Padronização celular em photolithographically Definido Parylene-C: SiO 2 Substratos
7 de março de 2014
Este protocolo descreve um método de microfabricação compatível para padronização de células em SiO 2. Um projeto parylene-C predefinido é photolithographically impresso em SiO 2. Após a incubação com soro (ou outra solução de ativação), as células aderem especificamente (e crescer de acordo com a conformidade de) subjacente parylene-C, enquanto está sendo repelido por SiO 2 regiões.
O objetivo geral deste procedimento é padronizar as células nos serviços de dióxido de silício de acordo com um projeto subjacente predefinido da paralinha. Isso é feito criando primeiro uma máscara fotográfica do padrão desejado. O segundo passo é oxidar e revestir um wafer de silício com paralina.
Em seguida, os processos fotolitográficos realizados em uma instalação de sala limpa de microeletrônica são usados para gravar seletivamente o revestimento de paralina para revelar o design desejado. A etapa final é ativar os chips usando primeiro o ácido de piranha e, em seguida, incubar no soro fetal de bezerro por três a 12 horas, após o que uma suspensão celular pode ser aplicada para cultura. Em última análise, o padrão celular pode ser avaliado por imagem de células vivas usando um microscópio de dissecação ou após fixação usando microscopia de fluorescência confocal.
A principal vantagem dessa técnica sobre várias plataformas de padronização celular existentes é que não há necessidade de trazer agentes biológicos para a sala limpa. Além disso, os chips padrão podem ser mantidos indefinidamente até que sejam ativados com o primeiro ácido par e depois com o soro. Para projetar a configuração C da paralinha desejada, use um pacote de software editor de layout capaz de ler, gravar CIF ou GDS em dois arquivos.
Terceirize o fabricante da máscara fotográfica para uma instalação de microeletrônica apropriada ou faça internamente. Se houver instalações, oxide um wafer de silício em um forno horizontal atmosférico a 950 graus Celsius por 40 minutos para produzir uma camada de dióxido de silício de 200 nanômetros. Depois disso, confirme a espessura com uma pequena mancha.
Refletômetro espectroscópico. Coloque as bolachas no sistema de deposição a vácuo, aplique o promotor de adesão senoidal no interior da tampa da câmara. Durante o ciclo de bombeamento, o promotor de adesão senoidal reveste a paralina de carga de wafer oxidada na paralina C de depósito do forno à temperatura ambiente a uma taxa de 1,3 nanômetros por miligrama de dímero usando um sistema de deposição a vácuo.
Depois disso, deposite o promotor de adesão HMDS no wafer revestido com paralina. Usando um sistema de revestimento fotorresistente adequado, gire o wafer a 4.000 RPM por 30 segundos enquanto aplica fotorresiste positivo para obter uma espessura de um mícron usando o sistema de revestimento fotorresistente e, em seguida, asse suavemente o wafer por 60 segundos a 90 graus Celsius. Agora insira o wafer e a máscara fotográfica pré-fabricada em um alinhador de máscara.
Exponha o wafer revestido com fotorresistente com luz ultravioleta para transferir o padrão desejado para o fotorresistente. Depois, asse o wafer exposto por 60 segundos a 110 graus Celsius. Em seguida, remova todo o fotorresistente exposto do wafer, desenvolvendo-o em uma solução de revelação apropriada em Hoff a paralina desprotegida usando um sistema de gravação de plasma de oxigênio para revelar o dióxido de silício subjacente.
Em seguida, armazene as fichas após cortar em cubos em caixas sem poeira até que sejam necessárias. Neste procedimento, remova o fotorresistente residual dos chips lavando uma acetona por 10 segundos. Em seguida, enxágue-os em H2O destilado deionizado três vezes, faça o ácido fresco da piranha em um exaustor de ácido depois, limpe e grave os chips por imersão em ácido piana por 10 minutos.
Em seguida, enxágue os chips três vezes em H2O deionizado e transfira para uma placa de cultura estéril em uma capela de cultura de tecidos de fluxo laminar. Ative os chips para padronização de células colocando dois chips por poço em uma placa de seis poços. Em seguida, adicione dois mililitros de soro fetal bovino para mergulhar totalmente todos os chips.
Incube os chips no soro por três a 12 horas a 37 graus Celsius. Agora remova os chips de sua solução de ativação. Lave uma vez por 10 segundos na solução salina balanceada de Hank.
