Microchips de silício para Manipulação de célula-Interação

Olá, sou Elliot Hu.Sou pós-doutorando no laboratório de Tia aqui no Instituto de Tecnologia de Massachusetts. Hoje vamos preparar culturas de células em microchips mecânicos de silício. Os dispositivos parecem pequenos pentes que se encaixam e nos permitem manipular com precisão as interações entre duas populações diferentes de células.

Hoje vamos estudar a interação entre hepatócitos hepáticos e células estromais de suporte. Especificamente, três células de fibroblastos T três são cultivadas na superfície superior dos pentes, de modo que, deslocando os dedos do pente, você pode mover as células e alterar seu arranjo espacial. Cada dispositivo é dividido em duas partes que se encaixam em duas configurações possíveis.

O primeiro coloca as duas populações de células em contato uma com a outra. O segundo separa ligeiramente as duas populações para que as células não possam se tocar. Aqui, as interações de contato são evitadas, mas as interações por meio de fatores secretados são preservadas.

Vamos começar falando sobre como manusear as peças com pinças. Eu gosto de usar pinças de Teflon maiores, bem como pinças de metal de ponta redonda menores. Com as pinças maiores, você pode pegar as partes nas bordas assim com as partes maiores com os braços, você tem que ter cuidado para não quebrar os braços porque eles são muito frágeis.

Então você quer pegá-los na parte de trás da peça assim. Com as pinças de metal, você pode alcançar o orifício e pegar os cavacos diretamente. As partes maiores caberão em uma parede de uma placa de 12 poços, enquanto as partes menores caberão em uma placa de 24 poços ou podem ser emparelhadas com a parte maior.

Em uma placa de 12 poços, geralmente eu uso a pinça de metal. Quando manuseio as peças nas placas para encaixar duas partes, geralmente coloco a parte maior no poço primeiro e empurro totalmente para o lado. Então eu pego o reparo de cortesia e coloco do outro lado do poço, e eu os empurrei juntos pegando duas pinças, uma em cada buraco.

Então, agora eu posso simplesmente travar as peças juntas, seja na configuração de folga ou na configuração de contato. Se eu quiser desmontar as peças, gosto de puxar as peças para a configuração de folga e, em seguida, puxar verticalmente para remover a peça. Agora os dispositivos são feitos de silicone, então eles precisam ser revestidos para permitir a adesão adequada das células.

Você provavelmente receberá os dispositivos já revestidos com poliestireno e plasma tratados, então vamos supor que esse seja o nosso ponto de partida. Em primeiro lugar, vamos usar colágeno para revestir a superfície à qual os hepatócitos se ligarão. Vamos colocar os favos de hepatócitos em 50 microgramas por moinho de colágeno, uma solução e incubar a 37 C por 45 minutos.

Os pentes de fibroblastos, por outro lado, não precisamos revestir. Após a incubação, aspiramos a solução de colágeno e lavamos e regamos. Agora vamos travar o ES em contato com peças complementares para formarmos uma superfície plana para a semeadura celular.

Primeiro, vamos encher alguns poços com 70% de etanol. Vou colocar um par em cada poço e depois prendê-los. Depois de travar, queremos examinar as partes sob o microscópio para ter certeza de que são coplanares.

De vez em quando, as peças podem travar desalinhadas. E no microscópio você verá que eles estão em dois planos focais diferentes. Nesse caso, basta separar as peças e juntá-las novamente Depois de verificar se o alinhamento está bom, deixamos as peças descansarem no etanol por um tempo para esterilizar.

Muitas vezes estou com pressa, então fico de molho por 10 minutos. Após a esterilização, precisamos enxaguar. O etanol aspira e lava completamente em água, depois aspira e lava novamente em água e, finalmente, aspira a água e substitui pelo meio de cultura.

Agora vamos semear células nos dispositivos. Normalmente, suspendemos as células a uma concentração de 500.000 células por mililitro e pipetamos uma suspensão de mililitro sobre cada par de favos usando uma placa de 12 poços. Então, semeamos os fibroblastos a 500.000 células por mililitro em dois dos poços.

