Name: Detecção de nanopartículas fluorescentes Interações com Primário imunitário subpopulações de células por citometria de fluxo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Aprenda a detectar interações de nanopartículas fluorescentes com subpopulações de células imunes primárias por citometria de fluxo. Este método permite quantificar a internalização em diferentes tipos celulares.

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Este trabalho foi financiado pela Fondazione Istituto Italiano di Tecnologia. Os autores gostariam de agradecer Miltenyi Biotec GmbH (Bergisch Gladbach, Alemanha) para o patrocínio deste manuscrito, Dr. Paolo Petrucciani (Departamento de Imuno-hematologia e serviço de transfusão, Hospital Lotti Pontedera, Pisa, Itália) para a prestação de buffy coats humanos e Prof Massimo Pasqualetti (Departamento de Biologia - Unidade de Biologia Celular e do Desenvolvimento, da Universidade de Pisa, Pisa, Itália) para a habitação a colônia mouse.

ÉTICA DECLARAÇÃO Amostras humanas e animais foram processados ​​de acordo com as diretrizes do Ministério da Saúde italiano, a lei 116/92 e da Directiva 86/609/CEE do Conselho Comunidades Europeias. 1. As culturas de células monócitos <ol><li> Culturas humanos THP-1 em células T-75 frascos contendo meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro humano, 50 U / ml de penicilina e 50 mg / ml de estreptomicina, 0,05 mM β-mercaptoetanol a 37 ° C em 5% de CO 2. </li><li> Culturas Dividir quando confluentes (a cada 3-5 dias). </li></ol> 2. Isolamento de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) a partir de Buffy Coats <ol><li> Antes de iniciar o protocolo de isolamento, preparar uma solução de tampão fosfato salino (PBS) pH 7,2, 2 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 0,5% de albumina sérica bovina (BSA), a adição de 5 ml de BSA da solução para 95 ml de tampão de enxaguamento (1: 20 diluição). Degas o buffer e mantê-lo frio (2-8° C). IMPORTANTE: A não degas a reserva pode resultar em menos do que ideal resultados porque as bolhas podem bloquear a coluna isolamento (veja o passo 3.2). Nota: Anticoagulante citrato dextrose fórmula-A (ACD-A) ou citrato fosfato dextrose (CPD) pode ser usado em alternativa. Por outro lado, outras proteínas de albumina ou de soros provenientes de outras espécies pode substituir BSA. Não use tampões contendo Ca 2 + ou Mg 2 +. </li><li> Obter capa flogística de doadores saudáveis ​​(com idades entre 20-60 anos de idade). </li><li> Prepare 50 ml tubos cônicos de gradiente de densidade centrifugação. Determinar o número de tubos necessários para o processamento de sangue (cada tubo pode processar 35 ml de sangue diluído) e adicionar 15 ml de Ficoll-Paque em cada tubo vazio. </li><li> Dilui-se 8 ml de sangue com 24 ml de / BSA a solução de EDTA PBS / (1:4 diluição). </li><li> Camada cuidadosamente a solução diluída no topo do Ficoll-Paque (densidade = 1,077 g / ml) em cada um dos tubos de 50 mL cónicos. Não mistureo sangue e de Ficoll-Paque. IMPORTANTE: Para evitar a mistura do sangue e Ficoll-Paque, mantenha o tubo em um ângulo de 45 ° e camada da mistura de sangue lentamente. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 30 min a 4 ° C. As células mononucleares (MNCs) permanecerá na interface plasma-Ficoll-Paque, enquanto granulócitos e eritrócitos de sedimentos devido à maior densidade na pressão osmótica de Ficoll-Paque. </li><li> Transferir as células de interfase (células mononucleares do sangue periférico, PBMCs) para um novo tubo de 50 ml cheio com PBS / BSA / EDTA e centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Lava-se a pelete duas vezes com PBS / BSA / EDTA para remover as plaquetas. Girar a 200 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Cultura as células em completo RPMI-1640 com 10% de soro humano e antibióticos ou prosseguir para monócitos purificação. </li></ol> 3. Purificação de monócitos a partir de PBMC primária <ol><li> Isolar monócitos de PBMC por esférulas magnéticas separação usando Hum.um kit de isolamento de monócitos Pan: <ol><li> Passar as células através de uma malha de nylon de 30 um (filtros de pré-separação de 30 mm), para remover eventuais grumos celulares. </li><li> Determinar o número de células usando um hemocitômetro. </li><li> Suspensão de células de centrifugar a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente (RT). Aspirar o sobrenadante completamente. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 30 ul de tampão de PBS / EDTA / BSA por cada 10 7 células totais. </li><li> Adicionar 10 ul de reagente de bloqueio FcR por 10 7 células totais. </li><li> Adicionar 10 ml de Cocktail Biotina-Anticorpo por 10 7 células totais. </li><li> Misturar bem e incubar durante 5 min a 2-8 ° C. </li><li> Adicionar 30 mL de tampão por 10 7 células totais. </li><li> Adicionar 20 ul de microesferas anti-biotina por 10 7 células totais. </li><li> Misturar bem e incubar durante 10 min a 2-8 ° C. </li><li> Ressuspender 8 até 10 células em 500 ul de tampão de PBS / EDTA / BSA. </li></ol></li><li> Separ magnéticoção <ol><li> Assim que o número total de células, escolha uma coluna de MACS apropriado e MACS Separador (ver MACS Coluna folha de dados). </li><li> Colocar a coluna no campo magnético do separador MACS. </li><li> Prepare a coluna por lavagem com a quantidade apropriada de tampão de PBS / EDTA / BSA (colunas MS: 500 ul; colunas LS: 3 ml). Nota: As colunas são &quot;parada fluxo&quot; e não secam. </li><li> Aplicar a suspensão de células para dentro da coluna. Colete de fluxo contendo células não marcadas, o que representa a fração de monócitos enriquecido. </li><li> Lave coluna 3x com tampão PBS / EDTA / BSA (500 mL de MS e 3 ml para LS por lavagem). </li><li> Coletar as células não marcadas que passam, representando as células monócitos enriquecidos, e adicione ao fluxo através da seção 3.2.4. Nota: Lava-se a coluna por adição de alíquotas de tampão de PBS / EDTA / BSA apenas quando o reservatório está vazio da coluna. </li><li> (Opcional) Retirar a coluna doseparador e coloque-o em um tubo de coleta adequado. Pipetar o tampão na coluna (colunas MS: 1 ml; colunas LS: 5 ml). Lave imediatamente as células nonmonocyte magneticamente rotulados com firmeza empurrando o êmbolo para a coluna. </li><li> Cultura de monócitos em meio RPMI-1640 completo purificado com 10% de soro humano e antibióticos. </li></ol></li></ol> 4. A purificação do primário a partir de monócitos de sangue inteiro <ol><li> Purifica-se monócitos a partir de sangue total usando o kit de isolamento de monócitos de sangue inteiro, seguindo as instruções do fabricante. </li></ol> 5. Nanopartículas Internalização no sangue leucócitos e monócitos purificados <ol><li> Placa de 5 x 10 5 células / ml (1 ml / cavidade) das PBMC isoladas ou purificadas os monócitos CD14 positivos em uma placa de 12 poços. </li><li> Vortex FITC-SiO 2 nanopartículas solução estoque e ressuspender em meio completo a uma concentração de trabalho de 100 nM. </li><li> Adicionar 10 ul de nanop de trabalhosuspensão de artigo (100 nM) nas amostras tratadas para atingir uma concentração final de nanopartículas de 1 nM. Adicionar o mesmo volume de meio completo de controlos não tratados para cada poço. </li><li> Depois de 1 hr a internalização recolher as amostras em tubos de polipropileno de 1,5 ml e centrifugar para durante 3 minutos a 6000 xg à temperatura ambiente. </li><li> Lava-se a pelete com 1 ml de tampão de corrida 3 min a 6000 xg à temperatura ambiente. </li><li> Ressuspender o sedimento em 200 ul de tampão de corrida. As células são agora pronto para a leitura, por citometria de fluxo. </li></ol> 6. Isolamento de culturas mista glial primárias (Veja Bertero et al. 7) 7. Repique uma cultura de células gliais Confluent Mista <ol><li> Lavar um frasco T-75, uma vez com 10 ml de PBS (w / o Ca 2 + / Mg 2 +), em seguida, adicionam-se 10 mL de Versene e incubar a 37 ° C durante 5-7 min. </li><li> Pipeta-se o sobrenadante para cima e para baixo várias vezes, de modo a separar as células da superfície do T-75 e dissolveragregados celulares. </li><li> Transferência da suspensão de células em tubos de polipropileno de 15 ml. Recolha uma pequena quantidade de suspensão celular para contagem das células com um hemocitómetro. </li><li> Centrifugar a suspensão de células durante 5 min a 300 xg à temperatura ambiente. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em uma concentração final de 5 x 10 5 células / ml em meio de cultura completo glial. </li><li> Placa de 0,5 ml / poço numa placa de 24 poços e deixar que as células se contentar com 2-4 horas antes do tratamento de nanopartículas. </li></ol> 8. Nanopartículas Internalização em Microglia <ol><li> Adicionar 500 ul de meio de cultura completo glial (para os controlos não tratados) ou 500 ul de uma suspensão 2x Rodamina-SiO2 nanopartículas em meio de cultura completo glial (para amostras tratadas) para cada poço. </li><li> Pipetar as células para permitir o destacamento das células nonrapid-aderente em pontos de tempo seleccionados e recolher em tubos de polipropileno de 2 ml. </li><li> Adicionar 500 mLde Versene a cada poço e incubar a placa a 37 ° C durante 5 min, em seguida, separar a fracção celular remanescente e recolher cada amostra com as correspondentes células nonadhering da etapa anterior. </li><li> Centrifugar as amostras durante 3 minutos a 300 xg à temperatura ambiente. </li><li> Ressuspender o sedimento em 100 ul de tampão de corrida AutoMACS. </li></ol> 9. A coloração com CD11b-VioBlue <ol><li> Adicionar 10 ul de VioBlue-CD11b anticorpo humano / ratinho 100 ul de suspensão de células (razão 1:11) em tampão de corrida e incubar 10 min a 4 ° C. </li><li> Adicionar 1 ml de tampão de corrida e misturar a suspensão de células. </li><li> Centrifugar cada amostra durante 3 minutos a 300 x g. </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 100-150 mL de tampão de corrida. </li><li> Ler as amostras para o citómetro (armazenar as amostras a 4 ° C entre os dois últimos passos). IMPORTANTE: antes de analisar as amostras, proceder à compensação da sobreposição de sinais iOs espectros de emissão n observada entre diferentes fluorocromos (nanopartículas ou anticorpos fluorocromo-conjugados). </li></ol> 10. Derramamento espectral sobre Compensação <ol><li> Abra a caixa de &quot;Configurações do instrumento&quot; (presente em todos os programas de software de instrumento). Nota: Se estiver usando um instrumento diferente do relatado na tabela de materiais, por favor consulte o manual específico instrumento para os detalhes da aquisição. </li><li> Adquirir amostra não tratada (sem nanopartículas) em baixa velocidade fluídico (se permitido pelo instrumento). Durante a aquisição, ajustar manualmente para a frente eo lado de dispersão (FSC e SSC, respectivamente), regulando os canais de tensão. Nota: Modificar as escalas dos eixos SSC e FSC, a fim de melhor visualizar a população de células completo na trama. Um instrumento definir modelo para cada tipo de célula de interesse pode ser criado, salvo e usado para futuras aquisições. </li><li> Abra o específicoSeparador &quot;região&quot; no software. Desenhe uma região grande apropriada (&quot;gate&quot;) em torno da população desejada. Nota: Internalização de nanopartículas induz uma mudança SSC das células. Se a porta é muito estreita restrito em torno da população de células de interesse, os dados adquiridos provavelmente vai perder parte das células a serem detectados. </li><li> Use duas amostras não coradas, um para uso como amostra em branco e uma de indemnização contra coloração PI (opcional), um single-coradas amostra com o fluorocromo apropriado para cada canal de fluorescência para ser compensado. Nota: Utilizar um tubo de 1,5 ml de amostra diferente para cada um dos anticorpos conjugados com fluorocromos para ser utilizada na rotulagem experimento. </li><li> Abra a aba &quot;Compensação&quot; na caixa &quot;Configurações do Instrumento&quot;. Aumentar ou diminuir o fator de compensação durante a aquisição até a intensidade de fluorescência no canal spillover é mais ou menos o mesmo para o pos fluorocromotivo e da população negativa. </li><li> Adquirir amostras tratadas com nanopartículas após a compensação foi ajustado. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que Miltenyi Biotech GmbH patrocinou a apresentação deste manuscrito. HiQ-Nano Company ( <a href="http://www.hiq-nano.com/index.html">http://www.hiq-nano.com/index.html</a> ) é um nanotecnologia spin off da empresa surgiu a partir de IIT.

