Detecção de nanopartículas fluorescentes Interações com Primário imunitário subpopulações de células por citometria de fluxo
28 de março de 2014
Análise da interação de nanopartículas com subpopulações definidas de células do sistema imunológico, por citometria de fluxo.
O objetivo geral deste procedimento é detectar interações de nanopartículas fluorescentes com subpopulações primárias de células imunes por citometria de fluxo. Isso é feito tratando primeiro as células de interesse com as nanopartículas. Na próxima etapa, as células são marcadas com anticorpos contra marcadores de superfície específicos da célula e, em seguida, analisadas por citometria de fluxo.
Em última análise, a interação das nanopartículas com populações individuais de células imunes pode ser medida. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a microscopia, é que, com essa técnica, as variações nas intensidades de fluorescência induzidas por nanopartículas podem ser quantificadas em populações de células não aderentes Para a internalização de nanopartículas em leucócitos sanguíneos ou monócitos purificados, comece por plaquear cinco vezes 10 elevado a quinto das células de interesse em um mililitro por poço. Em cada poço de uma placa de 12 poços.
Em seguida, adicione 10 microlitros de suspensão de nanopartículas de dióxido de silício fluorescente recém-preparada a cada poço experimental, adicionando um volume igual de meio completo aos poços de controle não tratados neste momento também. Após uma internalização de uma hora a 37 graus Celsius, transfira as amostras para tubos individuais de polipropileno de 1,5 mililitro e, em seguida, gire as amostras por três minutos a 6.000 vezes G e temperatura ambiente para corar as células com CD 14 via azul incubar 100 microlitros de cada suspensão celular em 10 microlitros do anticorpo humano na proporção de um para 11 em tampão de execução por 10 minutos a quatro graus Celsius. Depois de lavar o anticorpo não ligado em um mililitro de tampão de corrida, ressuspenda as células em 200 microlitros de tampão de corrida fresco para análise de citometria de fluxo.
Em seguida, para configurar a compensação de transbordamento espectral, abra a caixa de configurações do instrumento no software de citometria de fluxo e, em seguida, adquira uma amostra grátis de nanopartículas não rotulada com anticorpo em baixa velocidade fluídica. Ajustar as configurações de compensação na presença de nanopartículas fluorescentes é a parte mais complicada do procedimento, pois as nanopartículas podem interferir no espalhamento lateral para garantir o sucesso, uma porta da população de células de interesse deve ser definida Ajuste manualmente o espalhamento direto e lateral regulando os canais de tensão. Em seguida, desenhe um portão apropriadamente grande ao redor da população de células desejada.
Carregue outra amostra não rotulada e abra a guia de compensação na caixa de configurações do instrumento. Ajustar o fator de compensação durante a aquisição até que a intensidade de fluorescência no canal de transbordamento seja aproximadamente a mesma para as populações de fluorocromo positivo e negativo. Finalmente, depois de ajustar a compensação para cada tubo de controle de fluorocromo corado, leia as amostras tratadas com nanopartículas em um esforço para caracterizar melhor o comportamento dos glóbulos brancos em resposta às nanopartículas, os ensaios de internalização foram realizados como acabamos de demonstrar.
Por exemplo, neste experimento representativo, três subpopulações principais de leucócitos sanguíneos foram claramente identificadas por espalhamento frontal e lateral após o isolamento de PBMC. Além disso, após o tratamento com dióxido de silício fz, linfócitos, monócitos e granulócitos exibiram diferentes taxas de internalização de nanopartículas, conforme indicado por sua intensidade de fluorescência. Nessas imagens, a internalização de nanopartículas é demonstrada em monócitos primários positivos para CD 14 purificados de pbmc.
Esses gráficos de dispersão exibem monócitos CD 14 positivos na presença de nanopartículas de dióxido de silício de Fitz. O histograma ilustra a quantificação das células positivas fitzy expressas como intensidade de fluorescência. Experimentos de internalização semelhantes foram realizados com monócitos TP one tratados com concentrações crescentes de nanopartículas de dióxido de silício de Fitz com células não tratadas como controle negativo.
Os gráficos de pontos ilustram o aumento dependente da dose no espalhamento lateral com um espalhamento direto inalterado na linha celular TP uma após a internalização das nanopartículas. Os dados desses gráficos sugerem que o tratamento com nanopartículas de dióxido de silício de Fitz induz uma internalização dependente da dose em monócitos destacada pelo aumento da granularidade intracelular para obter mais informações sobre as interações entre células imunes e nanopartículas, microglia foram cultivadas por sete dias in vitro e incubadas com nanopartículas por uma hora. A microscopia de fluorescência indicou uma cultura mista de células gliais primárias com um grande número de astrócitos não aderentes negativos para GFP e algumas células positivas para GFP.
Neste experimento representativo, três subpopulações gliais puderam ser distinguidas por citometria de fluxo com um único anticorpo CD 11 B corando CD 11 B, astrócitos negativos GFP negativos e outras células gliais microgliais CD 11 B células GFP positivas e uma subpopulação CD 11 B GFP positiva positiva. As duas últimas subpopulações são capazes de internalizar nanopartículas com uma deficiência ligeiramente aumentada pela população positiva para GFP. A internalização de nanopartículas pode ser verificada por microscopia confocal, conforme demonstrado nesta imagem, usando nanopartículas de dióxido de silício de domina de bastonete.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter as amostras no escuro para evitar o branqueamento dos corantes fluorescentes e manter as amostras a quatro graus durante a incubação de anticorpos. Após este procedimento, outros métodos como a microscopia confocal podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a localização intracelular das nanopartículas.
