In Vitro Evolução dirigida de uma endonuclease de restrição com especificidade mais rigorosa

Endonucleases de restrição com nova especificidade de seqüência podem ser desenvolvidas a partir de enzimas que reconhecem uma seqüência parcialmente degenerada. Aqui fornecemos um protocolo detalhado que usamos com sucesso para alterar a especificidade da seqüência da enzima NlaIV. Os ingredientes-chave do protocolo são a compartimentação in vitro da reação de transcrição/tradução e a seleção de variantes com novas especificidades de seqüência.

Nosso protocolo permite a criação de enzimas de restrição com especificidades de sequência alteradas e mais rigorosas usando compartimentação in vitro e uma estratégia de seleção única na evolução direcionada. Potencialmente é bastante universal, pois deve ser aplicável a qualquer restrição endonuclease e seleção pode ser direcionada para qualquer versão mais rigorosa de uma sequência cognato original. Se as variantes recém-criadas forem expressas pela tradução in vitro de transcrição, o protocolo é adequado não apenas para reduzir a especificidade, mas também para alterar a especificidade.

Para decidir locais para mutagênese de subsaturação, escolha frequências de mutagênese de acordo com a importância hipotética dos locais, mantendo em mente os limites da complexidade geral da biblioteca. Para iniciar a síntese, insira colunas que foram embaladas com nova resina no sintetizador. Sintetizar oligonucleotídeos em todas as colunas até o trigêmeo, imediatamente precedendo o segundo local de mutagênese de subsaturação contando a partir do final de três primos.

Sintetizar, deixando um grupo trityl cinco prime no final. O grupo de proteção será removido no início do próximo ciclo de síntese. Abra as colunas de síntese e centrífugue brevemente em tubos secos de 1,5 mililitro para coletar a resina.

Puxe o suporte à síntese do CPG e misture por vórtice. Repartição da resina CPG mista em novas colunas de síntese. Evite introduzir umidade porque diminuirá o rendimento geral.

Continue a síntese, a partir do trigêmeo do local da mutagênese de subsaturação. Atribua colunas a trigêmeos NNS randomizados ou trigêmeos do tipo selvagem de acordo com a frequência de mutagênese desejada. Se houver locais adicionais de subsaturação, prossiga apenas para o trigêmeo anterior ao próximo local de mutagenese de subsaturação.

Se não houver mais locais de subsaturação a jusante, complete a síntese, deixando um grupo trityl cinco primos no final. Use pontas largas de pipeta para preparar uma mistura de surfactante de óleo adicionando 225 microliters de Span 80 e 25 microliters de Tween 80 a cinco mililitros de óleo mineral em um tubo cônico de 15 mililitros. Misture bem por inversão suave 15 vezes.

A mistura nesta etapa deve ser translúcida. Para cada biblioteca, transfira 950 microliters da mistura surfactante de óleo para um frasco criogênico de fundo redondo de dois mililitros. Rotular com um nome de biblioteca e transferir para o gelo.

Coloque uma pequena barra de agitação cilíndrica em cada frasco. Prepare uma mistura de reação de transcrição in vitro de acordo com as sugestões do fabricante. Suplemente a mistura com cloreto de magnésio a uma concentração final de 1,5 milimiliar.

Dispense 50 alíquotas de microliter da mistura de reação em tubos de 1,5 mililitro no gelo. Adicione 1,7 femtomoles da biblioteca à mistura de reação no gelo. Prepare a emulsão água-em-óleo consecutivamente para cada biblioteca, colocando pela primeira vez um pequeno béquer cheio de gelo em um agitador magnético com a velocidade de agitação definida para 1150 RPM.

Em seguida, transfira um frasco criogênico com 950 microliters de mistura surfactante de óleo e uma pequena barra de agitação para um béquer gelado no agitador magnético. Verifique se a barra de agitação está girando. Adicione cinco alíquotas de 10 microliter da mistura de transcrição de transcrição in vitro da biblioteca durante um período de dois minutos em intervalos de 30 segundos e continue mexendo por mais um minuto.

Transfira o frasco com a emulsão para um recipiente de gelo. Neste ponto, o líquido deve ser opaco, não translúcido. Então, prossiga com a próxima biblioteca.

Depois que todas as bibliotecas forem processadas, inicie a incubação de todas as bibliotecas de acordo com as recomendações do fabricante do kit. Transfira os frascos para a temperatura ideal para a endonuclease projetada por mais duas horas antes de colocá-los no gelo por pelo menos 10 minutos. Transfira as emulsões dos frascos criogênicos em tubos de 1,5 mililitro.

Adicione um microliter de 5 EDTA molares. E centrifuá-los a 13.000 vezes g por cinco minutos em temperatura ambiente. Se após a centrifugação você não puder ver claramente a interface água-óleo, congele a mistura antes da aspiração da fase superior do óleo.

Mova a fase superior do óleo com uma pipeta e descarte. Realize imediatamente a extração adicionando 150 microlitadores de clorofórmio fenol e 100 microlitres de 10 mililitros Tris-HCl à fase aquosa. Vórtice e, em seguida, realizar separação de fase através de centrifugação de 30 segundos a 13.000 vezes g.

Colete a fase aquosa superior. Precipitar o DNA adicionando 15 microlitadores de acetato de sódio de três molares, 2,5 a cinco microgramas de glicogênio e 375 microliters de etanol. Depois de incubar as amostras a menos-20 graus Celsius por uma hora, centrífuga por 15 minutos a 13.000 vezes g, quatro graus Celsius.

Descarte o supernasce e lave brevemente a pelota com um mililitro de frio de 70% de etanol. Seque a pelota de glicogênio de DNA em uma vac de velocidade ou secador de ar por mais de cinco minutos. Em seguida, dissolva a pelota em 50 microliters de 10 mililitros Tris-HCl.

Em seguida, adicione cinco microliters de contas magnéticas streptavidin, preparadas de acordo com as instruções do fabricante. Misture por uma hora à temperatura ambiente, de preferência em um misturador de carrossel ou por vórtice suave. Transfira os tubos para um suporte magnético para separar as contas.

Então colete o líquido enriquecido em DNA sem biotina. Este protocolo é uma ferramenta para aumentar a frequência das variantes desejadas de endonucleases de restrição projetada, esgotando enzimas inativas e endonucleases com especificidade de sequência de tipo selvagem inalterada. A triagem bem-sucedida pode identificar até 20% das variantes promissoras.

As variantes são rotuladas como variantes promissoras se produzirem um padrão de decote distinto da enzima do tipo selvagem. Variantes que podem ter alterado a preferência de sequência também são rotuladas. Mostrado aqui é uma triagem mal sucedida com a maioria de variância inativa e uma variante com padrão de decote aparentemente não substituído.

Neste caso, as bibliotecas são provavelmente dominadas por variantes inativas que escaparam da etapa de seleção de captura de streptavidin. É fundamental projetar cuidadosamente as sequências selecionadas e contra-selecionadas e limitar a diversidade da biblioteca pela estratégia mutagênese que gera substituições em apenas algumas posições selecionadas. As melhores variantes selecionadas devem ser completamente caracterizadas para cinéticas de ligação e decote em sequências preferenciais e não rachadas com base nos resultados da triagem inicial.

No nosso caso de teste, os locais de mutagênese foram selecionados com base em um modelo de homologia. Surpreendentemente, uma estrutura de cristal mais tarde mostrou que alguns resíduos alterados provavelmente não estão em contato direto com o DNA.