Da mesma forma, pegamos uma suspensão de 500.000 hepatócitos por poço e os semeamos nos outros dois poços. Agora, antes de incubar, vamos sacudir bem as células para garantir que elas estejam distribuídas uniformemente. E eu gosto de agitar três vezes verticalmente, três vezes horizontalmente e depois repetir isso três vezes.

Depois de agitar, vamos colocá-lo na incubadora e deixar as células descansarem por 15 minutos, momento em que vamos sacudi-las novamente. Depois de agitar a cada 15 minutos por uma hora, vamos aspirar a suspensão da célula e jogar em uma nova suspensão de células. E vamos repetir isso até que tenhamos uma camada confluente de células.

Normalmente com fibroblastos, são necessários um ou dois assentos. E com hepatócitos pode levar de dois a quatro assentos. Para obter uma monocamada confluente, as células são assentadas em uma densidade bastante alta, agitando, garante que as células sejam distribuídas uniformemente.

Após o primeiro assento, uma camada esparsa de células é formada. Observe que as células só se ligam aos dedos que foram revestidos com poliestireno e colágeno. Depois de semear células frescas e incubar por mais uma hora, novamente com agitação a cada 15 minutos, a camada celular fica mais densa.

Após a terceira semeadura, temos uma boa densidade celular e agora podemos parar depois que as células foram semeadas nos favos. Queremos manipular as células na configuração experimental desejada. Os dispositivos agora são separados de suas partes complementares e incubados por 24 horas.

Após 24 horas, as células se espalharam para formar uma monocamada confluente sobre a superfície dos favos. Agora queremos formar uma co-cultura. O pente de hepatócitos e o pente de fibroblastos agora são transferidos para o mesmo poço e travados juntos na configuração inicial desejada.

Se desejar. Após um determinado período de tempo, você pode alterar a configuração. Por exemplo, podemos passar para a configuração de folga após 18 horas, as peças são colocadas na mesma, bem unidas até que a configuração da lacuna seja alcançada e, em seguida, empurradas para o contato de volta para a configuração da lacuna.

E agora vamos remover um pente. O que vamos fazer agora é passar pelo processo de remoção do revestimento antigo de poliestireno, limpar os chips e, em seguida, colocar um novo revestimento de poliestireno e prepará-lo para a cultura de células. Novamente, ao remover o antigo revestimento de poliestireno e colocar uma nova camada, garantimos que nada da história do experimento anterior interfira em um novo experimento.

Então, depois de terminar seu experimento, a primeira coisa que você quer fazer é branquear suas células e depois enxaguar seus pentes e água. Portanto, antes de colocar as batatas fritas no dedo do pé, certifique-se de que estejam completamente secas. Então, aqui temos alguns pentes que acabei de deixar secar ao ar por um tempo e verificar se estão completamente secos.

E agora vamos pegar um pouco de toing e colocá-lo neste alto-falante de vidro. Vou usar uma pipeta de vidro aqui para não dissolvê-la. O Halloween dissolve o plástico, então não podemos usar uma pipeta típica de poliestireno.

Ok, isso é o suficiente. E agora vamos pegar algumas dessas peças, colocá-las no dedo do pé, e eu vou ligar a coqueteleira para agitar e vamos cobri-la com papel alumínio para evitar que o tolueno evapore. Então, depois de duas horas, o tolueno deve ter dissolvido a maior parte do poliestireno nos favos, e podemos simplesmente retirá-los e secar os pentes ao ar.

Após o enxágue de Halloween, as peças devem estar relativamente livres de poliestireno e relativamente limpas. No entanto, precisamos que as peças estejam extremamente limpas para que a nova camada de poliestireno forme uma boa adesão se não estiverem extremamente limpas. A poli ty tende a descascar no meio do experimento, quando as células começam a puxá-la.

