Um chip microfluídico para a Versátil Análise Química de células individuais

O objetivo geral do experimento a seguir é analisar lisados de células únicas usando fluorescência ou imunoensaios. Isso é conseguido criando primeiro um dispositivo microfluídico e revestindo a câmara interna com anticorpos. Em seguida, células individuais são imobilizadas nas armadilhas e expostas a vários reagentes para estimular uma resposta celular em uma segunda etapa.

Uma válvula em forma de anel é rapidamente fechada e o tampão de lise flui através do dispositivo. A válvula em forma de anel é aberta por um curto período de tempo e as células são lisadas dentro da microcâmara, permitindo que as proteínas liberadas se liguem aos anticorpos em alta concentração devido ao pequeno volume. Em seguida, a válvula em forma de anel é aberta.

A câmara é lavada e os reagentes de detecção são introduzidos na microcâmara fechada. O aumento da intensidade de fluorescência é monitorado ao longo do tempo usando um microscópio de fluorescência, os resultados demonstram a capacidade deste sistema de detectar quantitativamente e de forma confiável um analito de interesse liberado de células individuais. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da análise de células A únicas.

Em particular, fez investigações sistemáticas sobre a resposta celular a variações no ambiente químico. Podemos ver as regulações para cima ou para baixo das moléculas intracelulares como resultado do estímulo químico. Existem duas vantagens principais dessa técnica.

A primeira é que podemos expor as células imobilizadas a um ambiente químico definido que é constante ou muda periodicamente. Em segundo lugar, podemos reformar a análise altamente sensível e específica do estado sem qualquer contaminação cruzada ou perda de analitos devido ao transporte. Para começar, fabrique os três diferentes SU oito wafers mestres, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha.

Um será usado para criar a camada fluídica, um para a camada de controle e um terceiro para o carimbo de microcontato. Em seguida, fabrique os chips microfluídicos começando com a preparação de uma mistura de 10 para um de PDMS e um agente de cura. Misture as duas partes vigorosamente e desgaseifique a solução por 30 minutos ou até que a mistura esteja livre de bolhas.

Em seguida, coloque o wafer dentro da camada de controle dentro de uma placa de Petri e cole-o no fundo. Despeje aproximadamente 50 gramas de PDMS por cima para criar uma camada de quatro a cinco milímetros de espessura e coloque o wafer por pelo menos duas horas em um forno a 80 graus Celsius para garantir a cura completa do PDMS. Repita o mesmo procedimento para o wafer de impressão de microcontato, mas use aproximadamente 20 gramas de PDMS em vez de 50, resultando em uma camada de quatro a cinco milímetros de espessura de PDMS.

Para preparar a camada inferior, gire uma camada de PDMS de 40 mícrons de altura no wafer com a camada microfluídica. Usando uma velocidade de rotação de 2000 RPM por 60 segundos. Catalise a camada de PDMS em um forno por uma hora a 80 graus Celsius quando todas as peças estiverem curadas.

Remova a camada de controle do wafer e corte-o em pedaços com o auxílio da lâmina de barbear. Em seguida, faça furos de conexão de pressão usando uma punção de biópsia de um milímetro e cubra os canais com fita adesiva para armazenamento. Em seguida, remova o PDMS sobre o wafer de impressão de microcontato e prepare selos do tamanho da área da câmara.

Guarde-os sem poeira em uma gaveta até o uso. Em seguida, coloque o wafer revestido por rotação e a camada de controle de quatro a cinco milímetros de espessura em um limpador de plasma. Exponha as peças a 18 watts por 45 segundos usando plasma de oxigênio a 0,75 milibar.

Após o tratamento com plasma, alinhe rapidamente ambas as camadas sob um microscópio com uma grande distância de trabalho. Adicione alguns PDMS sobressalentes ao redor das partes superiores colocadas para facilitar a remoção do PDMS do wafer. Em seguida, coloque o wafer em um forno a 80 graus Celsius por pelo menos uma hora.

