Name: Um chip microfluídico para a Versátil Análise Química de células individuais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 41 s
Description: Aprenda a analisar lisados de células individuais usando ensaios de fluorescência ou imunoensaios em um chip microfluídico. Este método permite quantificar proteínas intracelulares com alta sensibilidade.

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Os autores agradecem Tom Robinson para leitura de prova do manuscrito, C. Bärtschi e H. Benz para a construção do sistema de controle de pressão custom-built. Gostaríamos também de agradecer o uso da instalação de sala limpa primeiro e Microscopia de Luz Center (LMC), ambos na ETH Zürich. O trabalho foi financiado pela Merck Serono e do Conselho Europeu de Investigação (ERC) no âmbito do 7 º Programa-Quadro (ERC Começando Grant, projeto n º. 203428, nμLIPIDs).

1. SU-8 Fabricação mestre Prepare dois moldes mestres para os canais (fluídicos e controle, para esquemas e dimensões veja a Figura 2) com o seguinte protocolo, mas com diferentes padrões de máscara. O processo é mostrado na Figura 3a. <ol><li> Começar por aquecimento de uma bolacha de silício de 4 polegadas por 10 min a 180 ° C. Carregue o wafer desidratado em um spin-coater e use o seguinte protocolo para spin-coating SU-8 de 2015: <ol><li> Gire wafer a 100 rpm por 20 s (tampa aberta de spin-coater, dispensar SU-8 durante esta etapa, feche a tampa depois da dispensa). </li><li> Wafer de rotação a 500 rpm durante 10 seg (isto vai espalhar a resistir ao longo de toda a bolacha). </li><li> Wafer de rotação a 1750 rpm durante 30 seg (define a altura do resistir a 20 um). </li></ol></li><li> Retirar resistir a partir da borda da pastilha com acetona (usar um cotonete) como esta vai ficar de outro modo para a placa de aquecimento no passo seguinte. Transfira a bolacha para ahotplate a 95 ° C e aquecer durante 4 min. Após a softbake, expor a resistir através de um photomask colado Sodalime vidro em um alinhador de máscara com luz UV (150 mJ / cm 2, medido a 365 nm). </li><li> Após a exposição, aquecer a bolacha novamente a 95 ° C durante 5 minutos numa placa de aquecimento. Refresque-se a hóstia para RT e depois mergulhe em um banho de SU-8 desenvolvedor para 4 min. Agite suavemente para remover não exposto SU-8. Lave o wafer com sala limpa classe isopropanol e seque com nitrogênio. Verifique sob um microscópio se o desenvolvimento foi bem sucedida (especialmente as armadilhas de células). Se as armadilhas de células estão completamente desenvolvidos, a reflexão da bolacha de silício deve ser visível. Se for necessário, realizar a bolacha de novo durante alguns minutos. </li><li> Cozer a bolacha numa estufa durante 2 horas a 180 ° C para remover todo o dissolvente residual. Verifique a altura dos canais com um perfilador passo. Se a altura é diferente da altura desejada, repita este protocolo começando no passo 1.1 com uma nova bolacha emudar o spin-velocidade (passo 1.1.3). Finalizar a fabricação do molde mestre de silanização o wafer com 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorodecilo-dimethylchloro-silano num exsicador durante a noite. </li></ol> 2. Fabricação Mestre para impressão microcontact <ol><li> De modo a preparar moldes de mestre para impressão microcontact, desidratar uma bolacha de silício de 10 min a 180 ° C. Gire-coat 1 ml HDMS para esta wafer a 7.500 rpm por 30 segundos (a resistir adere melhor a uma superfície silanizada). Spin-coat 2 ml de AZ1518 resistir positivo com este protocolo: <ol><li> Dispense estática da resistência sobre a bolacha. </li><li> Gire wafer por 5 segundos a 500 rpm. </li><li> Gire wafer por 60 segundos a 4000 rpm. </li></ol></li><li> Após 50 seg softbake a 100 ° C numa placa de aquecimento, expor a resistir à luz UV (21 mJ / cm 2 de 365 nm) através de uma fotomáscara e em um alinhador de máscara. Desenvolver a resistir em um banho de AZ 726 por 75 seg. Lavar o wafer desenvolvido com DI-água e golpe dry com nitrogênio. Remover o solvente residual por aquecimento da bolacha a 115 ° C durante 50 seg. Silanizadas a bolacha sob vácuo durante a noite. </li></ol> 3. Fabricação do chip microfluídico A concepção do dispositivo de duas camadas