na ausência de sorbitol representado pelos quadrados brancos, a linearidade foi mais persistente, mas a resposta foi mais fraca. Foi observada uma correlação linear entre a concentração de AAO e a absorbância. Uma biblioteca mutante de 2.000 clones foi construída e rastreada com este ensaio.
O quadrado sombreado indica os mutantes AAO com secreção e atividade notavelmente melhoradas contra o álcool P-metoxibenzílico. Uma vez dominadas, as bibliotecas mutantes podem ser feitas em aproximadamente quatro horas se forem executadas corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de atribuir áreas de sobreposição adequadas para cada família de PCR e vetor linearizado para splicing e clonagem in vivo em uma única etapa transformacional.
Seguindo uma abordagem semelhante, outros métodos, como amostragem de DNA in vivo, biblioteca de mutagênese de saturação ou montagem de DNA, podem ser realizados para construir bibliotecas mutantes e/ou vias metabólicas. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para que pesquisadores do campo da bioengenharia explorassem atividades, estabilidades ou mesmo inventassem infinitos tipos de interação. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como aproveitar este dispositivo Saccharomyces Cerevisiae para construção e triagem de bibliotecas
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Visão Geral
Este protocolo descreve a construção e triagem de bibliotecas de mutantes em Saccharomyces cerevisiae para experimentos de evolução direcionada. Ele enfatiza uma abordagem direta que permite uma mutagenese e recombinação eficazes.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biotecnologia
- Engenharia Genética
- Microbiologia
Fundo
- Evolução direcionada é um método usado para desenvolver proteínas com características desejáveis.
- Saccharomyces cerevisiae serve como um organismo modelo para esses experimentos.
- Mutagenese aleatória e recombinação são técnicas-chave nesse processo.
- Algoritmos computacionais auxiliam na seleção de regiões-alvo para mutagenese.
Propósito do Estudo
- Demonstrar um protocolo para criar e triagem de bibliotecas de mutantes.
- Identificar áreas sobrepostas para montagem e clonagem na evolução direcionada.
- Direcionar regiões específicas da oxidase aril-álcool fúngica (AAO) para melhoria.
Métodos Utilizados
- Seleção de regiões-alvo usando algoritmos computacionais.
- Mutagenese aleatória das regiões M1 e M2 da AAO.
- Triagem de bibliotecas de mutantes através de uma única etapa de transformação.
- Avaliação da qualidade dos mutantes resultantes.
Principais Resultados
- Construção bem-sucedida de bibliotecas de mutantes em Saccharomyces cerevisiae.
- Identificação de mutantes eficazes com características desejadas.
- Demonstração da robustez do protocolo.
- Insights sobre o processo de evolução direcionada para AAO.
Conclusões
- O protocolo fornece um método confiável para estudos de evolução direcionada.
- Direcionar regiões específicas aumenta a eficiência da mutagenese.
- Essa abordagem pode ser aplicada a várias proteínas além da AAO.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Directed evolution in yeast enables rapid generation of functional enzyme variants for biotechnological applications, reducing reliance on in vitro steps and accelerating protein engineering timelines. This approach supports target validation by linking genetic modifications to measurable activity improvements in a eukaryotic host. The method enhances predictive confidence in early discovery by providing quantitative, secretion-linked activity readouts relevant to industrial enzyme production.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of structure-guided regions (M1, M2) to clarify functional contributions to enzyme activity.
- Operational Value: Uses overlapping ~50 bp homology arms for seamless in vivo reassembly, minimizing cloning steps and transformation burden.
- Scientific Value: Screens mutant libraries in yeast supernatants using a Fenton-based assay, directly correlating genotype with secreted enzyme function.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Employs a high-throughput, sensitive assay based on P-methoxybenzyl alcohol oxidation to quantify aryl-alcohol oxidase activity in 96-well format.
- Operational Value: Normalizes activity to parental type and uses internal controls (parental strain, negative control) to ensure assay robustness across plates.
- Scientific Value: Detects improved secretion and activity, enabling identification of variants with enhanced performance under screening conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates linearity of assay response with enzyme concentration, supporting reliable quantification across mutant libraries.
- Operational Value: Confirms assay performance in presence/absence of sorbitol, defining working range for accurate hit selection.
- Scientific Value: Validates hits through sequencing of active and non-active clones, linking phenotype to genotype for downstream characterization.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates library construction and functional screening into a discovery workflow from target region selection to hit identification, enabling iterative enzyme optimization campaigns.
- Discovery Biology: Uses computational algorithms to select mutagenesis sites based on AAO structure, focusing evolution on functionally relevant regions.
- Screening: Delivers quantitative, supernatant-based activity readouts that support reproducible, plate-to-plate comparison of mutant function.
- Analytics: Measures relative activity via absorbance shift at 560 nm, normalized to parental strain, enabling objective variant ranking.
- Translational Research: Secretion-linked screening in yeast provides early insight into expressibility and function, relevant for biologics and industrial enzyme development.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable to other eukaryotic genes, avoiding repeated optimization of PCR, recombination, and screening steps.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking targeted mutagenesis to measurable changes in enzyme activity and secretion.
- Operational Value: Achieves library construction and screening in ~4 hours post-transformation, enabling rapid design-build-test cycles.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enriching libraries with functional variants and minimizing false negatives through sensitive detection.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying mutants with improved activity, guiding investment toward promising enzyme candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast molecular biology, PCR optimization, and agarose gel purification for linearized vector preparation.
- Dependent on thermocyclers, gel electrophoresis systems, plate readers, and liquid-handling robots for supernatant transfer and reagent addition.
- Necessitates standardization of overlapping regions (~50 bp) and transformation efficiency to ensure consistent in vivo reassembly across projects.
- Adaptation to other genes may require re-evaluation of homology arm length, mutagenic conditions, and assay compatibility with target enzyme activity.
- Practical limitation: Assay sensitivity depends on substrate choice and buffer conditions; optimization may be needed for enzymes with low activity or alternative reaction mechanisms.