Uma vez curado, use um bisturi para remover cuidadosamente o PDMS do wafer e para cortar os orifícios de acesso dos microchips para as conexões fluídicas com uma punção de biópsia de 1,5 milímetro. Além disso, crie um reservatório no microchip cortando a parte superior de uma ponta de pipeta de 200 microlitros e usando um pouco de PDMS semicurado sobressalente. Cole por cima.

Em seguida, catalise o chip no forno a 80 graus Celsius por pelo menos uma hora. Comece limpando uma lâmina de vidro e peças PDMS. Limpe uma lâmina de vidro com sabão.

Enxágüe com água destilada e depois novamente com etanol. Seque a lâmina usando um jato de nitrogênio. Use fita adesiva para remover quaisquer detritos e partículas de poeira do PDMS.

Em seguida, coloque a parte PDMS e o vidro limpo. Deslize para o limpador de plasma por 45 segundos a 18 watts para garantir uma ligação firme, coloque o chip em uma placa quente por cinco minutos após o tratamento com plasma Após a colagem, corte a parte inferior de algumas pontas de pipeta de 200 microlitros. Encha-os com 10 a 15 microlitros de PBS filtrado com 4%BSA e coloque-os nas entradas do dispositivo.

Em seguida, use pontas cortadas com adição de 10 a 15 microlitros de PBS e coloque-as nos canais de controle. Em seguida, coloque os cavacos na centrífuga e gire-os a 800 vezes a gravidade por cinco minutos para encher os canais com fluido. Se o ar permanecer em qualquer um dos canais, repita esta etapa até que os canais estejam completamente cheios.

Incube a solução de bloqueio por pelo menos 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, lave a solução da camada de fluido com PBS a uma taxa de fluxo de 10 microlitros por minuto. Usando uma bomba de seringa, o dispositivo agora está pronto para experimentos com células para pré-imprimir a lâmina de vidro para imunoensaios incubar selos de impressão de micro contato PDMS com BSA 0,5% biotinilado em uma placa de Petri limpa.

Após meia hora, limpe os selos completa e rapidamente com água destilada e seque o carimbo sob uma corrente de nitrogênio. Depois de secos, coloque rapidamente os selos em uma lâmina de vidro limpa para depositar o BSA biotinilado padronizado. Não mova o carimbo após a colocação e verifique se o carimbo está em contato com a lâmina de vidro.

Se não for levemente, toque no carimbo, mas não pressione com força. Em seguida, coloque o carimbo junto com a parte superior do chip microfluídico na câmara de plasma e exponha-os ao plasma de oxigênio a 18 watts por 45 segundos. Após o tratamento com plasma, remova o carimbo da lâmina de vidro.

Respirar na superfície tornará o padrão visível. Alinhe as microcâmaras na parte superior da superfície impressa. Uma vez alinhado, coloque o chip em uma placa quente a 50 graus Celsius por 30 minutos para bloquear a superfície restante, introduza uma solução BSA filtrada a 4% estéril em PBS no chip com uma centrífuga como mostrado anteriormente, incube o microchip por pelo menos 30 minutos e, em seguida, lave a solução da camada de fluido com PBS a uma taxa de fluxo de 10 microlitros por minuto.

Usando uma bomba de seringa, use o chip diretamente ou armazenado por até duas semanas a quatro graus Celsius em uma caixa úmida. Em seguida, crie uma superfície de ligação totalmente funcional introduzindo avadon em PBS no reservatório. Flua a solução para puxar o avadon através dos canais de fluido depois.

Enxágue bem o reservatório e lave os canais com PBS. Em seguida, adicione a proteína G ao reservatório e puxe-a pelos canais. Lave o excesso de proteína G enxaguando o reservatório e o chip com PBS.

Em seguida, adicione o anticorpo de interesse ao reservatório e flua-o pelos canais. Em seguida, interrompa o fluxo para permitir a ligação antes de lavar os canais com PBS fluorescente, análogos rotulados podem ser usados para verificar a qualidade do processo de impressão antes de introduzir células nos canais. Colha as células aderidas, como as células HE 2 9 3 mostradas aqui, usando tampão de dissociação livre de enzimas e, em seguida, filtre-as para reduzir o número de aglomerados de células, uma vez filtradas, carregue-as em uma seringa.

