Name: Padronização celular em photolithographically Definido Parylene-C: SiO 2 Substratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Aprenda a padronizar células em substratos de SiO₂ usando parylene-C por fotolitografia. Este método permite adesão controlada em regiões definidas, facilitando estudos de comportamento celular em neurociência.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabalho foi financiado pelo Wellcome Trust uma bolsa de doutoramento Clínica (CAAT).

1. Fabricação de Padrões Parileno em SiO 2: Fluxo de Processo (Ver Figura 1) <ol><li> Projeto de configuração desejado parylene-C usando um pacote de software editor de layout, capaz de leitura / escrita CIF (Caltech Intermediate Form) ou arquivos GDS-II (Banco de Dados do Sistema Gráfico-II). CIF e GDS-II são os formatos de arquivo padrão da indústria para a disposição de arte circuito integrado. </li><li> Máscara foto Comissão fabricar a uma unidade de microeletrônica apropriadas, ou fazer em casa, se há disponibilidade. </li><li> Oxidar uma bolacha de silício em um forno horizontal atmosférica (1,88 H 2 O 2 e SLM 1,25 SLM) a 950 ° C durante 40 minutos para produzir um a 200 nm, camada de SiO2 (confirmar com a espessura de um pequeno ponto espectroscópica da reflectividade). </li><li> Primeiro o wafer oxidado com um promotor de adesão silano. Agora depositar parilene-C a 22 ° C a uma taxa de 1,298 nm / mg de dímero utilizando um sistema de deposição de vácuo, especificamente concebida para a deposição parileno. A 100nm de espessura de revestimento parilene-C, foi usado para todos os exemplos mostrados abaixo. </li><li> Próximo depósito hexametildissilazano (HMDS), o promotor de aderência sobre a bolacha revestidos por parileno usando um sistema de revestimento de foto-resist adequado. </li><li> Agora girar a bolacha a 4.000 rpm durante 30 segundos, enquanto a aplicação positiva fotorresistente (resultando numa espessura teórica de 1 mm), usando o mesmo sistema de revestimento foto-resistente como acima. </li><li> Mole cozer a bolacha durante 60 segundos a 90 ° C. </li><li> Inserir tanto o wafer e máscara de foto, pré-fabricado em um alinhador de máscara. </li><li> Expor o wafer foto-resistente revestida-com uma representação negativa UV da configuração parilene-C desejada. </li><li> Asse wafer expostas por 60 segundos a 110 ° C. </li><li> Remover todos expostos foto-resiste do wafer, através do desenvolvimento de uma solução desenvolvedor apropriado. </li><li> Etch fora do parylene desprotegido. Use um sistema de plasma de oxigênio etch (a uma pressão da câmara de 50 mTorr, 49 sccm O 2, com 100 W de potência de RF de 13,56 MHz, euma taxa de corrosão de 100 nm / min) para revelar o SiO subjacente 2. </li><li> Cortar o wafer usando uma serra corte em cubos apropriada (velocidade do fuso de 30.000 rpm, a velocidade de alimentação 7 mm / seg.) </li><li> Enxágüe fichas em H2O desionizada e seque com nitrogênio. </li><li> Armazene fichas (por tempo indeterminado) em caixas de poeira livre até que seja necessário. </li></ol> 2. Chip Limpeza e Ativação: Protocolo <ol><li> Retirar fotorresistente residual a partir de lascas por lavagem em acetona durante 10 seg. </li><li> Enxágüe em água deionizada destilada H 2 O 3x. </li><li> Certifique-se de ácido piranha fresco (uma proporção de 30% de peróxido de hidrogênio e ácido sulfúrico 05:03 98%). CUIDADO: Preparar ácido piranha com muito cuidado. Ele é um oxidante muito poderoso, é fortemente ácida, e a mistura de peróxido de hidrogénio com ácido sulfúrico é uma reacção exotérmica. Realize esta etapa em uma coifa ácido. Permitir 2 min para passar após a mistura do ácido piranha, mas usar dentro de 20 min. </li><li> Fichas limpas e de corrosão por imersão em piácido Ranha por 10 min. </li><li> Lavar 3x em chips de H2O desionizada e transferir para um prato de cultura estéril. </li><li> Agora ativar chips para padronização celular. Por exemplo, adicionar dois chips por poço para uma placa de 6 poços e, em seguida, adicionar 2 ml de soro fetal de bovino, de modo a imergir totalmente todos os chips. Executar esta, e todas as fases subsequentes de cultura de células, em condições estéreis num fluxo laminar para cultura de tecidos capuz. </li><li> Incubar fichas no soro por 3-12 h a 37 ° C. NOTA: Passos 2,4-2,7 devem ser realizados sequencialmente e sem demora entre as etapas. Se a ativação do soro é adiada por ≥ 24 horas depois de piranha-tratamento, padronização celular é prejudicada devido à redução da repulsão celular de SiO 2 regiões. Soluções de activação alternativo contendo proteínas de adesão celular específicos podem ser usados ​​em lugar de soro fetal bovino. Tais soluções podem alterar as características de adesão celular dos dois substratos contrastantes (ver resultados representativos para um exemplo). </li&gt; </ol> 3. Chaparia linhas de celulares on-Chip: Protocolo <ol><li> Retirar as fichas de sua solução de activação e lavagem, uma vez durante 10 segundos em uma solução salina equilibrada de Hank. </li><li> Coloque chip de um poço de cultura e a placa tipo celular escolhido como uma suspensão em meio de crescimento normal. Optimum densidade de revestimento celular depende tanto do tipo de célula e padrão geométrico de parylene-C on-chip. Uma densidade de 5 x 10 4 células / ml é um ponto de partida razoável. </li><li> Imagem é adaptado para a motivação subjacente para padronização celular, mas o comportamento de células vivas podem ser facilmente avaliada através de um microscópio de dissecação e uma câmera digital com uma lente de relé adequado. </li></ol>

