Padronização celular em photolithographically Definido Parylene-C: SiO ₂ Substratos

Este protocolo descreve um método de microfabricação compatível para padronização de células em SiO _2. Um projeto parylene-C predefinido é photolithographically impresso em SiO _2. Após a incubação com soro (ou outra solução de ativação), as células aderem especificamente (e crescer de acordo com a conformidade de) subjacente parylene-C, enquanto está sendo repelido por SiO ₂ regiões.

O objetivo geral deste procedimento é padronizar as células nos serviços de dióxido de silício de acordo com um projeto subjacente predefinido da paralinha. Isso é feito criando primeiro uma máscara fotográfica do padrão desejado. O segundo passo é oxidar e revestir um wafer de silício com paralina.

Em seguida, os processos fotolitográficos realizados em uma instalação de sala limpa de microeletrônica são usados para gravar seletivamente o revestimento de paralina para revelar o design desejado. A etapa final é ativar os chips usando primeiro o ácido de piranha e, em seguida, incubar no soro fetal de bezerro por três a 12 horas, após o que uma suspensão celular pode ser aplicada para cultura. Em última análise, o padrão celular pode ser avaliado por imagem de células vivas usando um microscópio de dissecação ou após fixação usando microscopia de fluorescência confocal.

A principal vantagem dessa técnica sobre várias plataformas de padronização celular existentes é que não há necessidade de trazer agentes biológicos para a sala limpa. Além disso, os chips padrão podem ser mantidos indefinidamente até que sejam ativados com o primeiro ácido par e depois com o soro. Para projetar a configuração C da paralinha desejada, use um pacote de software editor de layout capaz de ler, gravar CIF ou GDS em dois arquivos.

Terceirize o fabricante da máscara fotográfica para uma instalação de microeletrônica apropriada ou faça internamente. Se houver instalações, oxide um wafer de silício em um forno horizontal atmosférico a 950 graus Celsius por 40 minutos para produzir uma camada de dióxido de silício de 200 nanômetros. Depois disso, confirme a espessura com uma pequena mancha.

Refletômetro espectroscópico. Coloque as bolachas no sistema de deposição a vácuo, aplique o promotor de adesão senoidal no interior da tampa da câmara. Durante o ciclo de bombeamento, o promotor de adesão senoidal reveste a paralina de carga de wafer oxidada na paralina C de depósito do forno à temperatura ambiente a uma taxa de 1,3 nanômetros por miligrama de dímero usando um sistema de deposição a vácuo.

Depois disso, deposite o promotor de adesão HMDS no wafer revestido com paralina. Usando um sistema de revestimento fotorresistente adequado, gire o wafer a 4.000 RPM por 30 segundos enquanto aplica fotorresiste positivo para obter uma espessura de um mícron usando o sistema de revestimento fotorresistente e, em seguida, asse suavemente o wafer por 60 segundos a 90 graus Celsius. Agora insira o wafer e a máscara fotográfica pré-fabricada em um alinhador de máscara.

Exponha o wafer revestido com fotorresistente com luz ultravioleta para transferir o padrão desejado para o fotorresistente. Depois, asse o wafer exposto por 60 segundos a 110 graus Celsius. Em seguida, remova todo o fotorresistente exposto do wafer, desenvolvendo-o em uma solução de revelação apropriada em Hoff a paralina desprotegida usando um sistema de gravação de plasma de oxigênio para revelar o dióxido de silício subjacente.

Em seguida, armazene as fichas após cortar em cubos em caixas sem poeira até que sejam necessárias. Neste procedimento, remova o fotorresistente residual dos chips lavando uma acetona por 10 segundos. Em seguida, enxágue-os em H2O destilado deionizado três vezes, faça o ácido fresco da piranha em um exaustor de ácido depois, limpe e grave os chips por imersão em ácido piana por 10 minutos.

Em seguida, enxágue os chips três vezes em H2O deionizado e transfira para uma placa de cultura estéril em uma capela de cultura de tecidos de fluxo laminar. Ative os chips para padronização de células colocando dois chips por poço em uma placa de seis poços. Em seguida, adicione dois mililitros de soro fetal bovino para mergulhar totalmente todos os chips.

Incube os chips no soro por três a 12 horas a 37 graus Celsius. Agora remova os chips de sua solução de ativação. Lave uma vez por 10 segundos na solução salina balanceada de Hank.

Em seguida, coloque os chips em um poço de cultura e coloque o tipo de célula escolhido como suspensão em seu meio de crescimento usual. A densidade ideal de revestimento celular depende do tipo de célula e do padrão geométrico da paralinha C no chip. Uma densidade de cinco vezes 10 elevado a quarto de células por mililitro é um ponto de partida sensato.

A imagem é adaptada à motivação subjacente para o padrão celular, mas o comportamento das células vivas pode ser facilmente avaliado usando um microscópio de dissecação e uma câmera digital com uma lente de relé adequada. Aqui está a imagem de células vivas de células HEC 2 93 cultivadas em dióxido de silício paralina C após três dias. In vitro, os navios foram incubados por três horas em soro fetal bovino, e as células foram semeadas em suspensão a uma concentração de cinco vezes 10 elevado a quarto de células por mililitro.

A paralinha C promove a adesão celular, enquanto o dióxido de silício puro repele as células. Esta figura mostra as imagens de imunofluorescência de células-tronco derivadas de glioma humano primário cultivadas em vários padrões de paralina C em dióxido de silício. Aqui, o esquema ilustra o desenho da paralina reticular, a micrografia de fluorescência de células fixas coradas para proteína ácida fibrilar glial e a micrografia de luz de células vivas no mesmo chip.

Aqui está uma imagem fluorescente ilustrando as células coradas com GFAP em um design de paraline diferente e a imagem de refletância do nó no design de paraline de raios. E esta figura mostra a imagem de células vivas de três células T três L uma cultivadas em dióxido de silício paraline C. Após quatro dias in vitro, os chips foram ativados por três horas no soro fetal bovino, e as células foram semeadas em suspensão a uma concentração de cinco vezes 10 das quartas células por mililitro.

Nesse caso, a plataforma não permite a padronização com células se tornando igualmente confluentes nas regiões Lene C e dióxido de silício. Ao realizar este protocolo, é importante lembrar que a ativação do soro deve ocorrer imediatamente após o tratamento da piranha. Não fazer isso resulta em minar o processo de padronização.

Não se esqueça de que trabalhar com ácido de piranha pode ser extremamente perigoso. Prepare e use ácido de piranha em uma capela de exaustão química e certifique-se de usar óculos de proteção, jalecos e luvas apropriados.