Correlativa luz e de Microscopia Eletrônica Usando Quantum Dot Nanopartículas

O objetivo geral deste método é obter dados correlativos de microscopia de luz e eletrônica, ou CLEM, combinando informações imunocitoquímicas de fluorescência com morfologia ultraestrutural da microscopia eletrônica de transmissão em uma única imagem. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da imunocitoquímica e patologia, como a qual estrutura subcelular é uma proteína específica de interesse associada. A principal vantagem dessa técnica é que ela usa a mesma sonda de nanopartículas de pontos quânticos para obter o sinal de microscopia ao vivo da proteína alvo e a localização estrutural da microscopia eletrônica.

Após fixar, incorporar e seccionar o tecido tumoral do somatostatinoma humano de acordo com o protocolo de texto, prepare uma solução adesiva de corte colocando 20 centímetros de fita adesiva transparente em um frasco de cinco mililitros contendo 2,0 mililitros de acetona e deixe repousar por 10 minutos. Remova a fita e mergulhe uma grade de níquel na solução, depois remova a grade e deixe secar ao ar. Depois de seco, use o lado opaco da grade para pegar uma seção ultrafina.

É fundamental estabelecer o tempo de condicionamento correto para a formulação de resina escolhida. 30 minutos funcionam bem para esta formulação, mas pode precisar ser recalculado para formulações mais duras ou mais macias. Prepare um mililitro de solução fresca de metaperiodato de sódio saturado em água destilada e coloque gotículas da solução em uma superfície limpa de filme de laboratório.

Coloque grades completamente secas com seções nas gotículas e incube em temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, transfira as grades para gotículas de água destilada por 60 segundos para lavá-las. Para realizar a marcação de anticorpos e pontos quânticos, ou QD, em uma superfície de filme de laboratório limpa, pipete gotas de gliceno 0,05 molar e PBS.

Coloque as grades nas gotículas e incube por 10 minutos para bloquear o aldeído residual nas seções. Para remover o bloco de aldeído, seque brevemente a borda da grade. Em seguida, coloque a grade em uma gota de um por cento de soro de cabra normal, ou NGS, e um por cento de BSAC em PBS por 10 minutos.

Prepare um mililitro de solução de bloqueio adicionando 10 microlitros de NGS e 100 microlitros de BSAC a 890 microlitros de PBS. Em seguida, condicione as seções colocando-as em uma gota de diluente de anticorpos por 10 minutos. Em seguida, use o diluente de anticorpos para diluir o anticorpo policlonal anti-somatostatina de um a 10 e coloque as grades nas gotículas da solução.

Incubar em câmara úmida em temperatura ambiente por uma hora. Após a incubação, remova o reagente de anticorpos enxugando a borda da grade. Em seguida, use diluente de anticorpos para lavar as seções duas vezes por cinco minutos cada.

Depois de diluir o anticorpo secundário de um a 10 e preparar as gotas, incubar as grades nas gotículas à temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, remova a solução de anticorpos e lave as seções duas vezes. Diluir os QDs conjugados com estreptavidina de um a 10 e incubar as amostras em gotas da solução no escuro, à temperatura ambiente durante uma hora.

Em seguida, use diluente de anticorpos para lavar as grades duas vezes, cada vez por cinco minutos, e seque a borda das grades. Em seguida, lave as grades em água destilada por dois minutos antes de secar as bordas. Coloque a seção da grade imunocorada em uma gota de água em uma lâmina de vidro e use uma lamínula de vidro para cobri-la.

Para realizar a microscopia de luz de fluorescência, insira um cubo de filtro com as seguintes características e use iluminação LED de 365 nanômetros. Coloque a seção imunomarcada no estágio de microscópio de imunofluorescência. Use microscopia de luz para avaliar o padrão de rotulagem, o nível de qualquer rotulagem não específica e para estabelecer que os controles negativos são claros.

Em seguida, identifique os ROIs em relação às barras da grade. Em seguida, defina uma câmera digital colorida para FL auto color e defina o balanço de branco para 3.200 K.Defina a câmera para o modo de exposição automática com uma configuração de gama entre 0,45 e 1,00 para otimizar a aparência das imagens e ganho analógico definido para um X.Clique no ícone da câmera na interface gráfica do software ZEN Two Light para viver. Em seguida, concentre-se na imagem e clique em Encaixar na interface gráfica do software ZEN Two Light para capturar a imagem para o armazenamento de quadros.