<ol><li>Zhi, Z. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Versatile+Gold+Surface+Approach+for+Fabrication+and+Interrogation+of+Glycoarrays%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">A Versatile Gold Surface Approach for Fabrication and Interrogation of Glycoarrays.</a> ChemBioChem. 9, 1568-1575 (2009).</li>
<li>Michelini, E., Roda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staying+alive%3A+new+perspectives+on+cell+immobilization+for+biosensing+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Staying alive: new perspectives on cell immobilization for biosensing purposes.</a> Anal. Bioanal. Chem. 402 (5), 1785-1797 (2012).</li>
<li>Franks, W., Tosatti, S., Heer, F., Seif, P., Textor, M., Hierlemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+cell+adhesion+by+self-assembled+structures+for+use+with+a+CMOS+cell-based+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Patterned cell adhesion by self-assembled structures for use with a CMOS cell-based biosensor.</a> Biosens. Bioelectron. 22 (7), 1426-1433 (2007).</li>
<li>Bacakova, L., Filova, E., Parizek, M., Ruml, T., Svorcik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+cell+adhesion%2C+proliferation+and+differentiation+on+materials+designed+for+body+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Modulation of cell adhesion, proliferation and differentiation on materials designed for body implants.</a> Biotechnol. Adv. 29 (6), 739-767 (2011).</li>
<li>Bacakova, L., Svorcik, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBacakova%2C+L+%22Cell+colonization+control+by+physical+and+chemical+modification+of+materials.+In%3A+Cell+growth+process%3A+new+research%22">Cell colonization control by physical and chemical modification of materials. In: Cell growth process: new research</a>. Kimura, D. , Nova Science Publishers Inc. New York. 5-56 (2008).</li>
<li>Sanjana, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast+flexible+ink-jet+printing+method+for+patterning+dissociated+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A fast flexible ink-jet printing method for patterning dissociated neurons in culture.</a> J. Neurosci. Methods. 136, 151-163 (2004).</li>
<li>Brittain, S., Paul, K., Zhao, X. -M., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+and+micro-+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+World%22%5BJournal%5D)">Soft lithography and micro- fabrication.</a> Phys. World. 11, 31-36 (1998).</li>
<li>Maher, M., Pine, J., Wright, J., Tai, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurochip%3A+a+new+multielectrode+device+for+stimulating+and+recording+from+cultured+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">The neurochip: a new multielectrode device for stimulating and recording from cultured neurons.</a> J. Neurosci. Methods. 87 (1), 45-56 (1999).</li>
<li>Martinoia, S., Bove, M., Tedesco, M., Margesin, B., Grattarola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+micro-+fluidic+system+for+patterning+populations+of+neurons+on+silicon+micro-+machined+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple micro- fluidic system for patterning populations of neurons on silicon micro- machined substrates.</a> J. Neurosci. Methods. 87 (1), 35-44 (1999).</li>
<li>Zeck, G., Fromherz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+neuroelectronic+interfacing+with+synaptically+connected+snail+neurons+immobilized+on+a+semiconductor+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Noninvasive neuroelectronic interfacing with synaptically connected snail neurons immobilized on a semiconductor chip.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (18), 10457-10462 (2001).</li>
<li>Michel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+molecular+assembly+patterning%3A+a+new+approach+to+micro-+and+nanochemical+patterning+of+surfaces+for+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Selective molecular assembly patterning: a new approach to micro- and nanochemical patterning of surfaces for biological applications.</a> Langmuir. 18 (8), 3281-3287 (2002).</li>
<li>Rajalingam, B., Selvarasah, S., Dokmeci, M., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+static+and+dynamic+patterned+cocultures+using+microfabricated+parylene-C+stencils%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Generation of static and dynamic patterned cocultures using microfabricated parylene-C stencils.</a> Lab Chip. 7, 1272-1279 (2007).</li>
<li>Reusable, reversibly sealable parylene membranes for cell and protein patterning. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22">J. Biomed. Mater. Res. A</a>. Wright, D., Rajalingam, B., Karp, J., Selvarah, S., Ling, Y., Yeh, J., Langer, R., Dokmeci, M., Khademhosseini, A. 85 (2), 530-538 (2008).</li>
<li>Delivopoulos, E., Murray, A. F., MacLeod, N. K., Curtis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guided+growth+of+neurons+and+glia+using+microfabricated+patterns+of+parylene-C+on+a+SiO2+background%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Guided growth of neurons and glia using microfabricated patterns of parylene-C on a SiO2 background.</a> Biomaterials. 30, 2048-2058 (2009).</li>
<li>Delivopoulos, E., Murray, A. F., Curtis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+parylene-C+photooxidation+on+serum-assisted+glial+and+neuronal+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Effects of parylene-C photooxidation on serum-assisted glial and neuronal patterning.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 94, 47-58 (2010).</li>
<li>Delivopoulos, E., Murray, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+adhesion+and+growth+of+long+term+glial+and+neuronal+cultures+on+parylene-C%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Controlled adhesion and growth of long term glial and neuronal cultures on parylene-C.</a> PLoS One. 6 (9), (2011).</li>
<li>Hughes, M. A., Bunting, A., Cameron, K., Murray, A. F., Shipston, M. J. Modulating patterned adhesion and repulsion of HEK 293 cells on micro-engineered parylene-C/SiO2 substrates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHughes%2C+MA+%22J.+Biomed.+Mat.+Res.+Mater.+A%22">J. Biomed. Mat. Res. Mater. A</a>. 101 (2), 349-357 (2013).</li>
<li>Unsworth, C. P., Graham, E. S., Delivopoulos, E., Dragunow, M., Murray, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+human+hNT+neurons+patterned+on+parylene-C%2Fsilicon+dioxide+substrates%3A+Combining+an+accessible+cell+line+and+robust+patterning+technology+for+the+study+of+the+pathological+adult+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">First human hNT neurons patterned on parylene-C/silicon dioxide substrates: Combining an accessible cell line and robust patterning technology for the study of the pathological adult human brain.</a> J. Neurosci. Methods. 194, 154-157 (2010).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Imersão das fichas em ácido piranha serve não só para remover qualquer material orgânico residual, mas também grava as superfícies do substrato. Isso é fundamental para que a ativação efetiva com soro fetal bovino. Não fazer isso impede célula-padronização e altera profundamente o comportamento das células on-chip. Não há nenhuma exigência para esterilizar fichas após a limpeza com ácido piranha. Com efeito de esterilização por exposição aos raios UV demonstrou prejudicar padronização de células de uma forma dependente da dose 13. Cuidados devem ser tomados para lavar tudo photoresist residual após o processo de fotolitografia. Persistindo photoresist pode atuar como uma camada de cito-adesiva indesejado que substitui padrões ditados por parylene-C/SiO 2 geometria. A acetona é eficaz quando se utiliza o processo de fotolitográfica descritos acima e com os reagentes especificados. No entanto, outros tipos de material fotoresistivo pode necessitar de um solvente diferente. Para avaliar o impacto eo sucesso da difereetapas de fabricação nt, o ângulo de contacto dos dois substratos de contraste pode ser medido. Figura 2 ilustra as alterações que ocorrem durante o processo de activação de chip. É provável, contudo, que o adesivo específico e componentes proteicos repulsivas em soro acabará por permitir o chip-modeladas parilene para exercer as suas respectivas características cito-adesivas ou cito-repulsivo. Todos os resultados representativos utilizados fichas com uma espessura parylene de 100 nm, embora tenhamos modelada com sucesso usando camadas parylene tanto mais grossas e mais finas. Mais importante, esta técnica gravura fotolitográfico permite um controlo muito maior tridimensional de configuração parilene do que ilustrado aqui. Por exemplo, usando uma combinação de máscaras, é possível criar regiões parylene de espessura mista. Isso abre o caminho para a criação de culturas de células com topografia tridimensional definido, indo além das regiões simplesmente ditando de adesão celular / repulção, oferecendo potencialmente um meio de integrar canais microfluídicos para a construção. Como mostrado, no entanto, esta plataforma padronização não é universalmente eficaz em todos os tipos celulares. Linhagens celulares diferentes, com seus perfis molécula de adesão celular variados, sem surpresa se comportam diferentemente quando cultivadas nesta plataforma. Nós ainda não identificaram os principais componentes no soro, nem os receptores da membrana celular de cortesia, que se baseia essa plataforma célula-padronização. Ao fazê-lo, no futuro, promete ampliar a sua utilidade e especificidade. Por exemplo, uma linha de células &quot;não-padronização &#39;pode ser geneticamente modificado para expressar a molécula de adesão necessária e assim promover a padronização.