O protocolo experimental apresenta pontos muito importantes a serem levados em conta. É muito importante para o trabalho a 4 ° C (em gelo) e, possivelmente, no escuro, durante todas as etapas de coloração, porque temperaturas mais altas e as luzes podem afectar negativamente o rendimento de coloração. Nanopartículas pode ser sonicada para ser melhor ressuspenso imediatamente antes da utilização. Um fluxo correto citometria análise requer uma calibração correta nos diferentes canais. A calibração do instrumento deve ser realizada antes de cada sessão experimental. Além de problemas técnicos com a instrumentação, não pode haver também problemas com a rotulagem de anticorpos. É obrigatório para utilizar o anticorpo numa concentração apropriada. Se a concentração é muito alta ou muito baixa, a intensidade de sinal de insatisfação pode ser a conseqüência. As desvantagens desta preocupação técnica, a necessidade de trabalhar com amostras monodispersas, à incapacidade de localizar olocal de origem do sinal (isto é, diferentes compartimentos celulares). Existem também algumas limitações na escolha de fluorocromos que ser utilizadas, em combinação: o comprimento de onda da excitação e as bandas de emissão tem de ser suficientemente separadas para permitir a sua medição apropriado. Se os espectros de anticorpos utilizados sobrepõem, é necessária uma compensação correcta. A citometria de fluxo é um método poderoso para a análise de células, na presença ou ausência de nanopartículas. Esta técnica permite um estudo multiparamétrica de uma célula, um grande número de eventos analisados, rapidez de análise (mais de 1000 células / seg), reprodutibilidade e leituras estatísticos. As amostras podem ser processadas sem perder a viabilidade celular. Usando nanopartículas marcados com fluorescência é possível qualificar e quantificar a sua internalização em subpopulações de células, que são identificados por meio de marcadores específicos expostos na membrana celular. Parâmetros celulares podem mudar em presença de s<html> nanopartículas ESPECÍFICAS. Dependendo do objectivo da pesquisa, estas variações podem ser utilizadas para identificar um fenómeno específico, tal como espalhamento lateral das células que, proporcionalmente, aumenta com o aumento da taxa de internalização de nanopartículas. Modificações induzidas por nanopartículas de superfície celular também pode representar uma limitação da técnica. Por esta razão, o volume de receptores de membrana celular deve ser sempre levada em consideração e, possivelmente, conhecida com antecedência, para caracterizar com precisão a população de células de interesse. Deficiências extremas de membrana de osmose em amostras de nanopartículas sobrecarregado pode levar à morte da célula. Nanomaterial toxicidade dependente da dose deve ser empiricamente testados para cada população de células. Células mortas bem definido devem ser excluídos da quantificação de fluorescência. Por exemplo, a coloração de anexina V / PI é um dos vários métodos geralmente utilizados para detecção de células tanto em necrose e apoptose. &quot;&gt; Células primárias expressando GFP são também uma ferramenta poderosa para selecionar uma determinada subpopulação de células e coletar dados sem prelabeling. A combinação com nanopartículas fluorescentes complementares permite uma quantificação muito rápido e precisa de interação célula-nanopartícula. Entrega da droga ou gene é pensado para ser melhorado no futuro, a aplicação de nanopartículas capazes de liberar uma carga específica de drogas em tecidos selecionados. Emprego de nanopartículas como moduladores específicos portadores de entrega e / ou imunes para farmacêutico requer o conhecimento do ambiente biológico (ou seja, por meio de citometria de fluxo) para estudar as interações célula-nanopartículas.

