Correlativa luz e de Microscopia Eletrônica Usando Quantum Dot Nanopartículas

O objetivo geral deste método é obter dados de microscopia correlativa de luz e elétrica, ou CLEM, combinando informações de imunocitoquímica por fluorescência com a morfologia ultra-estrutural obtida por microscopia eletrônica de transmissão em uma única imagem. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área de imunocitoquímica e patologia, como, por exemplo, com qual estrutura subcelular uma determinada proteína de interesse está associada. A principal vantagem desta técnica é que ela utiliza a mesma nanopartícula de ponto quântico como sonda para obter tanto o sinal de microscopia em tempo real da proteína-alvo quanto a localização estrutural em microscopia eletrônica.

Após fixar, embutir e seccionar o tecido tumoral humano de somatostatinoma de acordo com o protocolo descrito, prepare uma solução adesiva para seções colocando 20 centímetros de fita adesiva transparente em um frasco de cinco mililitros contendo 2,0 mililitros de acetona e deixe repousar por 10 minutos. Remova a fita e mergulhe uma grade de níquel na solução, depois retire a grade e deixe secar ao ar. Após secagem, use o lado opaco da grade para recolher uma seção ultrfinas.

É fundamental estabelecer o tempo correto de ataque para a formulação de resina escolhida. Trinta minutos funcionam bem para esta formulação, mas pode ser necessário recalcular esse tempo para formulações mais duras ou mais macias. Prepare um mililitro de solução fresca saturada de periodato de sódio em água destilada e coloque gotas da solução sobre uma superfície limpa de filme laboratorial.

Coloque grades completamente secas com seções sobre as gotas e incube à temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, transfira as grades para gotas de água destilada por 60 segundos para lavá-las. Para realizar a marcação com anticorpo e ponto quântico, ou QD, sobre uma superfície limpa de filme de laboratório, pipete gotas de glicina 0,05 molar e PBS.

Coloque as grades sobre as gotas e incube por 10 minutos para bloquear o aldeído residual nas seções. Para remover o bloqueio de aldeído, aspire brevemente a borda da grade. Em seguida, coloque a grade sobre uma gota de soro de cabra normal a um por cento, ou NGS, e BSA-C a um por cento em PBS por 10 minutos.

Prepare um mililitro de solução bloqueadora adicionando 10 microlitros de NGS e 100 microlitros de BSAC a 890 microlitros de PBS. Em seguida, condicione as seções colocando-as sobre uma gota de diluente para anticorpos por 10 minutos. A seguir, use o diluente para anticorpos para diluir o anticorpo policlonal anti-somatostatina na proporção de um para 10 e coloque as grades sobre gotas da solução.

Incube em câmara úmida à temperatura ambiente por uma hora. Após a incubação, remova o reagente de anticorpo mediante a aspiração na borda da grade. Em seguida, lave as seções duas vezes com diluente de anticorpo, cinco minutos cada lavagem.

Após diluir o anticorpo secundário de um para 10 e preparar as gotas, incubar as grades sobre as gotas em temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, remover a solução de anticorpo e lavar as seções duas vezes. Diluir os pontos quânticos conjugados com estreptavidina de um para 10 e incubar as amostras sobre gotas da solução no escuro, em temperatura ambiente, por uma hora.

Em seguida, use o diluente do anticorpo para lavar as grades duas vezes, por cinco minutos cada vez, e remova o excesso nas bordas das grades. A seguir, lave as grades em água destilada por dois minutos antes de secar as bordas. Coloque a seção da grade imunomarcada em uma gota de água sobre uma lâmina de vidro e cubra-a com uma lamínula de vidro.

Para realizar a microscopia de fluorescência, insira um cubo de filtro com as seguintes características e utilize iluminação LED de 365 nanômetros. Coloque a seção imunomarcada na platina do microscópio de imunofluorescência. Utilize microscopia óptica para avaliar o padrão de marcação, o nível de qualquer marcação inespecífica e para verificar que os controles negativos estão limpos.

Em seguida, identifique as ROI em relação às barras da grade. Depois, configure uma câmera digital colorida completa para cor automática FL e defina o balanço de branco para 3.200 K. Configure a câmera no modo de exposição automática com uma configuração de gama entre 0,45 e 1,00 para otimizar a aparência das imagens, e ganho analógico definido como um X. Clique no ícone da câmera na interface gráfica do software ZEN Two Light para visualização ao vivo. Em seguida, foque a imagem e clique em Snap na interface gráfica do software ZEN Two Light para capturar a imagem no armazenamento de quadros.

