Um método inovador para exossomo Quantificação e Size Measurement

O objetivo deste procedimento é analisar os exossomos por seu tamanho e quantificá-los usando uma análise de rastreamento de nanopartículas ou instrumento NTA por meio de um método semi-automatizado. Isso é feito usando etapas de centrificação diferencial para obter um pellet de exossomo do sangue humano. Os exossomos são ressuspensos a uma concentração predeterminada para a quantidade de plasma inicial para obter a intensidade de dispersão apropriada.

Durante o NTA, a suspensão é então filtrada para separar os exossomos das partículas maiores. Em seguida, uma calibração do instrumento NTA é realizada usando uma suspensão de controle contendo partículas de poliestireno de 200 nanômetros. A solução de exossomo é então injetada no instrumento NTA e a configuração ideal do NTA é selecionada realizando um pré-teste antes de realizar o teste final.

Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a quantificação de todas as partículas medidas e a listagem das partículas por seus tamanhos. A demonstração deste método é crítica, pois a solução e a configuração para cada solução de exossomo preparada devem ser realizadas individualmente para obter os melhores resultados. Os exossomos medidos devem estar em uma concentração I para que o modo de visualização ao vivo exiba cerca de 600 partículas por tela.

Além disso, um pré-teste deve ser realizado para encontrar a faixa de sensibilidade ideal para a medição. Uma alta configuração de sensibilidade leva à visualização de partículas mais pequenas, também aumentaria os ruídos de fundo relacionados a problemas. O procedimento será demonstrado por Anto May, um estudante de pós-graduação do nosso laboratório Para iniciar a preparação do exossomo, colete sangue total em três tubos de citrato por punção venosa para um total de nove mililitros.

Em seguida, despeje o sangue em um tubo Falcon de 15 mililitros e centrifugue a amostra a 1.500 G por 20 minutos a quatro graus Celsius para iniciar a separação das células do plasma. Transfira o S nascente para um novo tubo Falcon de 15 mililitros. Em seguida, centrifugue novamente a amostra a 2.800 G por 20 minutos a quatro graus Celsius para remover todas as células do plasma.

Transfira o plasma livre de células ou CFP para tubos de ultracentrifugação a um mililitro por tubo. Em seguida, centrifugar o CFP a 100 000 G durante 90 minutos a quatro graus Celsius para esgotar os exossomas. Remova 900 microlitros de sobrenadante e ressuspenda o pellet nos 100 microlitros restantes no tubo de ultracentrifugação.

Depois de adicionar 900 microlitros de centrífuga PBS, você ganha a 100.000 G por 30 minutos a quatro graus Celsius. Como antes, remova 900 microlitros do agente supino e ressuspenda os pellets com os 100 microlitros restantes. Transfira cinco a 20 microlitros da suspensão Resus para 40 mililitros de água destilada.

Filtre a suspensão através de um filtro de 450 nanômetros para separar os exossomos das partículas maiores. Use esta suspensão final para medição de partículas para usar o instrumento de rastreamento de partículas. Primeiro, inicie o programa clicando duas vezes no ícone do software.

Clique nas várias guias de software para alternar entre elas em todo o protocolo. Siga as instruções na tela. Para uma implementação automatizada do procedimento de inicialização, marque as caixas para verificação de qualidade da célula e alinhamento automático.

Qualquer uma dessas etapas pode ser repetida separadamente, se necessário, pressionando o botão A ou B na guia de verificação de células. Coloque um béquer sob a porta de observação para coletar resíduos de solução e não injete bolhas de ar no sistema. Abra a porta de entrada e perspectiva da análise de rastreamento de nanopartículas ou instrumento NTA e injete 10 mililitros de água destilada por seringa no canal celular através da porta de entrada.

Feche a porta de entrada e saída imediatamente quando a última quantidade de água estiver sendo injetada. Certifique-se de que a célula de medição esteja livre de bolhas de ar. Execute a verificação da qualidade da célula clicando em. Okey.

O software exibirá o resultado da qualidade da célula após alguns segundos, se alguma partícula ainda for visualizada na tela de visualização ao vivo do software, ou se o resultado da verificação de qualidade for apenas bom ou ruim, repita a injeção de água distal até que as partículas restantes sejam removidas da célula de medição L. Além disso, Repita esta etapa após cada medição para evitar o acúmulo de partículas. Em seguida, prepare uma suspensão de controle contendo partículas de poliestireno uniformes de 200 nanômetros. Para alinhar os focos do laser e do microscópio, adicione uma gota do concentrado de suspensão fornecido pelo fabricante do instrumento a 500 mililitros de água destilada, resultando na concentração necessária, de modo que 600 mais ou menos 100 partículas sejam exibidas por tela na visualização ao vivo.