Em seguida, coloque os chips em um poço de cultura e coloque o tipo de célula escolhido como suspensão em seu meio de crescimento usual. A densidade ideal de revestimento celular depende do tipo de célula e do padrão geométrico da paralinha C no chip. Uma densidade de cinco vezes 10 elevado a quarto de células por mililitro é um ponto de partida sensato.
A imagem é adaptada à motivação subjacente para o padrão celular, mas o comportamento das células vivas pode ser facilmente avaliado usando um microscópio de dissecação e uma câmera digital com uma lente de relé adequada. Aqui está a imagem de células vivas de células HEC 2 93 cultivadas em dióxido de silício paralina C após três dias. In vitro, os navios foram incubados por três horas em soro fetal bovino, e as células foram semeadas em suspensão a uma concentração de cinco vezes 10 elevado a quarto de células por mililitro.
A paralinha C promove a adesão celular, enquanto o dióxido de silício puro repele as células. Esta figura mostra as imagens de imunofluorescência de células-tronco derivadas de glioma humano primário cultivadas em vários padrões de paralina C em dióxido de silício. Aqui, o esquema ilustra o desenho da paralina reticular, a micrografia de fluorescência de células fixas coradas para proteína ácida fibrilar glial e a micrografia de luz de células vivas no mesmo chip.
Aqui está uma imagem fluorescente ilustrando as células coradas com GFAP em um design de paraline diferente e a imagem de refletância do nó no design de paraline de raios. E esta figura mostra a imagem de células vivas de três células T três L uma cultivadas em dióxido de silício paraline C. Após quatro dias in vitro, os chips foram ativados por três horas no soro fetal bovino, e as células foram semeadas em suspensão a uma concentração de cinco vezes 10 das quartas células por mililitro.
Nesse caso, a plataforma não permite a padronização com células se tornando igualmente confluentes nas regiões Lene C e dióxido de silício. Ao realizar este protocolo, é importante lembrar que a ativação do soro deve ocorrer imediatamente após o tratamento da piranha. Não fazer isso resulta em minar o processo de padronização.
Não se esqueça de que trabalhar com ácido de piranha pode ser extremamente perigoso. Prepare e use ácido de piranha em uma capela de exaustão química e certifique-se de usar óculos de proteção, jalecos e luvas apropriados.
Visão Geral
Este protocolo detalha um método para padronização celular em dióxido de silício (SiO2) utilizando parylene-C. As células aderem às regiões de parylene-C enquanto são repelidas pelo SiO2, permitindo padrões controlados de crescimento.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Padronização celular
- Micrfabricação
- Aplicações em neurociência
Antecedentes
- O padronamento celular é essencial para o estudo do comportamento celular.
- O parileno-C atua como substrato para adesão celular.
- O dióxido de silício é utilizado por suas propriedades repulsivas em relação às células.
- Este método evita contaminação por agentes biológicos em salas limpas.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para o padronamento celular em SiO2.
- Aprimorar a compreensão do comportamento celular em ambientes padronizados.
- Fornecer um protocolo que minimize os riscos de contaminação.
Métodos Utilizados
- Criação de uma máscara fotográfica para o padrão desejado de parylene-C.
- Oxidação e revestimento de pastilhas de silício com parylene-C.
- Gravação fotolitográfica para revelar o padrão.
- Ativação dos chips usando ácido piranha e soro de bezerro fetal.
Resultados Principais
- As células foram posicionadas com sucesso de acordo com o design de parylene-C.
- A imagem de células vivas demonstrou o comportamento celular em superfícies padronizadas.
- A imunofluorescência confirmou os padrões de adesão e crescimento celular.
- O método permite o armazenamento indefinido de chips padronizados antes da ativação.
Conclusões
- Essa técnica oferece uma abordagem robusta para o padronização celular.
- Ela simplifica o processo ao eliminar a necessidade de agentes biológicos em salas limpas.