Nanomateriais são hoje inspirando o interesse de cientistas de vida para os potenciais aplicações para a biomedicina 1. Uma grande variedade de materiais inorgânicos e orgânicos podem ser utilizados para a produção de nanoestruturas com diferentes formas físicas, e características químicas. Entre essas estruturas, nanopartículas de forma esférica demonstrado grande potencial para a medicina diagnóstica e de translação 2. O seu núcleo e design de superfície são movidos por uma possível aplicação e implica um estudo profundo de respostas das células-alvo após o contato de nanopartículas e interação. As nanopartículas que são pensados ​​para ser administrado deliberadamente a seres humanos vai entrar em contato direto com vários tipos de células do sistema imunológico. A sua responsabilidade de manter a integridade do corpo torna um tema crucial da investigação em nanomedicina 3. A parte celular do sistema imunológico inato é representada principalmente por phagocitos. Entre eles, a linhagem dos monócitos / macrófagos, células derivadas, incluindo as microglia residentes no sistema nervoso central, desempenha um papel fundamental na defesa imunológica 4,5. Eles são capazes de desencadear respostas de protecção dentro de poucas horas após encontrar com corpos estranhos. Além disso, coordenar as células monocíticas e instruir a resposta imune adaptativa por meio da liberação de citocinas. Todos estes acontecimentos ocorrem mesmo na presença de materiais fabricados, os quais são em grande parte percebidos como &quot;não-eu&quot; pelo sistema imunitário 6. Entre os métodos historicamente utilizados em imunologia para análise das células, citometria de fluxo representa uma das ferramentas mais poderosas. Além disso, a disponibilidade de tecnologias para a identificação ou purificação de uma subpopulação específica imune (geralmente explorando a exclusão ou a presença de uma única proteína de membrana) permite uma investigação exacta dos efeitos de um determinado nanopartículas em que ce primário especialll tipo 7. No entanto, as células podem apresentar alterações fisiológicas e morfológicas após exposição a nanopartículas. Além disso, as nanopartículas podem interferir com os parâmetros ópticos específicos, tais como a absorção ou emissão de luz em comprimentos de onda definidos, influenciar os resultados obtidos 8. Assim, os limites de utilização e eventuais adaptações de ensaios imunológicos clássicos para o estudo de novos materiais devem ser considerados. Este trabalho refere-se à detecção de interações de nanopartículas com células imunes primárias por citometria de fluxo. Para abordar esta questão, 50 nm FITC-SiO 2 nanopartículas foram empregados como um nanomaterial modelo para descrever o método. As partículas de sílica podem ser produzidas de uma maneira muito precisa em escala nanométrica. Tamanho, forma, e propriedades de superfície, tais como carga ou hidrofobicidade, pode ser afinado para aumentar a sua biocompatibilidade 9. Muitos recursos de SiO 2 nanopartículas lhes permitem ser utilizado como ummodelo para a entrega da droga partículas 10. Além disso, corantes fluorescentes ou pontos quânticos pode ser preso ou ligados a estas partículas nano-oferecendo ferramentas úteis para fins de imagem 11.

<table><tbody><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14170-088</td><td>Quente em 37 &deg; C banho-maria antes do uso</td></tr><tr><td>RPMI-1640 (Modificado ATCC)</td><td>Gibco</td><td>A10491-01</td><td>Quente em 37 &deg; C banho-maria antes do uso</td></tr><tr><td>DMEM, Alta Glicose, vermelho de fenol</td><td>Gibco</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina, Líquido</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Gibco</td><td>15710-049</td><td></td></tr><tr><td>Soro de Cavalo (lote n&deg; 1131917)</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina 2,5%</td> <td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Soro Humano Agrupado</td><td>Invitrogen</td><td>34005100</td><td></td></tr><tr><td>Versene</td><td>Invitrogen</td><td>15040-033</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5025-150KU</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-VioBlue humano e camundongo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-336</td><td></td></tr><tr><td>MACS BSA Stock Solution&nbsp;</td>Solução de Enxágue <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td></td></tr><tr><td>Buffer de corrida</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-747</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Running Buffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Kit de isolamento de monócitos Human Pan&nbsp;</td><td>Kit de Coluna de Sangue Total Miltenyi Biotec</td><td>130-096-537</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-545</td><td></td></tr><tr><td>MicroBeads CD14 de Sangue Total, humano</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-879</td><td></td></tr><tr><td>Coluna