Quantificação baseada em nanopartículas conjugadas com anticorpos usando microscopia de campo escuro: um procedimento para capturar e quantificar exossomos específicos de fluidos corporais

Os exossomos são pequenas estruturas fechadas por membrana que são secretadas pelas células no espaço extracelular. Os exossomos estão abundantemente presentes nos biofluidos.

Para identificar e capturar exossomos específicos de fluidos corporais, comece fazendo uma lâmina de imunoensaio de vários poços. Esta lâmina é funcionalizada com proteínas que atuam como antígenos e se ligam a anticorpos específicos.

Completar a lâmina com a solução de anticorpos primários pretendida e incubar. Esses anticorpos se ligam aos antígenos pré-revestidos na superfície da lâmina.

Aspire a solução restante para remover quaisquer anticorpos não ligados. Agora, adicione um tampão de bloqueio que bloqueie os antígenos livres, evitando assim a ligação inespecífica de exossomos.

Em seguida, remova o tampão de bloqueio, carregue os exossomos contendo suspensão de soro na lâmina e incuba. Isso permite a ligação exclusiva de exossomos específicos do alvo aos anticorpos primários capturados.

Em seguida, carregue uma suspensão de anticorpos secundários conjugados com nanopartículas de ouro na superfície da lâmina. Esses anticorpos se ligam aos exossomos pré-ligados e formam um complexo de detecção.

Finalmente, usando uma pipeta, descarte quaisquer anticorpos secundários não ligados. Visualize as lâminas sob um microscópio de campo escuro. As nanopartículas de ouro presentes na superfície dos exossomos espalham a luz e aparecem como pontos brilhantes contra o fundo escuro.

Para começar a preparar a lâmina, dilua os anticorpos de captura de exossomo desejados para 0,025 miligramas por mililitro em PBS. Pipetar 1 microlitro da solução em cada alvéolo de uma lâmina tratada com proteína A/G apoiada em vidro de qualidade óptica. Em seguida, transfira a lâmina para uma caixa umidificadora para garantir que os poços não sequem durante a incubação.

Incube a lâmina a 37 graus Celsius por 1 hora para imobilizar os anticorpos de captura. Em seguida, aspire a solução restante para remover os anticorpos não ligados. Lave os poços adicionando e aspirando 1 microlitro de PBS três vezes. Em seguida, carregue rapidamente cada poço com 1 microlitro de tampão de bloqueio baseado em PBS e incube a lâmina a 37 graus Celsius por 2 horas.

Ao executar cerca de 15 amostras, devemos usar uma pipeta de canal único para carregar o tampão de trabalho em 120 poços em menos de 5 minutos para evitar a evaporação do agente bloqueador.

Comece a preparar uma solução de nanobastões de ouro conjugados com anticorpos durante o bloqueio da lâmina. Cerca de 30 minutos antes do término do bloqueio, descongele rapidamente as amostras de plasma ou soro em banho-maria em temperatura ambiente. Vortex as amostras descongeladas por 30 segundos para garantir que as suspensões sejam homogêneas. Em seguida, centrifugue as amostras a 500 x g durante 15 minutos para precipitar agregados de proteínas e outros detritos.

Transferir alíquotas de 10 microlitros dos sobrenadantes para tubos novos e efectuar diluições de um para um com PBS. Misturar as amostras diluídas por vórtice suave ou inversão, conforme apropriado. Quando o bloqueio de lâminas terminar, aspire o tampão de bloqueio e lave os poços três vezes com porções de 1 microlitro de PBS. Carregue imediatamente as amostras nos poços com 1 microlitro por poço e 8 réplicas por amostra.

Carregue os padrões de exossomos nos poços apropriados da mesma maneira. Incube a lâmina por 12 a 18 horas na geladeira a 4 graus Celsius. Em seguida, aspire os poços e lave cada poço uma vez com 1 microlitro de PBS. Carregue 1 microlitro da suspensão de nanobastões de ouro conjugados com anticorpos em cada poço e incube a lâmina a 37 graus Celsius por 2 horas.

Em seguida, aspirar a suspensão de nanobastões e lavar a lâmina em PBS suplementado com 0,01% de polissorbato-20 por 10 minutos usando um misturador. Em seguida, aspire os poços e lave a lâmina em água deionizada por 10 minutos em um misturador rotativo. Remova a água e deixe a lâmina secar ao ar em uma placa de Petri limpa antes de levá-la ao microscópio de campo escuro.