- Aplicações futuras podem incluir diversos tipos e padrões celulares para pesquisa.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método de padronização celular compatível com microfabricação permite um controle espacial preciso da adesão celular em substratos baseados em silício, apoiando o desenvolvimento de modelos in vitro reprodutíveis para pesquisas em neurociência e doenças. Ao se integrar com processos semicondutores padrão, facilita a criação de plataformas escaláveis compatíveis com matrizes de eletrodos múltiplos e sistemas laboratório-em-um-chip. A abordagem reduz o risco de contaminação em ambientes de sala limpa e permite o armazenamento indefinido de chips padronizados antes da ativação, aumentando a flexibilidade do fluxo de trabalho em ambientes de descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da organização espacial precisa de redes neuronais ou gliais para estudar interações específicas de vias.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos ao isolar respostas celulares em microambientes definidos, reduzindo variáveis de confusão na triagem fenotípica.
- Valor Preditivo: Aumenta a confiabilidade dos dados de interação com alvos ao permitir ensaios de co-cultivo controlado ou com barreiras repulsivas que mimetizam a arquitetura tecidual.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão para ensaio: Produz substratos padronizados e compatíveis com microfabricação, adequados para imageamento de alto conteúdo e leituras eletrofisiológicas em fluxos de trabalho integrados a MEA.
- Reprodutibilidade: Oferece fidelidade de padrão em nível micrométrico por meio da fotolitografia, garantindo posicionamento celular consistente entre réplicas para triagem confiável de compostos.
- Escalabilidade: Permite a fabricação em lote e o armazenamento indefinido de chips, possibilitando a implantação de ensaios sob demanda sem necessidade de processamento repetido em sala limpa.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Modelagem de Doenças: Apoia a exploração da fisiologia celular em sistemas neurologicamente relevantes, incluindo células-tronco semelhantes a glioma humanas primárias e neurônios hipocampais murinos.
- Continuidade Translacional: Permite a progressão desde a triagem fenotípica na fase de descoberta até a validação pré-clínica, utilizando plataformas de substrato consistentes.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Esclarece o papel de moléculas de adesão celulares específicas nos resultados de padronização, orientando a seleção de alvos com base na relevância biológica.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação inicial do alvo até o desenvolvimento de ensaios e a modelagem pré-clínica, especialmente para alvos relacionados a neuroterapias e oncologia, nos quais a organização espacial das células informa a função.
- Biologia Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao permitir culturas co-culturais controladas ou desenhos com barreiras repulsivas para esclarecer a comunicação celular e a modulação de vias.
- Triagem: Fornece substratos prontos para ensaios com saídas quantitativas por meio de imagem de células vivas ou imunofluorescência, facilitando a comparação dos efeitos de compostos em condições padronizadas.
- Análises: Gera leituras com resolução espacial (por exemplo, marcação de GFAP, métricas de confluência) que permitem comparação estatística do comportamento celular em microambientes definidos.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se a trabalhos pré-clínicos por meio do uso de tipos celulares relevantes para doenças (por exemplo, células semelhantes a células-tronco de glioma humano) e padrões que imitam a arquitetura tecidual.
- Reutilização Empresarial: Representa uma capacidade de microfabricação reutilizável, e não um protocolo de uso único, compatível com processamento padrão de pastilhas e infraestrutura de sala limpa.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir a ambiguidade mecanicista nas respostas celulares por meio de sistemas de cultivo espacialmente definidos.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização e reprodutibilidade por meio da precisão fotolitográfica e da ativação baseada em soro, independente da introdução biológica em sala limpa.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisões de avanço ou interrupção ao permitir a eliminação precoce de riscos em alvos com base no comportamento em contextos espaciais fisiologicamente relevantes.
- Impacto no Portfólio: Apoia o avanço ajustado ao risco ao fornecer dados de modelos que refletem melhor a organização em nível tecidual e a heterogeneidade celular.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em microfabricação, fotolitografia e sistemas de deposição a vácuo para revestimento e padronização de parylene-C.
- Depende do acesso a instalações de sala limpa, alinhadores de máscara, gravadores a plasma de oxigênio e refletômetros espectroscópicos para controle de processo.
- Necessita de protocolos padronizados de ativação (ácido piranha seguido de incubação com soro) para garantir resultados consistentes de padronização entre lotes.
- Requer adaptação da densidade de plaqueamento celular e dos tempos de incubação com base nas propriedades de adesão específicas de cada tipo celular e na geometria do padrão.
- Aplicabilidade limitada entre diferentes tipos celulares devido à dependência de moléculas endógenas de adesão, exigindo validação empírica para novos modelos.