é utilizada para estas experiências. As duas camadas são preparadas separadamente e são ligados em conjunto, antes de o chip é finalmente ligado sobre uma lâmina de vidro (Figura 3b). Este passo descreve a produção de camadas de PDMS e o selo PDMS para impressão microcontacto. <ol><li> Prepare uma mistura de PDMS 10:01 e agente de cura. Prepare aproximadamente 80 g de PDMS no total (usando nossos projetos, isso irá resultar em 10 fichas). Misturar ambas as partes vigorosamente e desgaseifique os PDMS até que a mistura está livre de bolhas (~ 30 min). </li><li> Coloque o wafer com a camada de controle dentro de uma placa de Petri e fita-lo para o fundo. Em seguida, despejar ~ 50 g de PDMS em cima e colocar a bolacha durante pelo menos 2 horas numa estufa a 80 ° C para assegurar completacura do PDMS. Repetir o mesmo procedimento para a bolacha impressão microcontact, para este ~ 20 g PDMS é necessário. </li><li> Spin-revestimento PDMS sobre a bolacha com a camada fluidificada, a uma velocidade de rotação de 2000 rpm de modo a formar uma camada de elevada PDMS aproximadamente 40 pm. Curar o PDMS numa estufa durante pelo menos 1 hora a 80 ° C. </li><li> Quando as duas partes são curados, remover a camada de controlo da bolacha e cortado em pedaços com uma lâmina de barbear. Faça furos de conexão pressão usando uma biópsia perfurador de 1 mm. Para o armazenamento, é aconselhável colocar um pedaço de fita adesiva sobre os canais. </li><li> Para unir as duas camadas, tomar a hóstia spin-revestido e a parte de cima e colocá-los em um aspirador de plasma 23. Após o tratamento de plasma, alinhar rapidamente as duas partes em um microscópio com grande distância de trabalho. Adicione algumas peças PDMS em torno das peças principais colocados. Este passo não é obrigatório, no entanto, que facilita a remoção do PDMS da bolacha. Coloque a bolacha num forno a 80 ° C durante pelo menos 1 hr. </li><li> Usar um bisturi para remover cuidadosamente o PDMS da bolacha e para cortar os microchips. Faça furos de acesso para as ligações fluídicas com uma biópsia perfurador de 1,5 mm. </li><li> O chip PDMS está terminada e pode ser armazenado durante meses. Opcional: Se o chip é utilizado com um reservatório, cortar a parte superior de uma pipeta de ponta de 200 ul e utilizar alguns de reposição, PDMS semi-curado a mantê-la no topo. Colocar o chip no forno novamente a 80 ° C durante pelo menos 1 hr. </li></ol> 4. Colagem de lâmina de vidro Para usar o dispositivo para ensaios enzimáticos directos, a única etapa necessária após a ligação é o bloqueio das superfícies. Para este protocolo, proceder à A. No entanto, para usar o chip de microfluídica para imunoensaios ou ELISA, consulte o protocolo B para restringir os locais obrigatórios apenas para a lâmina de vidro (ou seja, para a microscopia TIRF ou SPR). Se essa restrição não é importante, referem-se a A, mas use conjugados biotinilados no passo 4.3 e continue com o passo 4.8no protocolo B para criar uma superfície totalmente funcional. Antes de realizar o protocolo A e B: É aconselhável filtrar todas as soluções de proteína utilizadas antes de os introduzir no chip. Detritos e agregados de proteína podem de outra forma bloquear armadilhas de células, reduzindo desse modo o número de câmaras, que podem ser utilizados para a análise. Para esta finalidade, utilizam uma unidade de filtro de absorção não proteico para filtrar todas as soluções antes de introduzi-las no interior dos canais. Um protocolo (ELISA) <ol><li> Para finalizar o dispositivo micro, unir as partes PDMS sobre uma lâmina de vidro. Para isso, em primeiro lugar limpar a lâmina de vidro com sabão, água destilada e etanol. Seque a lâmina utilizando uma corrente de azoto. Limpe a parte de PDMS com fita adesiva. </li><li> Coloque a parte PDMS ea lâmina de vidro limpa para o limpador de plasma por 45 segundos a 18 W. Para assegurar uma ligação apertada, colocar o chip em uma placa quente (100 ° C) por 5 min. </li><li> Após a colagem, preencher o chip com fLUIDs. Uma maneira fácil de fazer isso é usar a força centrífuga. Corte a parte inferior de 200 mL ponteira. Para os canais de fluidos, enchê-los com a solução de bloqueio (albumina de soro de bovino (4% w / v), ou poli-L-lisina) glicol de polietileno enxertado (0,05% w / v) e colocar as pontas para as entradas. Encha as entradas de controlo de camada com água ou com uma solução isosmótica, por exemplo, PBS. Colocar o chip no centrifugador (800 xg) durante 5 min. Os canais devem ser agora preenchido com fluido completamente. Se não, repita este passo. </li><li> Incubar a solução de bloqueio durante, pelo menos, 30 minutos à temperatura ambiente. Lava-se a solução para fora da camada de fluido com PBS a uma taxa de fluxo de 10 mL / min usando uma bomba de seringa. O dispositivo está pronto para experimentos com células. </li></ol> Protocolo B (imunoensaios) Para uma visão completa da modificação da superfície do passo 4.7 em diante, por favor, consulte a Tabela 1. <ol start="5"><li> EmPDMS Cubate selos para impressão microcontact com uma solução BBSA / BSA (por exemplo, 1-100). Após 30 min, limpar os selos cuidadosamente com água destilada e secar o selo, sob uma corrente de azoto. Colocar rapidamente os selos em uma lâmina de vidro limpa (Figura 4). </li><li> Expor a lâmina de vidro com o selo junto com a parte superior do chip microfluídico de plasma de oxigênio por 45 s na potência máxima (18 W) em um aspirador de plasma. Após o tratamento por plasma, remover o selo e alinhar a superfície impressa debaixo microchambers do dispositivo. Colocar o chip durante 30 min sobre uma placa quente a 50 ° C. </li><li> Para bloquear a superfície restante, introduzir solução esterilizada por filtração de BSA (4% (w / v) em PBS) para o chip com uma centrífuga (ver passo 4.2). Incubar durante 1 hora e lava-se a solução para fora da camada de fluido com PBS (ver passo 4.3). O chip pode, então, ser utilizada directamente ou armazenada durante cerca de 2 semanas a 4 ° C numa caixa húmida. </li><li> Para um surfac ligação totalmente funcionale, introduzir avidina (0,025% (w / v) em PBS) para dentro do reservatório. Use uma taxa de fluxo de 5 ul / min durante 30 minutos para retirar a solução de avidina através dos canais de fluído. Depois, lave PBS durante 10 min. Lave o reservatório completamente. </li><li> Em seguida, adicionar Proteína G (0,0025% (w / v) em PBS) e lave durante mais 30 min. Lavar com PBS durante mais 10 min depois. Em seguida, adicionar o anticorpo de interesse (0,0001% (w / v) em PBS) durante 10 min. Depois de 10 minutos, interromper o fluxo durante 15 minutos para permitir a ligação. Em seguida, lava-se com PBS durante 10 min. </li></ol> 5. Experimentos com células O protocolo é escrito em termos gerais, por causa da variedade de possíveis ensaios. Como um exemplo, os reagentes necessários para o ensaio de toxicidade de G6PDH são dadas. A célula prendendo eficiência inicial do aparelho é de cerca de 2,5%, ou seja, 5 de 200 células será preso. A ocupação final das armadilhas de células depende fortemente da linha celular utilizada, o protocolo para suspendera linha de células e o tempo que as células são lavadas por meio do canal. Para as células que crescem naturalmente em suspensão (por exemplo, U937), células isoladas pode ser encontrada em cerca de 75% das câmaras após alguns minutos. As outras câmaras ou não são preenchidas, ou ocupados por duas ou mais células. Em geral, a ocupação de uma única célula é menor para as linhas de células aderentes. Quando se utiliza o protocolo de suspensão bastante leve aqui apresentado, a percentagem diminui para cerca de 30% (HEK, células MLT). A ocupação de uma única célula pode ser melhorada por tratamento com tripsina das células, mas esta pode também alterar os resultados das experiências. Dependendo da molécula alvo, a adsorção ou a absorção de PDMS pode influenciar os resultados. Adsorção pode ser reduzida através do bloqueio das superfícies com a BSA ou PLL-g-PEG. A absorção é improvável para a maioria das biomoléculas hidrofílicas, mas deve ser verificado para os componentes celulares lipofílicos (pequenas). <ol><li> Preparar as células de acordo com o protocolo específico (por exemplo, </em&gt; Além da droga). Para células em suspensão, adicionar células diretamente para o chip. Para as linhas de células adesivas, usar tampão de dissociação isento de enzima para produzir uma suspensão de