Detecção de nanopartículas fluorescentes Interações com Primário imunitário subpopulações de células por citometria de fluxo

Análise da interação de nanopartículas com subpopulações definidas de células do sistema imunológico, por citometria de fluxo.

O objetivo geral deste procedimento é detectar interações de nanopartículas fluorescentes com subpopulações primárias de células imunes por citometria de fluxo. Isso é feito tratando primeiro as células de interesse com as nanopartículas. Na próxima etapa, as células são marcadas com anticorpos contra marcadores de superfície específicos da célula e, em seguida, analisadas por citometria de fluxo.

Em última análise, a interação das nanopartículas com populações individuais de células imunes pode ser medida. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a microscopia, é que, com essa técnica, as variações nas intensidades de fluorescência induzidas por nanopartículas podem ser quantificadas em populações de células não aderentes Para a internalização de nanopartículas em leucócitos sanguíneos ou monócitos purificados, comece por plaquear cinco vezes 10 elevado a quinto das células de interesse em um mililitro por poço. Em cada poço de uma placa de 12 poços.

Em seguida, adicione 10 microlitros de suspensão de nanopartículas de dióxido de silício fluorescente recém-preparada a cada poço experimental, adicionando um volume igual de meio completo aos poços de controle não tratados neste momento também. Após uma internalização de uma hora a 37 graus Celsius, transfira as amostras para tubos individuais de polipropileno de 1,5 mililitro e, em seguida, gire as amostras por três minutos a 6.000 vezes G e temperatura ambiente para corar as células com CD 14 via azul incubar 100 microlitros de cada suspensão celular em 10 microlitros do anticorpo humano na proporção de um para 11 em tampão de execução por 10 minutos a quatro graus Celsius. Depois de lavar o anticorpo não ligado em um mililitro de tampão de corrida, ressuspenda as células em 200 microlitros de tampão de corrida fresco para análise de citometria de fluxo.

Em seguida, para configurar a compensação de transbordamento espectral, abra a caixa de configurações do instrumento no software de citometria de fluxo e, em seguida, adquira uma amostra grátis de nanopartículas não rotulada com anticorpo em baixa velocidade fluídica. Ajustar as configurações de compensação na presença de nanopartículas fluorescentes é a parte mais complicada do procedimento, pois as nanopartículas podem interferir no espalhamento lateral para garantir o sucesso, uma porta da população de células de interesse deve ser definida Ajuste manualmente o espalhamento direto e lateral regulando os canais de tensão. Em seguida, desenhe um portão apropriadamente grande ao redor da população de células desejada.

Carregue outra amostra não rotulada e abra a guia de compensação na caixa de configurações do instrumento. Ajustar o fator de compensação durante a aquisição até que a intensidade de fluorescência no canal de transbordamento seja aproximadamente a mesma para as populações de fluorocromo positivo e negativo. Finalmente, depois de ajustar a compensação para cada tubo de controle de fluorocromo corado, leia as amostras tratadas com nanopartículas em um esforço para caracterizar melhor o comportamento dos glóbulos brancos em resposta às nanopartículas, os ensaios de internalização foram realizados como acabamos de demonstrar.

Por exemplo, neste experimento representativo, três subpopulações principais de leucócitos sanguíneos foram claramente identificadas por espalhamento frontal e lateral após o isolamento de PBMC. Além disso, após o tratamento com dióxido de silício fz, linfócitos, monócitos e granulócitos exibiram diferentes taxas de internalização de nanopartículas, conforme indicado por sua intensidade de fluorescência. Nessas imagens, a internalização de nanopartículas é demonstrada em monócitos primários positivos para CD 14 purificados de pbmc.

Esses gráficos de dispersão exibem monócitos CD 14 positivos na presença de nanopartículas de dióxido de silício de Fitz. O histograma ilustra a quantificação das células positivas fitzy expressas como intensidade de fluorescência. Experimentos de internalização semelhantes foram realizados com monócitos TP one tratados com concentrações crescentes de nanopartículas de dióxido de silício de Fitz com células não tratadas como controle negativo.

Os gráficos de pontos ilustram o aumento dependente da dose no espalhamento lateral com um espalhamento direto inalterado na linha celular TP uma após a internalização das nanopartículas. Os dados desses gráficos sugerem que o tratamento com nanopartículas de dióxido de silício de Fitz induz uma internalização dependente da dose em monócitos destacada pelo aumento da granularidade intracelular para obter mais informações sobre as interações entre células imunes e nanopartículas, microglia foram cultivadas por sete dias in vitro e incubadas com nanopartículas por uma hora. A microscopia de fluorescência indicou uma cultura mista de células gliais primárias com um grande número de astrócitos não aderentes negativos para GFP e algumas células positivas para GFP.

Neste experimento representativo, três subpopulações gliais puderam ser distinguidas por citometria de fluxo com um único anticorpo CD 11 B corando CD 11 B, astrócitos negativos GFP negativos e outras células gliais microgliais CD 11 B células GFP positivas e uma subpopulação CD 11 B GFP positiva positiva. As duas últimas subpopulações são capazes de internalizar nanopartículas com uma deficiência ligeiramente aumentada pela população positiva para GFP. A internalização de nanopartículas pode ser verificada por microscopia confocal, conforme demonstrado nesta imagem, usando nanopartículas de dióxido de silício de domina de bastonete.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter as amostras no escuro para evitar o branqueamento dos corantes fluorescentes e manter as amostras a quatro graus durante a incubação de anticorpos. Após este procedimento, outros métodos como a microscopia confocal podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a localização intracelular das nanopartículas.