Detecção de nanopartículas fluorescentes Interações com Primário imunitário subpopulações de células por citometria de fluxo
28 de março de 2014
Análise da interação de nanopartículas com subpopulações definidas de células do sistema imunológico, por citometria de fluxo.
O objetivo geral deste procedimento é detectar interações de nanopartículas fluorescentes com subpopulações primárias de células imunes por citometria de fluxo. Isso é realizado primeiramente tratando as células de interesse com as nanopartículas. Na etapa seguinte, as células são marcadas com anticorpos contra marcadores superficiais específicos das células e então analisadas por citometria de fluxo.
Por fim, pode-se medir a interação das nanopartículas com populações individuais de células imunes. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a microscopia, é que com ela é possível quantificar variações nas intensidades de fluorescência induzidas por nanopartículas em populações de células não aderentes. Para internalização de nanopartículas em leucócitos sanguíneos ou monócitos purificados, comece cultivando cinco vezes 10 à quinta das células de interesse em um mililitro por poço, em cada poço de uma placa de 12 poços.
Em seguida, adicione 10 microlitros de suspensão fresca de nanopartículas fluorescentes de dióxido de silício recém-preparada a cada poço experimental, adicionando também neste momento um volume igual de meio completo aos poços de controle não tratados. Após uma hora de internalização a 37 graus Celsius, transfira as amostras para tubos individuais de polipropileno de 1,5 mililitro e, em seguida, centrifugue as amostras por três minutos a 6.000 ×g e temperatura ambiente para coloração das células com CD14 via incubação azul: incube 100 microlitros de cada suspensão celular com 10 microlitros do anticorpo humano na proporção de 1 para 11 em tampão de corrida durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Após lavar o anticorpo não ligado com um mililitro de tampão de corrida, reconstitua as células em 200 microlitros de tampão de corrida fresco para análise por citometria de fluxo.
Em seguida, para configurar a compensação do derramamento espectral, abra a caixa de configurações do instrumento no software de citometria de fluxo e, então, adquira uma amostra sem anticorpos e livre de nanopartículas em baixa velocidade fluidica. Ajustar as configurações de compensação na presença de nanopartículas fluorescentes é a parte mais difícil do procedimento, pois as nanopartículas podem interferir no espalhamento lateral; para garantir sucesso, uma porta da população celular de interesse deve ser definida. Ajuste manualmente os espalhamentos direto e lateral regulando os canais de voltagem. Em seguida, desenhe uma porta adequadamente grande ao redor da população celular desejada.
Carregue outra amostra não rotulada e abra a guia de compensação na caixa de configurações do instrumento. Ajuste o fator de compensação durante a aquisição até que a intensidade de fluorescência no canal de vazamento seja aproximadamente a mesma para as populações positivas e negativas para o fluorocromo. Por fim, após ajustar a compensação para cada tubo controle individualmente corado com fluorocromo, leia as amostras tratadas com nanopartículas com o objetivo de caracterizar melhor o comportamento dos glóbulos brancos em resposta às nanopartículas; ensaios de internalização foram realizados conforme acabou de ser demonstrado.
Por exemplo, neste experimento representativo, três subpopulações principais de leucócitos sanguíneos foram claramente identificadas por dispersão direta e lateral após o isolamento de PBMC. Além disso, após o tratamento com dióxido de silício fz, linfócitos, monócitos e granulócitos exibiram diferentes taxas de internalização de nanopartículas, conforme indicado por sua intensidade de fluorescência. Nessas imagens, a internalização de nanopartículas é demonstrada em monócitos primários positivos para CD14 purificados de pbmc.
Esses gráficos de dispersão exibem monócitos positivos para CD14 na presença de nanopartículas de dióxido de silício de fitz. O histograma ilustra a quantificação das células positivas para fitzy expressas como intensidade de fluorescência. Experimentos semelhantes de internalização foram realizados com monócitos TP1 tratados com concentrações crescentes de nanopartículas de dióxido de silício de fitz, utilizando células não tratadas como controle negativo.