Compreender os mecanismos que determinam a adesão celular e padronização de materiais sintéticos é importante para aplicações tais como engenharia de tecidos, descoberta de drogas e a fabricação de biossensores 1-3. Muitas técnicas estão disponíveis e em evolução, cada um levando vantagem dos fatores biológicos, químicos e físicos que influenciam a miríade de adesão celular. Aqui, descrevemos uma técnica de células-padronização que utiliza processos inicialmente desenvolvidas para fins de fabricação de microeletrônicos. Como tal, a plataforma está bem colocado para permitir a integração a jusante de tecnologias de microeletrônica, tais como AAM, na plataforma de padronização. A interface entre a membrana celular e um material adjacente é bidireccional e complexo. In vivo, as proteínas da matriz extracelular e fornecem a estrutura e força de impacto sobre o comportamento das células através de interacções com receptores de adesão celular. De igual modo, as células em vitro interagir com substratos sintéticos via camadas absorvidas de proteínas 4, enquanto influências físico-químicas também modular a adesão. Por exemplo, uma superfície de polímero pode ser tornado mais &quot;molhável&quot; (hidrofílico) por iões ou irradiação de luz ultravioleta, ou decapagem por tratamento com ácido ou hidróxido de 5. Métodos estabelecidos para a padronização de células tirar proveito destes e de outros mediadores da adesão celular. Exemplos incluem a impressão a jato de tinta 6, microcontact carimbar 7, imobilização física 8, 9 microfluídica, manipulação em tempo real de 10, e padronização seletiva molecular montagem (SMAP) 11. Cada um tem vantagens e limitações específicas. Um fator-chave no nosso trabalho, no entanto, é integrar padronização celular com sistemas microeletromecânicos (MEMS). MEMS referem-se extremamente pequenos dispositivos mecânicos que funcionam com energia elétrica. Isto coincide com a nanoescala equivalente, nanoelectromechsistemas mecânicos. Este conceito tornou-se prática apenas quando as estratégias de semicondutores habilitado fabricação a ter lugar em microescala. Técnicas de microfabricação desenvolvidos originalmente para eletrônicos semicondutores têm sido inadvertidamente encontrado útil para outros usos, como a eletrofisiologia celular, por exemplo. Um objetivo a jusante chave é combinar essas tecnologias de microeletrônica com um processo de padronização de células de alta fidelidade (formando um dispositivo bioMEMS). Várias técnicas de células-padronização existentes e de outro modo confiáveis ​​e práticas são incompatíveis com essa idéia. Por exemplo, o alinhamento preciso de quaisquer microelectrónica ou biossensores embutidos é fundamental para a sua eficácia, mas é extremamente difícil de conseguir utilizando uma técnica tal como microcontact estampagem. Para contornar esse problema, estamos trabalhando em uma plataforma de padronização com base em 2 SiO que usa photolithographically impresso parylene-C. Fotolitografia envolve a transferência de recursos geométricos deuma máscara para um substrato por meio de iluminação UV. Uma máscara é projetado usando um programa de desenho assistido por computador apropriado. Mediante uma placa de vidro, uma camada fina de crómio não transparente representa o padrão geométrico desejado (uma resolução característica de 1-2 mm é possível). O substrato a ser modelado é revestida com uma fina camada de material fotosensitivo (um polímero sensível ao UV). O polímero revestido é então alinhada e trouxe em contato próximo com a máscara. Uma fonte de UV é aplicada de tal modo que as áreas não protegidas são irradiadas e, portanto, tornam-se solúveis e removível na próxima etapa de desenvolvimento, deixando uma representação parilene-C do padrão de máscara de trás. Este processo originou durante o desenvolvimento de dispositivos semicondutores. Como tal, as bolachas de silício são frequentemente utilizadas como um substrato. Deposição de fotolitografia de parylene-C em SiO 2, portanto, é um processo simples e confiável que rotineiramente ocorre em instalações de salas limpas microeletrônicos. Enquanto parylene temvárias características desejáveis ​​de bioengenharia (quimicamente inerte, não bio-degradável), um fator restritivo de utilização direta na padronização celular é a sua adesividade celular inata pobres, atribuída em parte à sua extrema hidrofobia. No entanto, parilene-C tem sido anteriormente utilizada indirectamente para a padronização de células, por exemplo, como uma casca-de distância modelo celular 12,13. Esta abordagem é limitada pela baixa resolução e requer várias etapas. O processo aqui descrito utiliza um passo em vez de corrosão ácida, seguido por incubação de soro, para assegurar que as regiões de parileno-C tornar célula-adesiva, por meio de uma combinação de redução e na hidrofobicidade da proteína de ligação do soro. O resultado final é uma estrutura composta de dois substratos diferentes, o que, depois da activação biológica, manifestam respectivas características cito-adesivas ou cito-repulsivo e assim representa uma plataforma pattering celular eficaz. É importante notar, não há necessidade de introduzir um g biológicaentos para a instalação de salas limpas como os substratos padronizados podem ser armazenados indefinidamente antes de ser utilizado (após o que são activados utilizando soro fetal de bovino ou de outra solução de activação). Esta plataforma padronização parylene-C/SiO 2 é, portanto, um bom candidato para uma coalizão com os componentes de MEMS, como os processos de fabricação tão estreitamente espelhar as utilizadas para a fabricação de microeletrônica.