células. Filtrar as células antes de introduzi-los para o chip para reduzir a quantidade de agregados de células. </li><li> Carregar as células para o chip utilizando uma bomba de seringa e de fluxo para a frente, em vez de se retirar a suspensão de células. Use uma taxa de fluxo de 5 ul / min para as linhas de células de suspensão e maiores taxas de fluxo de 10-20 mL / min para as células adesivas uma vez que a redução de fixação não específica das células nas paredes do canal. </li><li> Quando as armadilhas são preenchidos, feche as câmaras. Se várias células aderir de forma não específica à superfície, tentar lavá-los com um tampão de dissociação celular, a uma taxa de fluxo de 10-30 mL / min. </li></ol> Um protocolo (ELISA) <ol start="4"><li> Retirar tampão de lise através do chip. Para este exemplo, este tampão é um tampão com hypoosmolar adicionado Tween 20 (10 mM Tris-HCl, 10mM de KCl, 1,5 mM MgCl2, 1% (v / v) de Tween 20). Para a lise, as câmaras rapidamente abrir e fechar (ou seja, 500 ms para as taxas de fluxo de 10-50 mL / min 7,21). Para o ensaio de G6PDH, adicionar 2 mM de glicose-6-fosfato, NADP 0,5 mM, 0,5 U / ml de diaforase e 0,3 mM de resazurina para o tampão de lise. Inicie o controlo da cinética da reacção imediatamente após a lise. </li></ol> Nota: Escolha qualquer tampão, que é adequado para o ensaio, no entanto ter em mente que os detergentes fortes (como Triton, SDS) lise das celulas imediatamente e vai levar a uma perda de analito durante a abertura da câmara. Protocolo B (imunoensaios) Para uma breve descrição das experiências de ELISA de células (taxas de fluxo, status de câmara, etc), por favor, consulte a Tabela 1. <ol start="5"><li> Para ELISA, adicionar o reagente de detecção é necessária (por exemplo, o anticorpo secundário, o antigénio marcado) directamente para o tampão de lise. O aqui adicionado Tween 20 reduz a adsorção não específica. Lise das células de acordo com o passo 5.4. Incubar a mistura durante 10-15 minutos para permitir a ligação do (tempo de incubação de acordo com o antigénio e o anticorpo utilizado). </li><li> Conjugados de enzimas e anticorpos que adsorvido inespecificamente as paredes do canal pode conduzir a uma conversão do reagente de detecção, já no interior do reservatório e canais. Para reduzir os riscos de o processo de adsorção, lave um inibidor estável da enzima de detecção utilizado através do chip durante o tempo de incubação (câmaras fechadas, antes da adição do reagente de detecção). Para HRP, use HCl 20 mM em água para inativar as enzimas permanentemente inespecífica adsorvido. </li><li> Após o tempo de incubação, introduzir o reagente de detecção (por exemplo, Vermelho Amplex e peróxido de hidrogénio para HRP) para o chip. Abrir as câmaras logo novamente para lavar o anticorpo secundário nonbound longe e para adicionar o reagente de detecção. Inicie o controlo da cinética da reacção imediatamente. </li><li> Calibração: Imobilizaro anticorpo contra o alvo de interesse. Fechar câmaras. Prepare a diferentes concentrações de analito em tampão ou em lisado de células fora do chip. Aplique uma concentração para o chip e trocar rapidamente o volume dentro das câmaras (500 ms de tempo de abertura). Este tempo de abertura é suficientemente curto para assegurar que não ocorre acumulação adicional de analito de lavagem, e apenas um número específico de moléculas a partir do volume da microcâmara são detectados. A partir da concentração conhecida do antigénio no interior da solução e o volume da câmara (625 pl), calcular a quantidade dentro da câmara. Em seguida, continue com o passo 5.5 e introduzir a porção de detecção. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Tecnologia microfluídica abriu novas e fascinantes possibilidades de análise de uma única célula. Em particular, a possibilidade de capturar e imobilizar células individualmente por ferramentas microfluídicos tem permitido estudos sistemáticos de curto e longo prazo sobre as propriedades de uma única célula e resposta. Além disso, a encapsulação de células em microgotículas de alta frequência, gerados por um circuito integrado, permitiu estudos de secreção de células individuais, que não podem ser realizados com os disp...