A 300.000 células por mililitro, carregue as células no chip usando o fluxo direto na bomba da seringa por cerca de três minutos a uma taxa de 10 a 20 microlitros por minuto para células adesivas como essas, a fim de evitar a fixação não específica das células quando as armadilhas são preenchidas, feche as câmaras pressurizando a camada superior com três barras. Em seguida, examine as câmaras usando um microscópio. Se muitas células aderirem de forma não específica à superfície dentro das câmaras, abra-as rapidamente e tente lavá-las com tampão de dissociação celular a uma taxa de fluxo de 10 a 30 microlitros por minuto.

Para o ensaio de glicose seis fosfato desidrogenase ou G seis PDH, adicione duas matrizes milimolares de glicose, seis fosfato 0,5 milimolar e um DP 0,5 unidades por mililitro de diâmetro e 0,3 milimolar RIN a um tampão de lise e certifique-se de que esteja bem misturado. Uma vez que os canais são limpos, puxe o tampão de lise G seis PDH através do chip a uma taxa de fluxo de 30 microlitros por minuto. À medida que o tampão de lise está fluindo, abra e feche rapidamente as câmaras, deixando-as abertas por 500 milissegundos para permitir que a lise entre na câmara imediatamente após o início da lise para monitorar a reação cinética.

Neste exemplo, um produto fluorescente pode ser monitorado ao longo do tempo. Aqui é mostrada uma série de câmaras que foram preenchidas com corante alimentar laranja e depois fechadas pressurizando a camada de controle acima das microcâmaras. Após o fechamento da câmara, o corante alimentar verde foi enxaguado através dos canais para mostrar o aperto das câmaras.

Cada câmara contém um volume de apenas 625 picolitros de fluido que mantém a concentração de moléculas liberadas das células lisíticas alta o suficiente para análise. Além disso, as válvulas podem ser abertas e fechadas de forma a eliminar a contaminação cruzada entre as câmaras. Dentro dessas câmaras, é possível medir analitos como a quantidade de lisossomo liberada de uma única célula U 9 37 ativada por PMA, pois catalisa enzimaticamente a produção de uma molécula fluorescente dentro da câmara.

As linhas verdes representam a mudança na intensidade da fluorescência ao longo do tempo para câmaras ocupadas por uma célula. Também é mostrada a intensidade de fluorescência para uma câmara sem células representada pela linha pontilhada preta. Para comparação, este ensaio mostra o efeito de uma molécula tóxica na integridade da membrana, medindo uma enzima intracelular G seis PDH.

A linha preta representa as amostras de controle sem influência tóxica, enquanto a linha laranja representa as células influenciadas pela toxina mostrada. Aqui está um exemplo de imunoensaio para a proteína intracelular. Os anticorpos anti GFP foram imobilizados na superfície e, uma vez que as células foram lisadas, a cinética de ligação das proteínas GFP foi visualizada usando microscopia de turfa.

O tempo 0,1 marca a introdução do tampão de lise no tempo 0,2 GFP está começando a se acumular na superfície, o que significa que a lise celular ocorreu e a GFP se difundiu para a superfície. A ligação da GFP aos anticorpos é concluída no tempo 0,3. Neste exemplo final, GA DH liberado ligado para capturar anticorpos na superfície e, em seguida, anticorpos de detecção acoplados a HRP foram adicionados.

Uma vez que todos os anticorpos de detecção não ligados foram lavados, o reagente de detecção foi introduzido e a reação foi ao longo do tempo. Aqui está uma comparação da quantidade de GA DH anteriormente intracelular em quantidades de animais entre células U 9 37 e HEC 2 93 medidas usando este método. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar os chips microfluídicos, como modificar a superfície para permitir imunoensaios e, finalmente, como usar o dispositivo para análise de células únicas.

Este método pode ser empregado para ajudar a responder a muitas perguntas desencadeadoras no campo da biologia celular única.