<table><tbody><tr><td>Pacote de software editor de layout</td><td>CleWin 5.0 da WieWeb</td><td></td><td>Capaz de ler/gravar arquivos CIF ou GDS-II. Usado para criar design de parileno para fabricação de máscaras fotográficas. http://www.wieweb.com/ns6/index.html</td></tr><tr><td>Máscara fotográfica sob medida</td><td>Compugraphics International Ltd, Glenrothes, Escócia</td><td></td><td>Fabricar internamente as instalações existentes ou comissionar. www.compugraphics-photomasks.com</td></tr><tr><td>3 em Bolachas de silício</td><td>Siltronix, Archamps, França</td><td></td><td>http://www.siltronix.com</td></tr><tr><td>Forno horizontal atmosférico</td><td>Sandvik</td><td></td><td>Para oxidar pastilhas de silício. http://www.mrlind.com</td></tr><tr><td>Refletômetro espectroscópico de pequeno ponto</td><td>Nanometrics</td><td></td><td>Para medir a profundidade da camada de dióxido de silício. www.nanometrics.com/ Promotor de adesão de</td></tr> <tr><td>silano</td><td>Merck Chemicals</td><td></td><td>1076730050 Pré-aplicado ao wafer para estimular a deposição de parileno. www.merck-chemicals.de/</td></tr> <tr><td>Parylene-C</td><td>Ultra Electronics</td><td></td><td>www.ultra-cems.com</td></tr><tr><td>Unidade de deposição SCS Labcoter 2, Modelo PDS2010</td><td>Equipamento SCS, Surrye, Reino Unido</td><td>Modelo PDS2010</td><td>www.scscoatings.com/</td></tr> <tr><td>Promotor de adesão de hexametildisilazano (HMDS)</td><td>SpiChem</td><td></td><td>www.2spi.com</td></tr><tr><td>Sistema de rastreamento automatizado para dispensar fotorresistente em wafers; SVG de trilha fotorresistente de 3 polegadas</td><td>(Silicon Valley Group)</td><td></td><td>Sistema de trilha automatizado para distribuição de fotorresistente em wafers. Um forno primário assa o wafer e dispensa o promotor de adesão, HMDS. Um spinner combinado dispensa fotorresistente. O forno pré-assado cura a resistência.</td></tr><tr><td>Foto-resiste</td><td>Rohm & Alinhador</td> de <td>foto-máscara positiva Haas SPR350-1.2</td><td>www.rohmhaas.com/</td></tr> <tr><td>MA/BA8</td><td>Suss Microtech</td><td></td><td>www.suss.com</td></tr><tr><td>Microchem MF-26A desenvolvedor</td><td>Microchem</td><td></td><td>Remove regiões expostas de fotorresistência. www.microchem.com</td></tr><tr><td>Sistema de gravação a plasma JLS RIE80</td><td>JLS Designs</td><td></td><td>Remove regiões expostas de parileno. www.jlsdesigns.co.uk</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>DISCO DAD 680 Serra para corte em cubos de wafer</td><td>DISCO Corporation, Japão</td><td></td><td>www.disco.co.jp</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Fisher Scientific</td><td>A929-4</td><td>Para lavar o fotorresistente residual.</td></tr><tr><td>30% Peróxido de Hidrogênio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td>www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>98% Ácido Sulfúrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>435589</td><td>www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>10437</td><td>Ativação padrão do chip.&nbsp; Solução</td></tr><tr><td>salina balanceada de www.invitrogen.com Hank</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>14170</td><td>www.invitrogen.com</td></tr></tbody></table>