Muitos estudos no passado revelaram diferenças célula-a-célula dentro de uma população de células grandes 1-3, em particular os processos de sinalização 4, ou as quantidades de biomoléculas intracelulares, tais como proteínas, metabolitos 5,6, 7,8 e cofactores. Estas heterogeneidades são considerados fundamentalmente importante para a adaptação e evolução de 9 células, mas também desempenham um papel chave na emergência e tratamento de doenças como o cancro 10-13. Portanto, os estudos sobre o nível de uma única célula são de grande interesse na pesquisa biológica e farmacológica, principalmente se esses estudos revelam as diferentes respostas de células após o tratamento com substâncias químicas bioativas. Nos últimos anos, muitas plataformas de análise foram desenvolvidos para facilitar a análise de células vivas individuais ou a composição química do conteúdo da célula. Embora células fluorescentes ativadas (FACS) é o ouro ruaandard para análise muito maior taxa de transferência de células vivas individuais, o método não pode ser utilizado para a quantificação de compostos intracelulares ou segregadas. O surgimento de plataformas microfluídicos prometeu novas estratégias analíticas de posicionamento, tratamento e observação de células individuais. Um marco na microfluídica foi alcançado com a integração das válvulas PDMS flexíveis realizados por Quake e colegas de trabalho 14,15. Estas válvulas são úteis, pois podem isolar regiões no chip, por exemplo, separar duas culturas 16. Além disso, são especialmente aplicável para a análise de uma única célula e, portanto, ajudar a reduzir os problemas de diluição de analitos. O poder desta abordagem para a análise de uma única célula foi recentemente demonstrado por Hansen e colegas de trabalho, que analisou a expressão gênica de centenas de células individuais em paralelo 17. Ao alvejar proteínas e metabolitos, a análise é muito difícil devido à falta de uma adequadamétodos mplification, o grande número de compostos diferentes presentes, e suas variações de natureza química. Além disso, a maioria das biomoléculas intracelulares espera-se estar presente em número de cópias baixo, na ordem de algumas dezenas de milhar de 18, portanto, o método analítico utilizado deve possuir uma sensibilidade elevada. Os ensaios mais potentes, tais como imunoensaios e ensaios imunológicos ligados a enzimas (ELISA), são difíceis de integrar em dispositivos de microfluidos, uma vez que requerem vários passos de lavagem e de incubação, assim como a imobilização de superfície. Devido a estes desafios, não é surpreendente que apenas alguns exemplos em que foram reportados foram quantificadas proteínas ou metabolitos no nível de uma única célula. Por exemplo, estudos sobre a secreção de compostos fluorescentes têm sido relatados 19,20. Recentemente, a aplicação de ELISA, foi apresentado para a análise de secretadas (não fluorescentes) proteínas de uma cultura de células (células THP-1) 21 e único (immune) células 10. Segmentação de proteínas intracelulares, Shi et al. Desenvolvido um dispositivo de microfluidos, que facilitou a identificação de proteínas intracelulares para a análise das vias de sinalização nas células tumorais por meio de um imunoensaio 11. No entanto, apenas as quantidades relativas de proteínas foram determinadas e sem amplificação enzimática foi utilizada para aumentar o sinal para as proteínas de baixa abundância. Recentemente, fomos capazes de combinar uma microdispositivo trapping de uma única célula com ensaios de fluorescência 8 e imunoensaios 22 (Figura 1). As células são passivamente preso em estruturas obstáculo micronizada, o que permite a oferta ea (rápida) troca de médio e outros agentes químicos, sem qualquer movimento das células. Uma válvula em forma de anel em torno de cada armadilha permite o isolamento da célula em um volume muito pequeno (&quot;microcâmara&quot;). Esta válvula é acionada imediatamente após a introdução de um tampão de lise celular (hypoosmolar), eledno impedindo moléculas intracelulares ou moléculas secretadas para difundir para longe. Mais importante, devido ao pequeno tamanho do volume (625 pl) grande diluição das moléculas é evitado. Além disso, uma vez que a lise e de análise são realizadas no na mesma posição no chip, não há qualquer perda de substância a analisar devido ao transporte. O design de chips aqui descrito compreende 8 linhas alternadas de ambos os 7 ou 8 microchambers, totalizando 60 microchambers. As câmaras são acionados em linhas, de modo que a contaminação cruzada ao longo de uma linha está impedida. A plataforma pode ser utilizada em combinação com ensaios de fluorescência, bem como ensaios imunológicos (Figura 1d). Para este último, que estabeleceu protocolos para a imobilização dos anticorpos, que são compatíveis com a produção de chips e processo de montagem. Daí a plataforma abre o caminho para ensaios sensíveis, confiáveis ​​e quantificáveis ​​ao nível de célula única. Até agora, temos usado o dispositivo para a análise de ienzimas ntracellular e secretadas (quantificação relativa por ensaios enzimáticos), co-fatores intracelulares, proteínas e pequenas moléculas (quantificação absoluta por ensaios de ponto de extremidade ou ELISA). No que se segue, descreve-se o processo de fabricação de chips por meio de litografia suave multicamadas e os protocolos para a modelação dos anticorpos por meio de impressão microcontact e química de superfície. Além disso, alguns exemplos de utilização e as operações de chip são dadas.

