Um chip microfluídico para a Versátil Análise Química de células individuais

O objetivo geral do experimento a seguir é analisar lisados de células individuais utilizando ensaios de fluorescência ou imunoensaios. Isso é alcançado primeiramente pela criação de um dispositivo microfluídico e pelo revestimento da câmara interna com anticorpos. Em seguida, células individuais são imobilizadas nas armadilhas e expostas a diversos reagentes para estimular uma resposta celular em um segundo passo.

Uma válvula em formato de anel é fechada rapidamente e o tampão de lise é fluído através do dispositivo. A válvula em forma de anel é então aberta por um curto período e as células são lisadas dentro da microcâmara, permitindo que as proteínas liberadas se liguem aos anticorpos em alta concentração devido ao pequeno volume. Em seguida, a válvula em forma de anel é aberta.

A câmara é lavada e os reagentes de detecção são introduzidos na câmara microbiana fechada. O aumento da intensidade de fluorescência é monitorado ao longo do tempo usando um microscópio de fluorescência; os resultados demonstram a capacidade deste sistema em detectar quantitativa e confiavelmente um analito de interesse liberado por células individuais. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da análise de células individuais.

Em particular, faltavam investigações sistemáticas sobre a resposta celular a variações no ambiente químico. Podemos observar regulações para cima ou para baixo de moléculas intracelulares como resultado do estímulo químico. Existem duas vantagens principais desta técnica.

O primeiro é que podemos expor as células imobilizadas a um ambiente químico definido que é constante ou periodicamente alterado. Em segundo lugar, podemos realizar análises altamente sensíveis e específicas do estado sem qualquer contaminação cruzada ou perda de analitos devido ao transporte. Para começar, fabrique as três diferentes pastilhas-mestre de SU oito conforme descrito no protocolo textual complementar.

Um será usado para criar a camada fluidica, um para a camada de controle e um terceiro para o carimbo de microcontato. Em seguida, fabrique os chips microfluídicos, começando pela preparação de uma mistura de 10 para 1 de PDMS e agente de cura. Misture as duas partes vigorosamente e desgaseifique a solução por 30 minutos ou até que a mistura esteja isenta de bolhas.

Em seguida, coloque a pastilha na camada de controle dentro de uma placa de Petri e fixe-a na base com fita adesiva. Despeje aproximadamente 50 gramas de PDMS por cima para criar uma camada com espessura de quatro a cinco milímetros e coloque a pastilha por pelo menos duas horas em uma estufa a 80 graus Celsius para garantir a cura completa do PDMS. Repita o mesmo procedimento para a pastilha de microimpressão por contato, mas utilize aproximadamente 20 gramas de PDMS em vez de 50, obtendo uma camada de PDMS com espessura de quatro a cinco milímetros.

Para preparar a camada inferior, aplique por spin coating uma camada de PDMS com 40 mícrons de altura sobre a pastilha com a camada microfluídica. Utilize uma velocidade de rotação de 2000 RPM durante 60 segundos. Cure a camada de PDMS em estufa por uma hora a 80 graus Celsius, quando todas as partes já estiverem curadas.

Remova a camada de controle da pastilha e corte-a em pedaços com auxílio da lâmina de barbear. Em seguida, faça furos para conexão de pressão utilizando uma punção de biópsia de um milímetro e cubra os canais com fita para armazenamento. A seguir, remova o PDMS da superfície da pastilha de microimpressão por contato e prepare carimbos com o tamanho da área da câmara.

Armazene-os livres de poeira em uma gaveta até o uso. Em seguida, coloque a pastilha com revestimento por centrifugação e a camada de controle com espessura de quatro a cinco milímetros em um limpador de plasma. Exponha as peças a 18 watts por 45 segundos, utilizando plasma de oxigênio a 0,75 milibar.

Após o tratamento com plasma, alinhe rapidamente ambas as camadas sob um microscópio com grande distância de trabalho. Adicione um pouco de PDMS sobressalente ao redor das partes superiores colocadas para facilitar a remoção do PDMS da pastilha. Em seguida, coloque a pastilha em uma estufa a 80 graus Celsius por pelo menos uma hora.