Injete a suspensão de alinhamento no instrumento NTA como feito para a prensa de água destilada. Tudo bem para começar também o alinhamento, que é uma rotina automatizada através da qual o sistema encontrará automaticamente a posição ideal dos dois focos. Quando aparecer um prompt informando que o sistema está pronto para experimentos, clique em ok para iniciar a medição.

Ocasionalmente, limpe o canal celular manualmente entre os experimentos, lavando a célula com uma solução de etanol a 30%. Limpe o canal sempre que o software exibir um relatório de erro automático. Para realizar a medição do sistema.

Primeiro, lave o canal com água destilada antes de cada sample medição. Em seguida, injete a suspensão do exossomo no canal. O próximo passo é ajustar os principais parâmetros no software para ajustar a sensibilidade.

Encontre a faixa de sensibilidade ideal clicando em número de partículas versus sensibilidade para exibir uma curva de partículas medidas por tela para diferentes níveis de sensibilidade. Escolha um nível de sensibilidade antes da inclinação máxima da curva. Um nível de sensibilidade mais alto permite a visualização de partículas mais pequenas, mas também aumenta os problemas relacionados ao ruído de fundo.

Para ajustar o brilho mínimo, escolha um brilho inicial de 20 para medição de exossomos. Para usar esta função como um filtro, regule este parâmetro até apagar as partículas de dispersão de luz forte. Regule-o para amplificar os artefatos de dispersão semanais, muito brilho conforme necessário durante todo o experimento.

Em seguida, defina um filtro digital para eliminar o ruído de pixel e partículas superdimensionadas de dispersão indesejadas. Ao regular o tamanho mínimo e máximo, use um intervalo de 10 a 500 pixels para medição de exossomos. Ajuste o obturador alterando o período de tempo em que a câmera está aberta definindo o obturador para 300, que é igual a 3,3 milissegundos.

Para ajustar os parâmetros de leitura ao vivo, alterne entre um modo de visualização digital e analógica a qualquer momento clicando no botão de imagem ao vivo. Ao longo do experimento. Monitore a barra de intensidade de dispersão, que exibe o status de saturação da amostra como um indicador codificado por cores.

Não analise exossomos se a barra de dispersão estiver vermelha. Para iniciar a medição, clique na guia de medição. Escolha as configurações na matriz de opções de execução.

Antes de cada aquisição, selecione o movimento de verificação, um teste de desvio de partículas de verificação repetido, selecione o número de experimentos e o atraso de tempo entre eles. Execute uma verificação de amostra, se necessário. Por fim, clique no botão executar aquisição de vídeo.

Na nova janela, defina o número de ciclos e o número de posições de medição. Confirme a duração mínima do tempo. Uma partícula é rastreada para ser contada como uma partícula individual.

Ao definir a resolução do vídeo, uma resolução mais baixa resulta em uma duração de rastreamento mais curta. Por fim, selecione um nome de arquivo e clique em OK para iniciar a medição. A curva de número de partículas versus sensibilidade exibe as partículas em uma posição em um momento.

Durante uma varredura automática de sensibilidade, um valor de sensibilidade é escolhido antes da inclinação máxima do gráfico. Os artefatos não são eliminados neste experimento de teste e podem afetar o gráfico. A visualização de partículas na tela de visualização ao vivo é útil para definir o valor de sensibilidade correto.

Um valor muito baixo leva à detecção de poucas partículas. Enquanto um valor muito alto mostra uma imagem ruim, as partículas de qualidade aparecem com pontos únicos bem isolados uns dos outros no nível de sensibilidade ideal. A guia de resultados após a medição permite a leitura de parâmetros, incluindo o número total de partículas rastreadas, o número médio de partículas por posição e a concentração de partículas, bem como a proporção numérica do tamanho da partícula para a porcentagem do número de partículas.

O gráfico calculado após a medição mostra a distribuição das partículas por tamanho. Os ícones no modo de exibição podem ser usados para alterar as configurações do gráfico. Além disso, existem diferentes maneiras de analisar os exossomos.

Este método mostra um método muito simples e elegante para realizar uma análise de método semelhante em um processo rápido para gerar resultados em um curto espaço de tempo. Para comparar várias amostras, recomendamos manter o mesmo nível de diluição para todas as amostras. Todas as configurações aceitam a sensibilidade e a resolução do vídeo pode ser alterada posteriormente usando o conjunto de alguns softwares de análise.

Dessa forma, a análise comparativa dos dados obtidos em diferentes experimentos sobre quantidade e tamanho de exossomos torna-se disponível de forma semi-automatizada.