Os gráficos de dispersão ilustram o aumento dependente da dose no espalhamento lateral com um espalhamento frontal inalterado na linhagem celular TP após a internalização de nanopartículas. Os dados desses gráficos sugerem que o tratamento com nanopartículas de dióxido de silício de Fitz induz uma internalização dependente da dose em monócitos, destacada pelo aumento da granularidade intracelular. Para obter mais informações sobre as interações entre células imunes e nanopartículas, microglia foram cultivadas por sete dias in vitro e incubadas com nanopartículas por uma hora. A microscopia de fluorescência indicou um cultivo primário misto de células gliais com um grande número de astrócitos não aderentes GFP negativos e algumas células GFP positivas.
Neste experimento representativo, três subpopulações gliais puderam ser distinguidas por citometria de fluxo com uma única coloração por anticorpo CD11B: astrócitos CD11B negativos GFP negativos e outras células gliais, células microgliais CD11B positivas GFP negativas e uma subpopulação CD11B positiva GFP positiva. As duas últimas subpopulações são capazes de internalizar nanopartículas, com uma leve deficiência aumentada pela população GFP positiva. A internalização de nanopartículas pode ser ainda verificada por microscopia confocal, conforme demonstrado nesta imagem utilizando nanopartículas de dióxido de silício com domínio em forma de bastão.
Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manter as amostras no escuro para evitar o desbotamento dos corantes fluorescentes e manter as amostras a quatro graus durante a incubação com o anticorpo. Após este procedimento, outros métodos, como microscopia confocal, podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre a localização intracelular das nanopartículas.
Visão Geral
Este estudo foca-se na interação de nanopartículas fluorescentes com subpopulações primárias de células imunes utilizando citometria de fluxo. O método permite a quantificação da internalização de nanopartículas em diversas células imunes, fornecendo informações sobre seu comportamento.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imunologia
- Nanotecnologia
- Citometria de Fluxo
Contexto
- As nanopartículas podem ser usadas para estudar as interações entre células imunes.
- A citometria de fluxo oferece vantagens em relação à microscopia para quantificar a fluorescência.
- Compreender a internalização de nanopartículas pode orientar estratégias terapêuticas.
- Diferentes tipos de células imunes podem apresentar respostas variadas às nanopartículas.
Objetivo do Estudo
- Analisar a interação de nanopartículas com subpopulações de células imunes.
- Quantificar as taxas de internalização de nanopartículas em diferentes tipos celulares.
- Aprimorar a compreensão das respostas imunes ao tratamento com nanopartículas.
Métodos Utilizados
- Células imunes primárias foram tratadas com nanopartículas fluorescentes de dióxido de silício.
- As células foram marcadas com anticorpos específicos para análise por citometria de fluxo.
- Os ajustes de compensação foram realizados para levar em conta a interferência das nanopartículas.
- Ensaios de internalização foram realizados para avaliar a captação de nanopartículas.
Resultados Principais
- Diferentes populações de células imunes apresentaram taxas variáveis de internalização de nanopartículas.
- A citometria de fluxo distinguiu eficazmente entre tipos celulares com base na intensidade de fluorescência.
- A internalização foi confirmada por meio de técnicas adicionais de microscopia.
- Os resultados indicaram uma relação dose-dependente na captação de nanopartículas por monócitos.
Conclusões
- O estudo demonstra a utilidade da citometria de fluxo na análise das interações de nanopartículas com células imunes.
- Os resultados contribuem para o entendimento de como as nanopartículas podem influenciar respostas imunes.
- Pesquisas futuras podem explorar aplicações terapêuticas de nanopartículas na imunologia.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite a avaliação quantitativa da internalização de nanopartículas em subpopulações de células imunes primárias, apoiando a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas no desenvolvimento de nanoterapêuticos. Ao fornecer dados de captação dependentes da dose e específicos ao tipo celular, aumenta a confiança preditiva no estágio inicial de descoberta e orienta decisões de prosseguir ou não com intervenções baseadas em nanopartículas. A abordagem enfrenta um desafio-chave na fase de descoberta: traduzir as interações entre nanopartículas e células em métricas acionáveis e reprodutíveis para a priorização de portfólios.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas mediante a quantificação da captação de nanopartículas em subpopulações imunes, esclarecendo quais populações celulares interagem com nanocarreadores.