MS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Coluna LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Separador MidiMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Separador MiniMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Lise de Células Vermelhas para Células Sanguíneas&nbsp;</td>Filtros de Pré-separação <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-183</td><td></td></tr><tr><td>30 &micro; m</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer citômetro de fluxo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-197</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Contas de calibração</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-607</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Premium</td><td>GE Healthcare</td><td>GEH17544202</td><td></td></tr><tr><td>FITC-SiO2 nanopartículas (50 nm, +45 mV)</td><td>HiQ-Nano Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanopartículas de rodamina-SiO2 (50 nm, +45 mV)</td>Placa de 12 poços <td>da HiQ-Nano Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon</td><td>Becton Dickinson</td><td>353043</td><td></td></tr></tbody></table>

detecção de nanopartículas fluorescentes interações com primário imunitário subpopulações de células por citometria de fluxo

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Nanopartículas são dotados de propriedades muito promissoras para fins terapêuticos e de diagnóstico. Este trabalho descreve um método rápido e confiável de análise por citometria de fluxo para estudar a interação de nanopartículas com células do sistema imunológico. Células imunitárias primárias podem ser facilmente purificadas a partir de tecidos humanos ou de rato por isolamento magnético mediada por anticorpos. No primeiro caso, as diferentes populações de células que funcionam num citómetro de fluxo pode ser distinguida pela luz dispersa para a frente-(FSC), que é proporcional ao tamanho da célula, e a luz dispersa-lateral (SSC), relacionados com a complexidade celular interna. Além disso, os anticorpos marcados com fluorescência contra receptores específicos da superfície celular permite a identificação das várias subpopulações de dentro da mesma amostra. Muitas vezes, todos esses recursos variam quando as células são impulsionadas por estímulos externos que mudam seu estado fisiológico e morfológico. Aqui, de 50 nm de FITC-SiO 2 nanopartículas são usadas como um modelo para identificar the internalização de materiais nanoestruturados em células imunitárias do sangue humano. A fluorescência celular e leve aumento espalhadas do lado após incubação com nanopartículas nos permitiu definir o tempo ea dependência concentração de interação de células de nanopartículas. Além disso, tais protocolos pode ser estendida para investigar Rodamina-SiO 2 nanopartículas interacção com microglia primário, as células do sistema imunológico residentes no sistema nervoso central, isolado a partir de ratinhos mutantes que expressam especificamente a proteína verde fluorescente (GFP) da linhagem monócito / macrófago. Finalmente, a citometria de fluxo de dados relacionados com a nanopartícula interiorização nas células ter sido confirmada por microscopia confocal.

A citometria de fluxo é uma ferramenta útil para identificar e caracterizar as células diferentes, e é a técnica escolhida para identificar células específicas do sistema imunológico, tais como monócitos, granulócitos, células T, células B, células assassinas naturais (NK), as células dendríticas (DC), e outras subpopulações de leucócitos. No esforço para caracterizar melhor o comportamento de células brancas do sangue, em resposta a nanopartículas, realizamos ensaios de internalização com leucócitos primários isolados a partir do sangue de dadores saudáveis, (Figuras 1 e 2) e com a linha celular de monócitos humanos (células THP-1, a Figura 3) . Como apresentado na Figura 1A, os três principais subpopulações de leucócitos no sangue foram claramente identificadas por dispersão para a frente e lateral, após isolamento PBMC. Além disso, depois de FITC-SiO 2 de tratamento, os linfócitos (cinzento), monócitos (azul) e granulócitos (vermelho) têm um n diferentetaxa de internalização anoparticle como mostrado pela intensidade da fluorescência verde (Figura 1B). O protocolo descrito permite a purificação da CD14 monócitos positivos primários de PBMC. Figura 2A relata a citometria de fluxo gráfico de pontos de monócitos CD14 + na presença de FITC-SiO2. Figura 2B mostra FITC-SiO2 internalização quantificada nas mesmas células e expressa nas histograma escala logarítmica. Experiências de internalização semelhantes foram realizados em monócitos THP-1 tratadas com concentrações crescentes de FITC-SiO 2 nanopartículas. As células não tratadas foram utilizados como controlo negativo. Figura 3A mostra um aumento dependente da dose