padronização celular em photolithographically definido parylene-c: sio<sub&gt; 2</sub&gt; substratos

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Plataformas padronização celular apoiar objetivos de pesquisa gerais, tais como a construção de redes neuronais in vitro pré-definidos ea exploração de alguns aspectos centrais da fisiologia celular. Para combinar facilmente padronização celular com Multi-Eletrodo Matrizes (AAM) e à base de silício &quot;laboratório em um chip&quot; tecnologias, um protocolo de microfabricação compatível é necessária. Descreve-se um método que utiliza a deposição do polímero parilene-C em SiO 2. Fotolitografia permite padronização precisa e confiável de parylene-C com resolução de nível micro. A subsequente activação por imersão em soro fetal bovino (ou outra solução de activação específica) resulta em um substrato no qual as células cultivadas aderem, ou são repelidos por, parileno ou SiO 2 regiões, respectivamente. Esta técnica permitiu padronização de uma ampla gama de tipos de células (incluindo as células primárias murino hipocampo, HEK 293 linha celular, teratocarcinoma neurônio-like humanoA linha de células, as células granulares do cerebelo de murino primários, e as células-tronco do tipo derivado de glioma humanas primárias). Curiosamente, contudo, a plataforma não é universal, reflectindo a importância das moléculas de adesão de células específicas. Este processo de padronização celular é rentável, confiável e importante pode ser incorporado em microfabricação padrão (de fabricação de chips) protocolos, abrindo o caminho para a integração da tecnologia microeletrônica.