Então, o que vamos fazer agora é uma limpeza ácida de piranha. Coloquei as peças em um alto-falante de vidro e vamos aquecê-lo. Então, vamos colocar uma chapa quente.

E aqui temos ácido sulfúrico e peróxido de hidrogênio. Vou derramar o ácido sulfúrico primeiro e, aqui, certifique-se de que todos os chips estejam imersos sob o fluido. Às vezes, eles têm uma tendência a flutuar.

E também agora que estamos trabalhando com produtos químicos bastante corrosivos, certifique-se de usar o equipamento de proteção certo. Aqui. Estou usando luvas de nitrilo. Agora vamos derramar o peróxido de hidrogênio no ácido e apenas tomar cuidado aqui porque é uma reação exotérmica.

Então você pode ver que está fumando um pouco à medida que reage, mas queremos adicionar um pouco de energia ao sistema para torná-lo ainda mais reativo. Então, agora vamos aquecê-lo até 120 graus Celsius a cerca de 20 agora, para que você possa ter certeza de que quaisquer restos de sua cultura de células serão completamente limpos de seus chips. Então, neste ponto, você quer apenas deixar a reação seguir seu curso completo até que todo o peróxido de hidrogênio seja consumido.

E nesse ponto, a mistura vai parar de borbulhar. Portanto, a reação leva cerca de meia hora para seguir seu curso. E depois de parar de ver as bolhas, você pode simplesmente desligar a placa quente e deixá-la esfriar.

E vamos transferi-los para uma água curva BAK. E, mais uma vez, certifique-se de usar uma pinça de Teflon aqui, não de metal, e você pode simplesmente pegá-las e transferi-las. Então, agora vamos enxaguá-lo sob um fluxo constante de DDH, dois O.I geralmente o pegamos direto do Meine e vamos deixá-lo funcionando por pelo menos 10 minutos aqui.

E ao fazer isso, vamos lavar todos os vestígios de ácido depois de picar sob uma corrente de água por 10 minutos. O ácido deve ser removido novamente dos chips, e vamos apenas armazená-los debaixo d'água até o momento em que estivermos prontos para revestir o poliestireno de 45.000 poliestireno de peso molecular que obtivemos da Sigma. E vamos pesar uma pequena quantidade disso aqui.

Temos 400 miligramas e vamos dissolvê-lo em tolueno a 100 miligramas por mililitro. Portanto, o tolueno precisa ser manuseado no capô. E a outra coisa é que, como vamos usar um tolueno para dissolver o poliestireno, queremos ter certeza de que não usaremos nenhum desgaste de laboratório feito de poliestireno.

Então, aqui estamos usando polipropileno, cônico e uma pipeta de vidro. Então, como eu tenho 400 miligramas de poliestireno, vou colocar quatro mililitros de dedo do pé, e agora vamos vortex por meia hora até que a poliestirina se dissolva. Então, agora vamos apenas vórtice do tubo na velocidade mais baixa por cerca de 20 minutos a meia hora.

Então, vou conectar o tubo aos vórtices. Eu não tenho que segurá-lo lá o tempo todo. Após 20 a 30 minutos, o poliestireno deve ser dissolvido e estamos prontos para revesti-lo.

Agora vamos revestir o poliestireno em nossas instalações. Nosso codificador de rotação está em uma instalação de sala limpa. E aqui temos que usar um boné, óculos, um vestido, botas e luvas, mas isso pode não ser o mesmo em suas instalações.

Antes de usarmos este mandril, quero protegê-lo do poliestireno. Então, vamos cobri-lo com papel alumínio e queremos deixá-lo o mais plano possível na superfície para que o chip possa ficar nivelado com a superfície. Vamos fazer um pequeno orifício bem no centro para que possamos manter o vácuo no chip.

O codificador de rotação é definido para 2.400 RPM e 30 segundos. Agora podemos pegar um de nossos chips, colocá-lo de forma que o centro do chip cubra o buraco, e eu vou desligar o aspirador primeiro quando colocar o poliestireno, ligar o aspirador e começar a girar. Então, para as partes menores, podemos colocar menos de 10 gotas.