na dispersão lateral com uma frente inalterada espalhamento em células THP-1 da linha celular. Na Figura 3B, em conjunto com os histogramas de SSC e FSC em cada FITC-SiO 2 nanopartículas concentração testada, a intensidade média de fluorescência (MFI) quantificação é apresentado. Estes dados sugerem que o tratamento com FITC-SiO 2 nanopartículas induz uma internalização dependente da dose em monócitos destacadas pelo aumento da granularidade intracelular (dispersão lateral) e fluorescência (canal verde). Para ganhar novos insights sobre o tipo de interação entre células do sistema imunológico e nanopartículas, culturas gliais mistos primários foram isolados e microglia, as células do sistema imunológico residentes sistema nervoso central, foi purificada. A utilização de um modelo de ratinho transgénico expressando microglia fluorescente verde permite a visualização de diferentes mecanismos neuro-inflamatórios. O ratinho transgénico B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J usado neste trabalho expressa a proteína fluorescente verde (GFP) sob o controlo do promotor 12, CX3CR1. Após 7 dias in vitro (DIV), microscopia de fluorescência mostra uma cultura de células gliais primário misturado com um grande número de astrócitos (GFP celular aderente negativos) e algumas células verdes (GFP positivo, Figura 5A). Neste modelo de rato, três subpopulações da glia podem ser distinguidos por citometria de fluxo com uma única coloração CD11b-anticorpo: o primeiro CD11b - GFP - (astrócitos e outras células da glia), um segundo grupo distinto de células microgliais GFP CD11b + +, e um terceiro GFP CD11b + - subpopulação (Figura 4A). Estes dois últimos subpopulações são ambos capazes de internalizar nanopartículas com um ligeiro aumento da eficiência da GFP + população (representando a microglia imaturo patrulha pela transcrição de CX3CR1 promotor), como mostrado por citometria de fluxo (Figura 4B). A internalização ocorreu pode ainda ser verificada por meio de microscopia confocal utilizando a mesma concentração final de Rodamina-SiO 2 nanopartículas como mostrado na Figura 5B. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page= &quot;Always&quot;&gt; <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig1.jpg" /> Figura 1. FITC-SiO 2 internalização de nanopartículas em leucócitos isolados. A) frente Representante espalhando (FSC) versus dispersão lateral (SSC) citometria de fluxo gráfico de pontos de Ficoll-Paque leucócitos isolados. B) sobreposição de fluorescência verde histograma enredo dos três principais de leucócitos no sangue subpopulações de células na presença de 1 Nm FITC-SiO 2 nanopartículas (+45 mV) para 1 hora. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig2.jpg" /> <strong&gt; Figura 2. FITC-SiO 2 internalização de nanopartículas em CD14 + monócitos purificados. A) para a frente Representante espalhando (FSC) versus dispersão lateral (SSC) citometria de fluxo gráfico de pontos de purificadas monócitos CD14 positivas. B) fluorescência verde histograma enredo da subpopulação de monócitos purificada em presença de 1nM FITC-SiO 2 nanopartículas (+45 mV) para 1 hora. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig3.jpg" /> Figura 3. Efeitos do FITC-SiO 2 nanopartículas internalização em células THP-1. A) Encaminhar Representante espalhando (FSC) versus scatterin ladog (SSC) citometria de fluxo gráfico de pontos de THP-1 linha celular de monócitos, após 1 h de exposição de FITC-SiO 2 nanopartículas aumento da concentração. B) variação dependente da concentração da dispersão lateral (SSC), a frente de dispersão (FSC) e verde fluorescência na presença de FITC-SiO 2 nanopartículas (+45 mV) para 1 hora. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig4.jpg" /> Figura 4. Rodamina-SiO 2 nanopartículas internalização em microglia primário isolado do B6.129P-CX3CR1 camundongos tm1Litt / J. A) a proteína fluorescente verde (GFP) versus fluxo CD11b-VioBlue citometria gráfico de pontos de prglia misto imary isolado a partir B6.129P-CX3CR1 ratinhos tm1Litt / J. CD11b + GFP + e CD11b + GFP - populações são mostrados no canto superior direito e quadrantes inferior direito, respectivamente B) fluorescência Red sobreposição de histograma trama de subpopulações microglia na presença de 1 Nm Rhodamine-SiO 2 nanopartículas (+45 mV) para 30. min (histograma vermelho) versus controle (histograma cinza). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig5.jpg" /> Figura 5. A visualização de GFP +-microglia. (A) A microscopia de fluorescência em 7 DIV e (B) A microscopia confocalde Rodamina-SiO 2 nanopartículas internalização (setas vermelhas) em GFP +-microglia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig5highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Análise da interação de nanopartículas com subpopulações definidas de células do sistema imunológico, por citometria de fluxo.