<table><tbody><tr><td>REAGENTS:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome da empresa de reagentes Número de</td><td></td><td>catálogo</td><td>Comentários (opcional)</td></tr><tr><td>SU-8 2015</td><td>MicroChem Corp. (Netwon, MA)</td><td>n.a.1H,1H,2H,2H-Perfluorodecil-dimetilcloro-silano</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ABCR (Karlsruhe, Alemanha)</td><td>AB103608</td><td></td></tr><tr><td>4-metilumbeliferilo &beta;-D-N,NSigma</td><td>Aldrich</td><td>M9763</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Merck VWR (Darmstadt, Alemanha)</td><td>100014</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>AppliChem (Axon Lab AG)</td><td>A-2568</td><td></td></tr><tr><td>AZ 1518</td><td>AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Alemanha)</td><td>n.a.AZ</td><td></td></tr> <tr><td>726 desenvolvedor</td><td>AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Alemanha)</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-4503</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino, biotina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-8549</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de dissociação celular</td><td>Invitrogen</td><td>13151-014</td><td></td></tr><tr><td>Hexametildisilazano (HDMS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>40215</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Fluka</td><td>84422</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Merck VWR (Darmstadt, Alemanha</td><td>)109634</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexa-hidratado</td><td>Fluka</td><td>63068</td><td></td></tr><tr><td>MR developer 600</td><td>Microresist technology GmbH (Berlim, Alemanha)</td><td>n.a.PBS</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>PLL-g-PEG SuSoS enxertado</td><td>, (D&uuml; bendorf, Suíça)</td><td>n.a.PLL-g-PEG</td><td></td></tr> <tr><td>biotina enxertada</td><td>SuSoS, (D&uuml; bendorf, Suíça)</td><td>n.a.Cloreto</td><td></td></tr> de <tr><td>potássio</td><td>Fluka</td><td>60132</td><td></td></tr><tr><td>Proteína G, biotina</td><td>Sigma Fine Chemicals</td><td>41624</td><td></td></tr><tr><td>Bolacha de silício</td><td>Si-Mat (Kaufering, Alemanha)</td><td>n.a.Sylgard</td><td></td></tr> <tr><td>184 Kit de elastômero de silicone (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>39100000</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hidroximetil)-aminometano</td><td>Biorad</td><td></td><td></td>1610716</tr><tr><td>Tween 20</td><td>Biorad</td><td>1706531</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPAMENTO:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome do Material</td><td>Número de catálogo</td><td>da empresa</td><td>Comentários (opcional)</td></tr><tr><td>0.22 &micro; m Filtro de seringa PES</td><td>TRP</td><td>99722</td><td></td></tr><tr><td>perfurador de biópsia de 1/1,5 mm</td><td>Miltex, York PA</td><td>33-31AA/33-31A</td><td></td></tr><tr><td>Cell Trics filter 20 &micro; m</td><td>Partec</td><td>04-004-2325</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Sigma 3-18K</td><td>Kuehner</td><td>n.a.Placa</td><td></td></tr> <tr><td>de aquecimento HP 160 III BM</td><td>Sawatec, Sax, Suíça</td><td>alinhador de máscara n.a.MA-6</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Karl Suess</td><td>n.a.Multizoom</td><td></td></tr> <tr><td>AZ100M microscópio</td><td>Nikon Corporation</td><td>n.a.Photomask</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Microlitho, Essex, Reino Unido</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>Plasma Cleaner PDC-32G</td><td>Harrick</td><td>n.a.Spin</td><td></td></tr> <tr><td>coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE</td><td>Laurell</td><td>n.a.Spin</td><td></td></tr> <tr><td>Modules SM 180 BM</td><td>Sawatec, Sax, Switzerland</td><td>n.a.Step</td><td></td></tr> <tr><td>profiler Dektak XT Advanced</td><td>Bruker</td><td>n.a.Bomba</td><td></td></tr> <tr><td>de seringa neMESYS</td><td>Cetoni</td><td>n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