E para as partes maiores, são necessárias um pouco mais de 10 gotas de poliestireno. E vamos girá-lo por 30 segundos a 2.400 RPM. Agora vamos pegar os chips revestidos de poliestireno e colocá-los no forno a 120 graus C. Isso está acima do ponto de transição vítrea do poliestireno.

Então, ele vai refluir a superfície para alisá-la um pouco, e também vai densificar e endurecer o plástico. Então, geralmente eu deixo no forno durante a noite. Provavelmente leva pelo menos algumas horas para o processo ser concluído.

Então, depois de um cozimento durante a noite, os chips estão prontos para o tratamento com plasma. Agora vamos expor o poliestireno a um plasma de oxigênio, e isso vai mudar a energia da superfície para que proteínas e células grudem melhor nele. Então, vamos apenas carregar os chips na câmara de plasma e bombeá-los para o vácuo.

Uma boa configuração para usar é 200 mil, tour de vácuo e 200 watts de potência por um minuto sob um fluxo de gás oxigênio. Agora que o sistema está bombeado, vamos introduzir o oxigênio. Ok, agora podemos ligar a energia de RF, atingir o plasma por um minuto.

Então, quando o plasma está funcionando, ele realmente brilha. É como uma lâmpada fluorescente. Após um minuto de exposição ao plasma, vamos trazer a pressão de volta para a atmosfera e podemos retirar as peças.

Agora as peças estão prontas para revestimento de proteínas e alimentação celular. O objetivo ao projetar este dispositivo era que pudéssemos manipular a microarquitetura do tecido de forma dinâmica. Portanto, a microorganização do tecido no corpo, especificamente onde as células são colocadas umas em relação às outras, é muito importante para determinar a função de cada célula em particular na cultura de laboratório.

Até recentemente, não fomos capazes de fazer um bom trabalho em replicar isso, mas nos últimos cinco ou 10 anos, as pessoas começaram a ser capazes de micropadronizar células em um substrato de cultura de tecidos, colocando assim as células exatamente onde queremos tê-las em uma placa de cultura de tecidos. E, ao fazê-lo, foram capazes de descobrir alguns aspectos importantes da biologia básica das interações celulares em escala micro. Agora, o que não conseguimos fazer até agora é fazer isso dinamicamente.

Isso é mudar a organização de uma cultura de células no meio do seu experimento. E isso é importante porque no corpo, o tecido não é realmente um ambiente estático. Temos células que se movem e se reorganizam, principalmente na cicatrização ou desenvolvimento de feridas.

Mas mesmo em um órgão normal em homeostase, há muitas coisas se movendo. O aspecto técnico mais difícil de aprender é como comer fisicamente as peças. E inicialmente, quando você começa a trabalhar com o sistema, pode ficar intimidado com o quão frágeis são as partes ou quão pequenas são as emoções que você precisa criar.

Mas acho que se você praticar com ele por um tempo, não deverá ter muitos problemas. Alguns dos lugares onde vemos este dispositivo tendo um papel, por exemplo, no desenvolvimento embrionário, as células entrarão em contato com uma série de ambientes celulares diferentes à medida que as células brotam através de várias camadas embrionárias. E sabe-se que as interações com cada uma das camadas, à medida que entram em contato sequencialmente, nos empurram ainda mais ao longo de um caminho de diferenciação específico.

E então achamos que esse tipo de dispositivo pode ser bom para tentar replicar esse tipo de evento no laboratório. Um dos aspectos da micro-organização que queríamos particularmente observar era a diferença entre as células que se comunicam por meio de interações de contato, onde as membranas celulares podem se retocar umas nas outras, versus fatores solúveis que são secretados no meio circundante que se difundem para uma célula que está um pouco mais distante. E muitas vezes, quando as células estão em co-cultura e afetam umas às outras, não está claro se essas são ou não interações de contato ou fatores secretados que estão desempenhando o papel.