O processo de padronização fotolitográfica SiO2 com parileno-C encontra-se ilustrada na Figura 1. Uma vez preparada, a activação de fichas em soro fetal bovino permite uma ampla gama de tipos de células para ser modelado em cultura. Nosso grupo tem estampados com sucesso células murinas primários do hipocampo 14-16, a linha de HEK 293 células 17, o neurônio-como teratocarcinoma humano (hNT) linha de células 18, as células granulares do cerebelo murinos primários, e as células-tronco do tipo derivado de glioma humano primários. A Figura 3 ilustra padronização robusto de HEK 293 células em um padrão parylene consistindo de nódulos circulares com as extensões &quot;de cruz&quot;. Chip de activação neste exemplo era com soro fetal bovino. Em contraste, a Figura 4 ilustra o potencial para aumentar a plataforma de padronização usando soluções de activação alternativa. Usando uma solução de albumina de soro bovino (3 mg / ml) e<html> fibronectina (1 ug / ml) em HBSS, a preceito padronização anterior tenha sido invertido. A Figura 5 ilustra um tipo de célula diferente (uma linha principal-humano derivado da haste-como células derivadas de um glioma de alto grau). Aqui, a geometria do comportamento celular impactos padrão subjacente, com o padrão mostrado na Figura 4A a promoção do crescimento celular ao longo de processo fina parilene-C faixas, como mostrado nas Figuras 4B e 4C. Alguns tipos de células não padrão ao utilizar o protocolo de activação de soro fetal bovino estabelecida. Figura 6 ilustra 3T3 L1 crescimento até à confluência com nenhuma diferença cito-repulsivo ou cito-adesiva discernível entre parilene-C e SiO 2 regiões. pload/50929/50929fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Diagrama de fluxo que ilustra o processo para a fabricação de padrões parilene-C em SiO 2. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig2.jpg" /> Figura 2. Fluxo diagrama que ilustra as mudanças no ângulo de contato para estampados parylene-C e SiO 2 domínios durante as etapas de ativação chip. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig3.jpg" /> Figura 3. Imagem de células vivas de células HEK 293 cultivadas em parylene-C/SiO 2 após três dias in vitro. Chips incubados durante 3 horas em soro de bovino fetal após o que as células forambanhados em suspensão numa concentração de 5 x 10 4 células / ml. Parylene-C promove a adesão celular, enquanto nua SiO2 repele células. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig4.jpg" /> Figura 4. Imagem de células vivas de células HEK 293 cultivadas em parylene-C/SiO 2 após três dias in vitro chips activados durante 3 horas em diferentes soluções de activação racionalizado:. A: soro fetal bovino, B: vitronectina (1 ug / ml) em HBSS, C: albumina de soro de bovino (3 mg / ml) + vitronectina (1 ug / ml) em HBSS, D: albumina de soro bovino (3 mg / ml) + fibronectina (156; g / ml) em HBSS. As células foram plaqueadas em suspensão, a uma densidade de 5 x 10 4 células / ml. Note-se como um tratamento diferente do chip resultou na reversão do dogma padronização anterior, com SiO 2 agora adesiva e parylene-C repulsivo. Parylene-C diâmetro nó 250 um, adaptado de Hughes et al. 17 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig4highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig5.jpg" /> Figura 5. Imagens de imunofluorescência de células estaminais do tipo derivado de glioma humano primários cultivados em vários padrões de parileno-C sobre SiO 2 A:. Esquemático que ilustra o desenho reticular parilene mostrado em B e C </strong&gt; B:.. Micrografia de fluorescência de células fixadas (após 4 dias in vitro) corado para proteína ácida fibrilar glial (GFAP) C:. Micrografia de luz de células vivas no mesmo chip D: imagem de fluorescência ilustrando células GFAP-coradas numa parilene diferente E projeto:.. imagem de reflectância do nó e falou projeto parylene fotografada em D <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig5highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig6.jpg" /> Figura 6. Imagens de células vivas de células 3T3 L1 cultivadas em parylene-C/SiO 2 depois de quatro dias in vitro. Chips ativados por 3 horas em soro fetal bovino após wAs células foram plaqueadas em Hich suspensão (3 x 10 4 células / ml). Neste caso, a plataforma não permite padronização, com células tornando-se igualmente confluente em parylene-C e SiO 2 regiões. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig6highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este protocolo descreve um método de microfabricação compatível para padronização de células em SiO 2. Um projeto parylene-C predefinido é photolithographically impresso em SiO 2. Após a incubação com soro (ou outra solução de ativação), as células aderem especificamente (e crescer de acordo com a conformidade de) subjacente parylene-C, enquanto está sendo repelido por SiO 2 regiões.

Padronização celular em photolithographically Definido Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substratos