um chip microfluídico para a versátil análise química de células individuais

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

Apresenta-se um dispositivo de microfluidos, que permite a determinação quantitativa de biomoléculas intracelulares em várias células individuais em paralelo. Para este efeito, as células são passivamente preso no meio de uma microcâmara. Após a activação da camada de controlo, a célula é isolado a partir do volume em torno de uma pequena câmara. O volume circundante podem ser trocados sem afetar a célula isolada. No entanto, aquando da abertura e fecho curto da câmara, a solução na câmara pode ser substituído dentro de algumas centenas de milisegundos. Devido à reversibilidade das câmaras, as células podem ser expostas a soluções diferentes sequencialmente, de uma forma altamente controlável, por exemplo por incubação, lavagem, e finalmente, a lise celular. Microchambers hermeticamente seladas permitir a retenção do ligado, minimizar e controlar a diluição após a lise celular. Uma vez que a lise e análise ocorrer no mesmo local, de alta sensibilidade é mantida porque não mais dilution ou perda dos analitos ocorre durante o transporte. Por isso, o projeto MicroChamber permite a análise confiável e reprodutível de números muito pequenos de cópia de moléculas intracelulares (atomoles, zeptomoles) liberadas a partir de células individuais. Além disso, muitos microchambers podem ser dispostos num formato de matriz, permitindo a análise de muitas células de uma só vez, uma vez que os instrumentos ópticos adequados são usadas para a monitorização. Nós já usou a plataforma para estudos de prova de conceito para analisar proteínas intracelulares, enzimas, cofatores e segundos mensageiros em forma quantificável relativo ou absoluto.