Após a cura, utilize um bisturi para remover cuidadosamente o PDMS do wafer e recortar os microchips, fazendo furos de acesso com uma punção de biópsia de 1,5 milímetro para as conexões fluidicas. Adicionalmente, crie um reservatório no microchip cortando a parte superior de uma ponteira de pipeta de 200 microlitros e utilizando um pouco de PDMS parcialmente curado. Cole-o na parte superior.

Em seguida, cure o chip no forno a 80 graus Celsius por pelo menos uma hora. Comece limpando uma lâmina de vidro e as peças de PDMS. Limpe uma lâmina de vidro com sabão.

Lave com água destilada e, em seguida, novamente com etanol. Seque a lâmina usando um fluxo de nitrogênio. Utilize fita para remover qualquer detrito e partículas de poeira do PDMS.

Em seguida, posicione a peça de PDMS e o vidro limpo. Deslize dentro do limpador de plasma por 45 segundos a 18 watts para garantir uma ligação firme, coloque o chip sobre uma placa aquecedora por cinco minutos após o tratamento com plasma. Após a ligação, corte a parte inferior de algumas ponteiras de 200 microlitros. Preencha-as com 10 a 15 microlitros de PBS filtrado com 4% de BSA e insira-as nas entradas do dispositivo.

Em seguida, utilize ponteiras cortadas com 10 a 15 microlitros de PBS adicionados e coloque-as nos canais de controle. Depois, posicione os chips na centrífuga e gire-os a 800 vezes a gravidade durante cinco minutos para preencher os canais com fluido. Se permanecer ar em algum dos canais, repita este passo até que os canais estejam completamente preenchidos.

Incube a solução bloqueadora por pelo menos 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, remova a solução da camada líquida com PBS a uma taxa de fluxo de 10 microlitros por minuto. Utilizando uma bomba de seringa, o dispositivo está agora pronto para experimentos celulares para pré-impressão da lâmina de vidro para ensaios imunoenzimáticos; incube carimbos de microimpressão por contato em PDMS com BSA biotinilada 0,5% em uma placa de Petri limpa.

Após meia hora, limpe as carimbos completamente e rapidamente com água destilada e seque o carimbo sob um fluxo de nitrogênio. Uma vez seco, coloque rapidamente os carimbos sobre uma lâmina de vidro limpa para depositar a BSA biotinilada padronizada. Não mova o carimbo após colocá-lo e verifique se o carimbo está em contato com a lâmina de vidro.

Se necessário, bata levemente no carimbo, mas não pressione com força. Em seguida, coloque o carimbo junto com a parte superior do chip microfluídico na câmara de plasma e exponha-os ao plasma de oxigênio a 18 watts por 45 segundos. Após o tratamento com plasma, remova o carimbo da lâmina de vidro.

Respirar sobre a superfície tornará o padrão visível. Alinhe as microcâmaras sobre a superfície impressa. Após o alinhamento, coloque o chip sobre uma placa aquecida a 50 graus Celsius por 30 minutos para bloquear a superfície remanescente, introduza uma solução de BSA a 4%, previamente filtrada e esterilizada, em PBS no chip com auxílio de uma centrífuga, conforme mostrado anteriormente, incube o microchip por pelo menos 30 minutos e, em seguida, remova a solução da camada de fluido com PBS a uma taxa de fluxo de 10 microlitros por minuto.

Usando uma bomba de seringa, utilize o chip diretamente ou armazene-o por até duas semanas a quatro graus Celsius em uma caixa úmida. Em seguida, crie uma superfície de ligação totalmente funcional introduzindo avadon em PBS no reservatório. Passe a solução para conduzir o avadon pelos canais fluidos posteriormente.

Lave bem o reservatório e enxágue os canais com PBS. Em seguida, adicione proteína G ao reservatório e puxe-a através dos canais. Remova qualquer excesso de proteína G lavando o reservatório e o chip com PBS.

Em seguida, adicione o anticorpo de interesse ao reservatório e faça-o fluir pelos canais. Em seguida, interrompa o fluxo para permitir a ligação antes de lavar os canais com PBS; análogos marcados com fluorescência podem ser usados para verificar a qualidade do processo de impressão antes de introduzir as células nos canais. Recolha células aderidas, como as células HEK 293 mostradas aqui, utilizando um tampão de dissociação livre de enzimas e, em seguida, filtre-as para reduzir o número de agregados celulares; uma vez filtradas, carregue-as em uma seringa.