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

O objetivo geral deste procedimento é padronizar células em superfícies de dióxido de silício de acordo com um desenho subjacente predefinido de paralina. Isso é realizado primeiramente criando uma máscara fotográfica do padrão desejado. O segundo passo é oxidar e, em seguida, revestir uma pastilha de silício com paralina.Os próximos processos fotolitográficos realizados em uma instalação de sala limpa de microeletrônica são utilizados para gravar seletivamente o revestimento de paralina, revelando o desenho desejado. O passo final consiste em ativar os chips primeiramente com ácido piranha e, em seguida, incubá-los em soro bovino fetal por três a doze horas, após o que uma suspensão celular pode ser aplicada para cultura. Em última análise, o padrão celular pode ser avaliado por meio de imagem de células vivas utilizando um microscópio estereoscópico ou após fixação, utilizando microscopia de fluorescência confocal.A principal vantagem desta técnica em relação a várias plataformas existentes de padronização celular é que não há necessidade de levar agentes biológicos para a sala limpa. Além disso, os chips de padrão podem ser armazenados indefinidamente até serem ativados com ácido páraco e, em seguida, soro. Para projetar a configuração desejada de paralina C, utilize um pacote de software editor de layout capaz de ler e gravar arquivos CIF ou GDS dois.Terceirize a fabricação da máscara fotolitográfica para uma instalação microeletrônica adequada ou produza internamente. Caso as instalações existam, oxide uma pastilha de silício em um forno horizontal atmosférico a 950 graus Celsius por 40 minutos para produzir uma camada de dióxido de silício de 200 nanômetros. Em seguida, confirme a espessura em um ponto pequeno.Reflectômetro espectroscópico. Coloque as pastilhas no sistema de deposição a vácuo e aplique o promotor de adesão sine no interior da tampa da câmara. Durante o ciclo de bombeamento, o promotor de adesão sine reveste a carga de pastilhas oxidadas, paraline no forno, depositando paraline C à temperatura ambiente a uma taxa de 1,3 nanômetros por miligrama de dímero, utilizando um sistema de deposição a vácuo.Em seguida, deposite o promotor de adesão HMDS na pastilha revestida com paralina. Utilizando um sistema apropriado de revestimento com resistência fotossensível, gire a pastilha a 4.000 RPM durante 30 segundos enquanto aplica a resistência fotossensível positiva para obter uma espessura de um mícron com o sistema de revestimento, depois faça a pré-cocção da pastilha por 60 segundos a 90 graus Celsius. Agora, insira a pastilha e a máscara fotográfica pré-fabricada em um alinhador de máscaras.Exponha a pastilha revestida com fotoresina à luz UV para transferir o padrão desejado para a fotoresina. Em seguida, aqueça a pastilha exposta por 60 segundos a 110 graus Celsius. Depois, remova toda a fotoresina exposta da pastilha desenvolvendo-a em uma solução reveladora apropriada em Hoff a paralina não protegida utilizando um sistema de ataque por plasma de oxigênio para expor o dióxido de silício subjacente.Em seguida, armazene os chips após o corte em caixas livres de poeira até o momento de uso. Neste procedimento, remova o fotoresiste residual dos chips lavando-os com acetona por 10 segundos. Em seguida, enxágue-os três vezes com H2O destilada desionizada, prepare o ácido piranha fresco em uma capela de exaustão ácida e, posteriormente, limpe e ataque os chips por imersão no ácido piranha por 10 minutos.Em seguida, lave as lâminas três vezes com H2O desionizada e transfira para uma placa de cultura estéril em uma cabine de fluxo laminar para cultura de tecidos. Ative as lâminas para o padrão celular colocando duas lâminas por poço em uma placa de seis poços. A seguir, adicione dois mililitros de soro bovino fetal de modo a imergir completamente todas as lâminas.Incube os chips no soro por três a 12 horas a 37 graus Celsius. Agora remova os chips da sua solução de ativação. Lave uma vez por 10 segundos em solução salina balanceada de Hank.Em seguida, coloque os chips em um poço de cultura e plaque o tipo celular escolhido como uma suspensão no meio de crescimento habitual. A densidade ideal de plaqueamento celular depende tanto do tipo celular quanto do padrão geométrico da paralina C no chip. Uma densidade de cinco vezes 10 à quarta células por mililitro é um ponto de partida razoável.A imagem é adaptada à motivação subjacente para o padronamento celular, mas o comportamento de células vivas pode ser facilmente avaliado usando um microscópio estereoscópico e uma câmera digital com uma lente de acoplamento apropriada. Abaixo, tem-se a imagem de células vivas de HEC 2 93 cultivadas sobre dióxido de silício paralina C após três dias. In vitro, as lâminas foram incubadas por três horas em soro bovino fetal, e as células foram semeadas em suspensão numa concentração de cinco vezes 10 à quarta células por mililitro.A paralina C promove a adesão celular, enquanto o dióxido de silício puro repele as células. Esta figura mostra imagens de imunofluorescência de células-tronco semelhantes a células-tronco derivadas de glioma humano primário cultivadas em diversos padrões de paralina C sobre dióxido de silício. Aqui, o esquema ilustra o design reticular de paralina C, a micrografia de fluorescência de células fixadas coradas para a proteína ácida fibrilar glial e a micrografia de luz de células vivas no mesmo chip.Aqui está uma imagem fluorescente ilustrando células coradas para GFAP em um design de paralina diferente e a imagem de reflexão do nó em design de paralina tipo raio. Esta figura mostra a imagem de células vivas de três células T três L um cultivadas em dióxido de silício de paralina C. Após quatro dias in vitro, os chips foram ativados por três horas em soro bovino fetal, e as células foram semeadas em suspensão numa concentração de cinco vezes 10 à quarta potência de células por mililitro.Neste caso, a plataforma não permite o confinamento celular, pois as células tornam-se igualmente confluentes nas regiões de Lene C e de dióxido de silício. Ao realizar este protocolo, é importante lembrar que a ativação com soro deve ocorrer imediatamente após o tratamento com piranha. A falha em fazê-lo resulta na comprometimento do processo de confinamento.Não se esqueça de que trabalhar com o ácido piranha pode ser extremamente perigoso. Prepare e utilize o ácido piranha em uma capela de exaustão química e certifique-se de usar óculos de proteção apropriados, jalecos e luvas.

cell-patterning-on-photolithographically-defined-parylene-c-sio2

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Non-incrustantes monocamada PEG silano foi dessorvida do eletrodos individualmente endereçáveis ​​ITO sobre vidro por aplicação de um potencial redutor. Eletroquímico através da remoção do PEG-silano camada de microeletrodos ITO permitiu a adesão celular a ter lugar de uma forma espacialmente definida, com padrões de celulares perto correspondente aos padrões de eletrodo.