Visão Geral
Este estudo concentra-se na interação de nanopartículas fluorescentes com subpopulações de células imunológicas primárias usando citometria de fluxo. O método permite a quantificação da internalização de nanopartículas em várias células imunes, fornecendo insights sobre seu comportamento.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imunologia
- Nanotecnologia
- Citometria de Fluxo
Fundamento
- Nanopartículas podem ser usadas para estudar interações de células imunológicas.
- A citometria de fluxo oferece vantagens sobre a microscopia para quantificar a fluorescência.
- Entender a internalização de nanopartículas pode informar estratégias terapêuticas.
- Diferentes tipos de células imunológicas podem exibir respostas variadas às nanopartículas.
Objetivo do Estudo
- Analisar a interação de nanopartículas com subpopulações de células imunes.
- Quantificar as taxas de internalização de nanopartículas em diferentes tipos de células.
- Melhorar a compreensão das respostas imunes ao tratamento com nanopartículas.
Métodos Utilizados
- Células imunes primárias foram tratadas com nanopartículas fluorescentes de dióxido de silício.
- As células foram marcadas com anticorpos específicos para análise citometria de fluxo.
- As configurações de compensação foram ajustadas para compensar a interferência das nanopartículas.
- Ensaios de internalização foram realizados para avaliar a captação de nanopartículas.
Principais Resultados
- Diferentes populações de células imunes mostraram taxas variadas de internalização de nanopartículas.
- A citometria de fluxo efetivamente distinguiu entre tipos de células com base na intensidade da fluorescência.
- A internalização foi confirmada através de técnicas adicionais de microscopia.
- Os resultados indicaram uma relação dependente da dose na captação de nanopartículas por monócitos.
Conclusões
- O estudo demonstra a utilidade da citometria de fluxo na análise das interações de nanopartículas com células imunes.
- Os resultados contribuem para a compreensão de como as nanopartículas podem influenciar as respostas imunes.
- Pesquisas adicionais podem explorar aplicações terapêuticas de nanopartículas na imunologia.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This method enables quantitative assessment of nanoparticle internalization in primary immune cell subpopulations, supporting target validation and mechanistic de-risking in nanotherapeutic development. By providing dose-dependent and cell-type-specific uptake data, it enhances predictive confidence in early discovery and informs go/no-go decisions for nanoparticle-based interventions. The approach addresses a key discovery-stage challenge: translating nanoparticle-cell interactions into actionable, reproducible metrics for portfolio prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying nanoparticle uptake across immune subsets, clarifying which cell populations engage with nanocarriers.
- Operational Value: Enables biological de-risking through standardized, reproducible measurement of internalization via fluorescence intensity and side-scattered light shifts.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying cell types with high or low nanoparticle affinity, guiding target selection for immunomodulatory nanotherapies.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated immune cell systems for downstream screening by establishing baseline nanoparticle interaction profiles.
- Quantitative Outputs: Generates fluorescence intensity and SSC metrics that enable standardized, comparable readouts across conditions and time points.
- Platform Reuse: Supports scalable screening workflows through consistent gating, compensation, and antibody labeling protocols applicable to diverse nanoparticle formulations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Extends to primary microglia from mutant mice, enabling CNS-targeted nanoparticle studies in disease-relevant immune models.
- Translational Continuity: Connects flow cytometry findings to confocal microscopy confirmation, strengthening mechanistic interpretation for preclinical validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs advancement decisions by revealing differential internalization rates, such as GFP-positive microglial subpopulations showing altered nanoparticle uptake.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target engagement screening to preclinical mechanistic evaluation, particularly for immunomodulatory nanotherapies where immune cell interaction profiles are critical.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking nanoparticle exposure to measurable changes in cell granularity and fluorescence, clarifying mechanisms of immune cell activation or modulation.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized isolation, labeling, and compensation steps that ensure reproducible quantification of nanoparticle-cell interactions.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (fluorescence intensity, SSC shifts) that enable comparison of internalization across cell types, concentrations, and time points.
- Translational Research: Connects to preclinical validation via orthogonal confirmation with confocal microscopy, aligning with biomarker-aligned mechanistic de-risking.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability across nanoparticle formats (e.g., FITC-SiO₂, Rhodamine-SiO₂) and immune models (human blood leukocytes, murine microglia), reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by delivering cell-resolved, quantitative data on nanoparticle internalization, improving target confidence in immunomodulatory strategies.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined compensation protocols and antibody panels, minimizing variability across users and sites.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying early which immune subsets are prone to nanoparticle engagement, reducing late-stage biological risk in nanotherapeutic development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by highlighting nanoparticle formulations with favorable or undesirable immune cell interaction profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry compensation, particularly to address nanoparticle-induced side-scattering interference during spectral overlap correction.
- Dependent on access to flow cytometers with fluorescence and scatter detection capabilities, along with antibody panels for immune cell subset identification.
- Necessitates cross-team standardization of gating strategies and compensation settings to ensure consistent data interpretation between discovery and preclinical groups.
- Requires adaptation when applied to different model systems (e.g., adherent vs. non-adherent cells, human vs. murine primary cells) to maintain assay fidelity.
- Practical limitation: Nanoparticle fluorescence or scatter properties may interfere with certain fluorochromes, requiring careful panel design and compensation validation as noted in the protocol.