Com 300.000 células por mililitro, carregue as células no chip utilizando fluxo direto na bomba de seringa por cerca de três minutos a uma taxa de 10 a 20 microlitros por minuto para células adesivas como estas, a fim de evitar a adesão não específica das células quando as armadilhas estiverem cheias; feche as câmaras pressurizando a camada superior com três bares. Em seguida, examine as câmaras utilizando um microscópio. Caso muitas células tenham aderido não especificamente à superfície interna das câmaras, abra-as rapidamente e tente removê-las com tampão de dissociação celular a uma taxa de fluxo de 10 a 30 microlitros por minuto.

Para o ensaio da glicose seis fosfato desidrogenase ou G6PDH, adicione dois milimolares de glicose, seis fosfato 0,5 milimolar e ADP 0,5 unidades por mililitro em matrizes DIA e 0,3 milimolar de NAD+ a um tampão de lise e certifique-se de que está bem misturado. Uma vez que os canais estejam limpos, aspire o tampão de lise da G6PDH através do chip a uma taxa de fluxo de 30 microlitros por minuto. Enquanto o tampão de lise estiver fluindo, abra e feche rapidamente as câmaras, mantendo-as abertas por 500 milissegundos para permitir que o tampão de lise entre nas câmaras; imediatamente após a lise, comece a monitorar a reação cinética.

Neste exemplo, um produto fluorescente pode ser monitorado ao longo do tempo. É mostrado aqui um arranjo de câmaras que foram preenchidas com corante alimentício laranja e, em seguida, fechadas mediante pressurização da camada de controle acima das microcâmaras. Após o fechamento das câmaras, corante alimentício verde foi lavado através dos canais para demonstrar a vedação das câmaras.

Cada câmara contém um volume de apenas 625 picolitros de fluido, mantendo a concentração de moléculas liberadas pelas células lisadas alta o suficiente para análise. Além disso, as válvulas podem ser abertas e fechadas de maneira a eliminar a contaminação cruzada entre as câmaras. Dentro dessas câmaras, é possível medir analitos, como a quantidade de lisossomo liberado por uma única célula U 9 37 ativada por PMA, à medida que catalisa enzimaticamente a produção de uma molécula fluorescente dentro da câmara.

As linhas verdes representam a mudança na intensidade de fluorescência ao longo do tempo para câmaras ocupadas por uma célula. Também é mostrada a intensidade de fluorescência para uma câmara sem células, representada pela linha pontilhada preta. Para comparação, este ensaio mostra o efeito de uma molécula tóxica na integridade da membrana ao medir uma enzima intracelular, a G seis PDH.

A linha preta representa as amostras controle sem influência tóxica, enquanto a linha laranja representa células influenciadas pela toxina indicada. Abaixo há um exemplo de um ensaio imunológico para uma proteína intracelular. Os anticorpos GFP anti GFP foram imobilizados na superfície e, após a lise celular, a cinética de ligação das proteínas GFP foi visualizada utilizando microscopia TURB.

O tempo 0,1 marca a introdução do tampão de lise no tempo 0. A GFP começa a se acumular na superfície no tempo 0,2, o que indica que a lise celular ocorreu e que a GFP difundiu até a superfície. A ligação da GFP aos anticorpos é concluída no tempo 0,3. Neste exemplo final, o GA DH liberado se ligou aos anticorpos de captura na superfície e, em seguida, foram adicionados anticorpos de detecção conjugados à HRP.

Após a remoção por lavagem de todos os anticorpos de detecção não ligados, o reagente de detecção foi introduzido e a reação foi monitorada ao longo do tempo. Aqui há uma comparação da quantidade de GA DH anteriormente intracelular em quantidades animais entre células U 9 37 e HEC 2 93, medida utilizando este método. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar os chips microfluídicos, como modificar a superfície para viabilizar ensaios imunoenzimáticos e, finalmente, como utilizar o dispositivo para análise de célula única.

Este método pode ser empregado para ajudar a responder a diversas perguntas instigantes no campo da biologia de célula única.