Células padronização na opticamente transparentes Indium Tin Oxide Eletrodos

Monocamadas auto-organizadas (SAMs) formado a partir de tióis de cadeia longa alcano em ouro proporcionar bem-definida substratos para a formação de padrões de proteínas e confinamento celular. Microcontact impressão de hexadecanethiol usando um carimbo de polidimetilsiloxano (PDMS), seguido pelo preenchimento com um glicol terminada alcano tiol monômero produz um padrão onde proteínas e células absorvem apenas para a região carimbada hexadecanethiol.

Criando Two-Dimensional Substratos modelado para Confinamento de proteína e celular

Aqui nós descrevemos um método simples para padronização funcionalização silício e germânio com monocamadas orgânicas reativas e demonstrar-óxido livre dos substratos padrão com pequenas moléculas e proteínas. A abordagem completamente protege as superfícies da oxidação química, oferece um controle preciso sobre a morfologia característica, e fornece fácil acesso a padrões quimicamente discriminados.

Funcionalização litografia macia e livre de óxido Patterning silício e germânio

Uma abordagem litografia micropunching é desenvolvido para gerar micro e submicron-padrões na parte superior, lateral e superfícies inferiores de polímero substratos. Ela supera os obstáculos da padronização polímeros condutores e gerar padrões de paredes laterais. Este método permite a fabricação rápida de várias características e é livre de química agressiva.

Micropunching Litografia de Geração de Micro e submicrométricas-padrões sobre substratos poliméricos

De duas fases aquosas sistemas foram usados ​​para as populações em simultâneo múltiplos padrões de células. Este método fácil e rápido para a padronização de células tira vantagem da separação de fases de soluções aquosas de dextrano e polietileno glicol e a tensão interfacial que existe entre as duas soluções poliméricas.

Padronização de células co-cultura Usando duas fases aquosas Sistemas

Este relatório descreve uma técnica simples e fácil de executar, usando vácuo de baixa pressão, para preencher canais microfluídicos com células e substratos para pesquisa biológica.

Um método versátil de padronização proteínas e células

Aqui, apresentamos uma bicamada lipídica suportada no contexto de uma plataforma microfluídica para estudar as interações proteína-fosfoinositide usando um método livre de rótulas baseado na modulação do pH.

PIP-on-a-chip: um estudo livre de rótulos de Interações Proteína-fosfoinositide

Apresentamos uma tecnologia que utiliza o conjunto assistido pela capilaridade em uma plataforma microfluida para padronizar objetos microdimensionados suspensos em um líquido, como bactérias e coloides, em matrizes prescritas em um substrato de polidimetilsiloxano.

Padronização de Microrganismos e Micropartículas através da Montagem Sequencial assistida pela Capilaridade

Descrevemos melhorias em um método padrão para medir forças de tração celular, baseado na impressão de microcontatos com uma única etapa de padronização subtrativa de matrizes de pontos de proteínas de matriz extracelular em hidrogéis macios. Este método permite uma fabricação mais simples e consistente dos padrões da ilha, essenciais para controlar a forma do aglomerado celular.

Geração de Padrões para Microscopia de Tração de Micropattern

Tradicionalmente, a cultura celular é realizada em substratos planares que imitam mal o ambiente natural das células in vivo. Aqui descrevemos um método para produzir substratos de cultura celular com geometrias curvas fisiologicamente relevantes e proteínas extracelulares micropatteradas, permitindo investigações sistemáticas sobre o sensoriamento celular dessas pistas extracelulares.

Geração de Microambientes Celulares Multicue por UV-Fotopatterning de Substratos de Cultura Celular Tridimensional

Este protocolo apresenta um método induzido por luz para a fabricação de estruturas tridimensionais escorregadias por meio de padronização digital sequencial e enxertia em superfícies nanoporosas revestidas com silano. Essa abordagem permite a formação espacialmente controlada de regiões escorregadias, permitindo a repelência líquida padronizada e a análise quantitativa do escorregadio interfacial, com aplicações em manipulação de fluidos e engenharia de superfície.

Padronização e enxertia induzida por luz para superfícies escorregadias com base em estruturas nanoporosas revestidas de silano

Aprenda a padronizar células em substratos de SiO₂ usando parylene-C por fotolitografia. Este método permite adesão controlada em regiões definidas, facilitando estudos de comportamento celular em neurociência.

Padronização celular em photolithographically Definido Parylene-C: SiO

Explorar mais vídeos