Microscopia de Força Atômica Estática para Visualizar e Caracterizar Nucleossomos Montados

Os nucleossomos, a unidade básica de repetição da cromatina eucariótica, compreendem as voltas do DNA enroladas em torno de um núcleo de proteínas histonas.

Para visualizar nucleossomos montados por microscopia de força atômica estática, AFM, comece com uma tira fina de mica, funcionalizada para renderizar a superfície carregada positivamente. Corte a tira em pequenos quadrados. Pipetar uma suspensão de nucleossomas montada.

O DNA carregado negativamente no nucleossomo se liga ao grupo carregado positivamente da tira de mica funcionalizada por meio de interações eletrostáticas. Lave com tampão para evitar a superlotação de nucleossomos.

Prenda a tira de mica em um disco de suporte de amostra. Monte-o no estágio do instrumento AFM.

Prenda o suporte da sonda à cabeça óptica do instrumento. O suporte contém um cantilever AFM pré-montado com uma ponta em seu ápice.

Alinhe o feixe de laser na parte traseira do cantilever para uma medição precisa da deflexão. Posicione a ponta em contato direto com a superfície contendo o nucleossomo.

Durante a imagem em modo de contato, à medida que a ponta do cantilever varre a superfície do nucleossomo, as forças repulsivas surgem após as interações entre os átomos da ponta e da amostra. Isso faz com que o cantilever dobre. O feixe de laser é refletido de forma diferente e direcionado para o fotodetector sensível à posição.

O loop de feedback mantém a deflexão constante do cantilever pelo movimento vertical do scanner durante a varredura. Este sinal de feedback é usado para gerar imagens topográficas de nucleossomos. O núcleo do nucleossomo aparece como bolhas brilhantes, com braços finos representando o DNA flanqueador.

Prepare a superfície da mica para a imagem latente estática do AFM. Para fazer isso, primeiro prepare uma solução estoque APS de 50 milimolares em água deionizada. Armazene alíquotas de 1 mililitro da solução a 4 graus Celsius, até que seja necessário.

A partir da solução de estoque, prepare uma solução APS funcional para modificação de mica, dissolvendo 50 microlitros do estoque APS de 50 milimolares em 15 mililitros de água destilada deionizada. Misture a solução e, em seguida, encha uma cubeta com a solução.

Em seguida, corte tiras de mica de 1 por 3 centímetros de folhas de mica de alta qualidade. Verifique se a peça se encaixa quando colocada diagonalmente em uma cubeta. Em seguida, corte as camadas da mica até que ambos os lados estejam recém-clivados e a peça fique tão fina quanto 0,1 milímetro.

Coloque imediatamente o pedaço de mica na cubeta cheia de APS e incube a mica por 30 minutos. Transfira o pedaço de mica para uma cubeta cheia de água destilada deionizada e deixe de molho por 30 segundos. Em seguida, use argônio para secar completamente ambos os lados da tira de APS-mica.

Aplique fita adesiva dupla face em vários discos magnéticos e coloque-os ao lado. Em seguida, corte o substrato APS-mica em quadrados de 1 centímetro por 1 centímetro e cubra-os em uma placa de Petri limpa. Em seguida, prepare três diluições dos nucleossomos montados usando um tampão filtrado de 0,22 mícron contendo HEPES de 10 milimolares e cloreto de magnésio de 4 milimolares a um pH de 7,5.

Para limitar a perda de nucleossomos na baixa concentração final, a diluição deve ser feita uma de cada vez, imediatamente antes da deposição na APS-mica.

Deposite de 5 a 10 microlitros de cada amostra de nucleossomo no centro de um pedaço de APS-mica e deixe-os incubar por 2 minutos. Em seguida, enxágue suavemente a amostra com 2 a 3 mililitros de água destilada deionizada para remover os componentes do tampão e seque a amostra depositada sob um leve fluxo de argônio.

Para começar, monte uma ponta no suporte da ponta da configuração do AFM. Em seguida, monte a primeira amostra no estágio AFM, tomando cuidado para não entrar em contato com a superfície da amostra. Posicione o laser sobre o cantilever até que sua soma esteja no máximo e ajuste os valores de deflexão vertical e lateral para perto de 0. Em seguida, ajuste a sonda AFM para encontrar sua frequência de ressonância. Ajuste a amplitude da unidade e defina o tamanho da imagem para 100 por 100 nanômetros. Uma vez configurado, clique no botão Envolver para iniciar a abordagem.

Quando a abordagem estiver completa, otimize gradualmente o ponto de ajuste da amplitude até que a superfície da amostra seja claramente vista. Em seguida, aumente o tamanho da digitalização para 1 mícron por 1 mícron e a resolução para 512 por 512 pixels. Por fim, clique no botão Capturar para iniciar a aquisição da imagem.