Detecção de nanopartículas fluorescentes Interações com Primário imunitário subpopulações de células por citometria de fluxo

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

O objetivo geral deste procedimento é detectar interações de nanopartículas fluorescentes com subpopulações primárias de células imunes por citometria de fluxo. Isso é realizado primeiramente tratando as células de interesse com as nanopartículas. Na etapa seguinte, as células são marcadas com anticorpos contra marcadores superficiais específicos das células e então analisadas por citometria de fluxo.Por fim, pode-se medir a interação das nanopartículas com populações individuais de células imunes. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a microscopia, é que com ela é possível quantificar variações nas intensidades de fluorescência induzidas por nanopartículas em populações de células não aderentes. Para internalização de nanopartículas em leucócitos sanguíneos ou monócitos purificados, comece cultivando cinco vezes 10 à quinta das células de interesse em um mililitro por poço, em cada poço de uma placa de 12 poços.Em seguida, adicione 10 microlitros de suspensão fresca de nanopartículas fluorescentes de dióxido de silício recém-preparada a cada poço experimental, adicionando também neste momento um volume igual de meio completo aos poços de controle não tratados. Após uma hora de internalização a 37 graus Celsius, transfira as amostras para tubos individuais de polipropileno de 1,5 mililitro e, em seguida, centrifugue as amostras por três minutos a 6.000 ×g e temperatura ambiente para coloração das células com CD14 via incubação azul: incube 100 microlitros de cada suspensão celular com 10 microlitros do anticorpo humano na proporção de 1 para 11 em tampão de corrida durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Após lavar o anticorpo não ligado com um mililitro de tampão de corrida, reconstitua as células em 200 microlitros de tampão de corrida fresco para análise por citometria de fluxo.Em seguida, para configurar a compensação do derramamento espectral, abra a caixa de configurações do instrumento no software de citometria de fluxo e, então, adquira uma amostra sem anticorpos e livre de nanopartículas em baixa velocidade fluidica. Ajustar as configurações de compensação na presença de nanopartículas fluorescentes é a parte mais difícil do procedimento, pois as nanopartículas podem interferir no espalhamento lateral; para garantir sucesso, uma porta da população celular de interesse deve ser definida. Ajuste manualmente os espalhamentos direto e lateral regulando os canais de voltagem. Em seguida, desenhe uma porta adequadamente grande ao redor da população celular desejada.Carregue outra amostra não rotulada e abra a guia de compensação na caixa de configurações do instrumento. Ajuste o fator de compensação durante a aquisição até que a intensidade de fluorescência no canal de vazamento seja aproximadamente a mesma para as populações positivas e negativas para o fluorocromo. Por fim, após ajustar a compensação para cada tubo controle individualmente corado com fluorocromo, leia as amostras tratadas com nanopartículas com o objetivo de caracterizar melhor o comportamento dos glóbulos brancos em resposta às nanopartículas; ensaios de internalização foram realizados conforme acabou de ser demonstrado.Por exemplo, neste experimento representativo, três subpopulações principais de leucócitos sanguíneos foram claramente identificadas por dispersão direta e lateral após o isolamento de PBMC. Além disso, após o tratamento com dióxido de silício fz, linfócitos, monócitos e granulócitos exibiram diferentes taxas de internalização de nanopartículas, conforme indicado por sua intensidade de fluorescência. Nessas imagens, a internalização de nanopartículas é demonstrada em monócitos primários positivos para CD14 purificados de pbmc.Esses gráficos de dispersão exibem monócitos positivos para CD14 na presença de nanopartículas de dióxido de silício de fitz. O histograma ilustra a quantificação das células positivas para fitzy expressas como intensidade de fluorescência. Experimentos semelhantes de internalização foram realizados com monócitos TP1 tratados com concentrações crescentes de nanopartículas de dióxido de silício de fitz, utilizando células não tratadas como controle negativo.Os gráficos de dispersão ilustram o aumento dependente da dose no espalhamento lateral com um espalhamento frontal inalterado na linhagem celular TP após a internalização de nanopartículas. Os dados desses gráficos sugerem que o tratamento com nanopartículas de dióxido de silício de Fitz induz uma internalização dependente da dose em monócitos, destacada pelo aumento da granularidade intracelular. Para obter mais informações sobre as interações entre células imunes e nanopartículas, microglia foram cultivadas por sete dias in vitro e incubadas com nanopartículas por uma hora. A microscopia de fluorescência indicou um cultivo primário misto de células gliais com um grande número de astrócitos não aderentes GFP negativos e algumas células GFP positivas.Neste experimento representativo, três subpopulações gliais puderam ser distinguidas por citometria de fluxo com uma única coloração por anticorpo CD11B: astrócitos CD11B negativos GFP negativos e outras células gliais, células microgliais CD11B positivas GFP negativas e uma subpopulação CD11B positiva GFP positiva. As duas últimas subpopulações são capazes de internalizar nanopartículas, com uma leve deficiência aumentada pela população GFP positiva. A internalização de nanopartículas pode ser ainda verificada por microscopia confocal, conforme demonstrado nesta imagem utilizando nanopartículas de dióxido de silício com domínio em forma de bastão.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manter as amostras no escuro para evitar o desbotamento dos corantes fluorescentes e manter as amostras a quatro graus durante a incubação com o anticorpo. Após este procedimento, outros métodos, como microscopia confocal, podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre a localização intracelular das nanopartículas.

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