- Valor Operacional: Permite a redução de riscos biológicos por meio de medições padronizadas e reprodutíveis da internalização, com base na intensidade de fluorescência e nas alterações da luz dispersa lateralmente.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao identificar tipos celulares com alta ou baixa afinidade por nanopartículas, orientando a seleção de alvos para nanoterapias imunomoduladoras.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Prepara sistemas de células imunes validados para triagem subsequente, estabelecendo perfis de interação de nanopartículas na linha de base.
- Resultados Quantitativos: Gera métricas de intensidade de fluorescência e SSC que permitem leituras padronizadas e comparáveis entre diferentes condições e pontos temporais.
- Reutilização da Plataforma: Permite fluxos de trabalho escalonáveis de triagem por meio de protocolos consistentes de delimitação de populações celulares, compensação e marcação com anticorpos, aplicáveis a diversas formulações de nanopartículas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Amplia-se para micróglias primárias de camundongos mutantes, permitindo estudos com nanopartículas direcionadas ao SNC em modelos imunológicos relevantes para doenças.
- Continuidade Tradutiva: Conecta os achados de citometria de fluxo à confirmação por microscopia confocal, fortalecendo a interpretação mecanicista para validação pré-clínica.
- Avanço Ajustado ao Risco: Orienta decisões de avanço ao revelar taxas diferenciais de internalização, como subpopulações de micróglias GFP-positivas apresentando captação alterada de nanopartículas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a triagem inicial de ligação ao alvo até a avaliação mecanicista pré-clínica, especialmente para nano-terapias imunomoduladoras nas quais os perfis de interação com células imunes são fundamentais.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao associar a exposição a nanopartículas a alterações mensuráveis na granularidade celular e na fluorescência, elucidando os mecanismos de ativação ou modulação de células imunes.
- Triagem: Garante prontidão para ensaios por meio de etapas padronizadas de isolamento, marcação e compensação, assegurando a quantificação reprodutível das interações entre nanopartículas e células.
- Análises: Fornece medidas quantitativas de variáveis dependentes (intensidade de fluorescência, desvios no espalhamento lateral da luz) que permitem comparar a internalização entre tipos celulares, concentrações e pontos temporais.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à validação pré-clínica mediante confirmação ortogonal com microscopia confocal, alinhando-se à desmistificação mecanicista orientada por biomarcadores.
- Reutilização Corporativa: Funciona como uma capacidade reutilizável em diferentes formatos de nanopartículas (por exemplo, FITC-SiO₂, Rhodamine-SiO₂) e modelos imunes (leucócitos de sangue humano, micróglias murinas), reduzindo o desenvolvimento metodológico redundante.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao fornecer dados quantitativos com resolução em nível celular sobre a internalização de nanopartículas, aumentando a confiança no alvo em estratégias imunomoduladoras.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade por meio de protocolos definidos de compensação e painéis de anticorpos, minimizando a variabilidade entre usuários e locais.
- Valor Estratégico: Aprimora decisões de avanço ou interrupção do desenvolvimento ao identificar precocemente quais subconjuntos imunes são propensos ao engajamento com nanopartículas, reduzindo riscos biológicos em estágios avançados do desenvolvimento de nanoterapias.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco ao destacar formulações de nanopartículas com perfis favoráveis ou indesejáveis de interação com células imunes.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em compensação de citometria de fluxo, especialmente para lidar com interferência na dispersão lateral induzida por nanopartículas durante a correção de sobreposição espectral.
- Depende do acesso a citômetros de fluxo com capacidades de detecção de fluorescência e dispersão, além de painéis de anticorpos para identificação de subpopulações de células imunes.
- Necessita padronização entre equipes das estratégias de seleção (gating) e configurações de compensação para garantir interpretação consistente dos dados entre grupos de descoberta e pré-clínicos.
- Requer adaptação ao ser aplicado a diferentes sistemas modelo (por exemplo, células aderentes versus não aderentes, células primárias humanas versus murinas) para manter a fidelidade do ensaio.
- Limitação prática: propriedades de fluorescência ou dispersão das nanopartículas podem interferir com certos fluorocromos, exigindo um cuidadoso planejamento do painel e validação da compensação, conforme observado no protocolo.