Nossa plataforma é capaz de analisar uma variedade de intracelular, bem como moléculas segregadas presentes em ou produzidos por células individuais. Aqui, nós gostaríamos de apresentar diferentes estudos exemplo para sublinhar a variedade de possíveis ensaios. Vamos dar um exemplo, para uma enzima secretada (Figura 5a), bem como uma enzima intracelular (Figura 5b) e de proteína (Figuras 5c e d). Para mais exemplos, como cofatores ou pequenas moléculas,...

Neste artigo apresentamos um chip microfluídico para análise única célula. Ele permite a quantificação de proteínas intracelulares, enzimas, co-factores, e os segundos mensageiros, por meio de ensaios fluorescentes ou imunoensaios.

Um chip microfluídico para a Versátil Análise Química de células individuais

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

O objetivo geral do experimento a seguir é analisar lisados de células individuais utilizando ensaios de fluorescência ou imunoensaios. Isso é alcançado primeiramente pela criação de um dispositivo microfluídico e pelo revestimento da câmara interna com anticorpos. Em seguida, células individuais são imobilizadas nas armadilhas e expostas a diversos reagentes para estimular uma resposta celular em um segundo passo.Uma válvula em formato de anel é fechada rapidamente e o tampão de lise é fluído através do dispositivo. A válvula em forma de anel é então aberta por um curto período e as células são lisadas dentro da microcâmara, permitindo que as proteínas liberadas se liguem aos anticorpos em alta concentração devido ao pequeno volume. Em seguida, a válvula em forma de anel é aberta.A câmara é lavada e os reagentes de detecção são introduzidos na câmara microbiana fechada. O aumento da intensidade de fluorescência é monitorado ao longo do tempo usando um microscópio de fluorescência; os resultados demonstram a capacidade deste sistema em detectar quantitativa e confiavelmente um analito de interesse liberado por células individuais. Este método pode ajudar a responder perguntas funda

a-microfluidic-chip-for-versatile-chemical-analysis-single

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Gota plataformas baseadas microfluídicos são candidatos promissores para a experimentação de alto rendimento, uma vez que são capazes de gerar picolitros, auto-compartimentada vasos barata a taxas kHz. Através da integração com rápido, sensível e de alta resolução de fluorescência métodos espectroscópicos, a grande quantidade de informações geradas nesses sistemas podem ser eficientemente extraído, aproveitada e utilizada.

Métodos de detecção de fluorescência para as plataformas de gotículas microfluídicos

Millifluidic dispositivos são utilizados para a síntese controlada de nanomateriais, análise resolvida no tempo de mecanismos de reacção e catálise de fluxo contínuo.

Millifluidics para síntese química e resolvida no tempo estudos sobre os mecanismos

Nós apresentamos um biochip electroquímica à base de microfluidos para a detecção de hibridação de ADN. Após a funcionalização ADNcs sonda, a especificidade, a sensibilidade, e o limite de detecção são estudadas com alvos de ADNcs complementares e não complementares. Os resultados ilustram a influência dos eventos de hibridação de ADN no sistema electroquimico, com um limite de detecção de 3,8 nM.

A Biochip eletroquímica microfluídica à base de Análise de hibridação DNA livre-Label

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Um chip microfluídico para ICPMS Amostra Introdução

Dispositivos microfabricados integrados com componentes fluídicos fornecem uma plataforma in vitro para estudos celulares que imitam o microambiente in vivo. Desenvolvemos chips microfluídicos à base de polimetilmetacrilato para estudar as respostas celulares sob estímulos de estresse químico/elétrico/de cisalhamento únicos ou coexistentes.

Projetando microfluídicos para Estudar respostas celulares Sob único ou coexistindo Chemical / Elétrica / tensão de cisalhamento Estímulos

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Aprenda a analisar lisados de células individuais usando ensaios de fluorescência ou imunoensaios em um chip microfluídico. Este método permite quantificar proteínas intracelulares com alta sensibilidade.

Um chip microfluídico para a Versátil Análise Química de células individuais

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