Salve as imagens como arquivos tf para evitar compressão e pixelização. Prepare uma impressão mostrando a posição da ROI em relação às barras da grade ou a outras estruturas anatômicas significativas do tecido. Em seguida, remova a grade do lâmina, lave com água destilada e seque suavemente as bordas com papel absorvente.

Para realizar microscopia eletrônica de transmissão, transfira a grade para o microscópio para exame usando uma tensão de aceleração de 100 quilovolts. Comece com baixa ampliação de aproximadamente 1.400X para navegar pela grade e localizar as regiões de interesse (ROIs) identificadas com microscopia de luz. Observe pontos quânticos individuais com ampliação de 70.000X ou superior.

Eles aparecerão como estruturas cristalinas irregulares com densidade eletrônica moderada. Em seguida, utilizando uma câmera digital com sensor monocromático de 1.392 por 1.040 pixels na interface gráfica do software de imagem, clique no ícone da câmera para ligar e adquirir as imagens. Mova o ícone da câmera para a posição desligado para armazenar a imagem na memória de quadros.

Para realizar a imagem CLEM, utilize uma impressão da imagem de microscopia de luz para localizar as ROI correspondentes por MEV. Características arquitetônicas do tecido são úteis para a navegação pela seção. Capture uma imagem da ROI correspondente por MEV.

Em seguida, para preparar uma imagem de CLEM, certifique-se de que a imagem de MET está corretamente orientada e ampliada para o mesmo tamanho e resolução da imagem do microscópio óptico, neste caso, 300 pixels por polegada. Amplie o tamanho da tela da imagem de microscopia óptica para o dobro do seu tamanho original. Em seguida, copie e cole a imagem de MET ao lado da imagem de fluorescência.

Para criar uma sobreposição de fluorescência no Photoshop CS2, clique na ferramenta de seleção retangular, selecione a imagem fluorescente e crie uma camada duplicada a partir dela. Ajuste as opções de mesclagem do estilo da camada para uma transparência de 30 a 40%. Em seguida, clique na ferramenta de movimento e arraste a camada de sobreposição de fluorescência sobre a imagem correspondente de MEV, alinhando as imagens.

Após alinhar as imagens, achate a imagem para produzir a sobreposição final. Em seguida, utilize a ferramenta de seleção retangular para selecionar a nova imagem de sobreposição e copiá-la para uma nova tela. Por fim, salve a imagem como um arquivo tf.

Nesta imagem de microscopia de fluorescência, células tumorais individuais de somatostatinoma contêm grânulos secretórios abundantes e foram rotuladas positivamente para o hormônio somatostatina. Os núcleos apareceram como orifícios escuros e, em baixa ampliação, observou-se fluorescência granular laranja de pontos quânticos (QD) de intensidade variável no citoplasma. A região de interesse (ROI) escolhida por microscopia de luz foi reconhecida e imageada usando MET, referindo-se a uma imagem de microscopia de luz de 20X, conforme indicado aqui.

Em maior aumento, a célula demonstra fluorescência intensa e marcação forte com pontos quânticos em grânulos citoplasmáticos. A sobreposição dos dados de fluorescência em imagens de microscopia eletrônica de transmissão (TEM), como neste exemplo, sugere que a marcação positiva acentuada corresponde a grânulos contendo material moderadamente denso em elétrons dentro da membrana limitante da vesícula. Finalmente, como observado aqui em maior aumento, os grânulos moderadamente densos em elétrons exibiram marcação intensa com nanocristais de pontos quânticos por imunomarcação.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em oito horas, se executada corretamente. Ao realizar o procedimento, é importante lembrar de manipular as grades com cuidado, apenas pelas bordas. Tocar a seção ao pegar a grade pode destacar a seção da grade.

Após este procedimento, outros métodos como a imunomarcação múltipla podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como se sua proteína de interesse co-localiza com outra proteína. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de patologia explorarem a localização proteica em tecidos humanos arquivados, processados para microscopia eletrônica. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como combinar informações imunocitoquímicas da microscopia de fluorescência com a ultraestrutura da microscopia eletrônica de transmissão.

Não se esqueça de que o trabalho com tetroxido de ósmio pode ser extremamente perigoso, e precauções como o uso de equipamentos de proteção, trabalho em capela de exaustão e descarte adequado de resíduos devem ser tomadas ao realizar este procedimento.