Salve as imagens como arquivos tf para evitar compactação e pixelização. Prepare uma impressão mostrando a posição do ROI em relação às barras da grade ou outros pontos de referência significativos do tecido. Em seguida, remova a grade da lâmina, lave em água destilada e seque suavemente as bordas.

Para realizar a microscopia eletrônica de transmissão, transfira a grade para o microscópio para exame usando uma tensão de aceleração de 100 quilovolts. Comece com uma baixa ampliação de aproximadamente 1.400X para navegar pela grade e encontrar os ROIs com aqueles encontrados com microscopia de luz. Observe QDs individuais com ampliação de 70.000X ou mais.

Eles aparecerão como estruturas cristalinas irregulares com densidade eletrônica moderada. Em seguida, usando uma câmera digital com um sensor monocromático de 1.392 por 1.040 pixels na interface gráfica do software de imagem, clique no ícone da câmera para ligar e adquirir imagens. Mova o ícone da câmera para a posição desligado para armazenar a imagem no armazenamento de molduras.

Para realizar imagens CLEM, use uma impressão da imagem de microscopia de luz para localizar ROIs correspondentes por TEM. Os recursos arquitetônicos de tecido são úteis para a navegação ao redor da seção. Capture uma imagem do ROI correspondente por TEM.

Em seguida, para preparar uma imagem CLEM, certifique-se de que a imagem TEM esteja corretamente orientada e ampliada para o mesmo tamanho e resolução da imagem do microscópio óptico, neste caso, 300 pixels por polegada. Estenda o tamanho da tela da imagem de microscopia de luz para dobrar seu tamanho. Em seguida, copie e cole a imagem TEM ao lado da imagem de fluorescência.

Para criar uma sobreposição de fluorescência no Photoshop CS2, clique na ferramenta letreiro retangular, selecione a imagem fluorescente e crie uma camada duplicada a partir dela. Ajuste as opções de mesclagem de estilo de camada para 30 a 40% de transparência. Em seguida, clique na ferramenta de movimento e arraste a camada de sobreposição de fluorescência sobre a imagem TEM correspondente e alinhe as imagens.

Depois de alinhar as imagens, nivele a imagem para produzir a sobreposição final. Em seguida, use a ferramenta letreiro retangular para selecionar a nova imagem de sobreposição e copiá-la para uma nova tela. Por fim, salve a imagem como um arquivo tf.

Nesta imagem de microscopia de fluorescência, as células tumorais individuais do somatostatinoma contêm grânulos secretores abundantes e foram marcadas positivamente para o hormônio somatostatina. Os núcleos apareceram como buracos escuros e, em baixa ampliação, foi observada uma fluorescência QD laranja granular variavelmente intensa no citoplasma. A ROI escolhida por microscopia de luz foi reconhecida e fotografada usando TEM, referindo-se a uma imagem de microscopia de luz de 20X, conforme indicado aqui.

Em maior ampliação, a célula demonstra fluorescência brilhante e intensa marcação QD em grânulos citoplasmáticos. A sobreposição de dados de fluorescência em imagens MET, como neste exemplo, sugere que uma forte marcação positiva corresponde a grânulos contendo material moderadamente denso em elétrons dentro da membrana limitante da vesícula. Finalmente, como visto aqui em maior ampliação, os grânulos moderadamente densos em elétrons mostraram intensa imunomarcação de nanocristais QD.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em oito horas se executada corretamente. Ao tentar o procedimento, é importante lembrar de manusear as grades com cuidado, apenas pelas bordas. Tocar na seção enquanto pega a grade pode separar a seção da grade.

Após este procedimento, outros métodos, como imunomarcação multiplex, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como se sua proteína de interesse co-localizasse com outra proteína. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da patologia explorarem a localização de proteínas no processo de arquivo de tecido humano para microscopia eletrônica. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como combinar informações imunocitoquímicas da microscopia de luz de fluorescência com a ultraestrutura da microscopia eletrônica de transmissão.

Não se esqueça de que trabalhar com tetróxido de ósmio pode ser extremamente perigoso, e precauções como usar equipamento de proteção, trabalhar em uma capela e descarte adequado de resíduos devem ser tomadas durante a execução deste procedimento.