Quantificação da formação de babados de membrana usando microscopia eletrônica de varredura

Os estimuladores externos ativam as células e induzem a protrusão tridimensional da membrana circular, ou formação de babados da membrana, essenciais para várias atividades celulares.

Para visualizar a formação de babados de membrana, comece com uma placa de vários poços contendo uma lamínula na base. O topo da lamínula tem macrófagos cultivados.

Trate esses macrófagos com moléculas estimuladoras que ativam as células, facilitando a reorganização do citoesqueleto e a formação de protrusão da membrana. Cubra as células com uma solução fixadora, reticulando as proteínas e preservando a estrutura celular.

Trate os macrófagos fixos com concentrações crescentes de álcool para desidratação completa. Dessece esses macrófagos usando um secador de ponto crítico, eliminando quaisquer vestígios de água para obter melhores imagens.

Monte a lamínula em um suporte de amostra de microscopia eletrônica de varredura, ou SEM, usando fita condutora. O revestimento catódico da lamínula contendo macrófagos com uma fina camada de metal, garantindo boa condutividade eletrônica durante a imagem.

Coloque a lamínula na câmara SEM. Concentre o feixe de elétrons na lamínula. O feixe de elétrons atinge a membrana do macrófago revestido de metal, causando geração de elétrons secundários de baixa energia a partir da superfície da membrana.

As saliências tridimensionais espalham elétrons de maneira diferente do resto da membrana, destacando essas características na superfície da célula. O detector coleta os elétrons espalhados de várias regiões da superfície celular, gerando uma imagem de contraste.

Na imagem SEM, os macrófagos parecem mais escuros com saliências circulares brilhantes na superfície, confirmando a formação de babados.

Comece colocando lamínulas de vidro estéreis em poços de uma placa de 24 poços usando uma pinça autoclavada. Em seguida, semeie macrófagos RAW 264,7 nas lamínulas a uma densidade de 10⁶ células por mililitro e incube a placa durante a noite em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

No dia seguinte, substitua o meio em cada poço por 500 microlitros de meio completo fresco e, em seguida, pré-trate os macrófagos por 30 minutos com um controle de veículo, como DMSO, ou um inibidor de macropinocitose, como EIPA. Em seguida, para promover o inchaço da membrana, trate as células por 30 minutos com estimuladores de macropinocitose, como uma solução de PMA 1-micromolar ou 100 nanogramas por mililitro de fator estimulador de colônias de macrófagos.

Para fixar as células para microscopia eletrônica de varredura, aspire o meio dos poços e lave as lamínulas duas vezes com PBS gelado. Em seguida, incube as lamínulas em um fixador por 30 minutos em temperatura ambiente, seguido de incubação noturna a 4 graus Celsius.

No dia seguinte, sem perturbar a monocamada celular, lave suavemente e, em seguida, incube as lamínulas em 500 microlitros de cacodilato de sódio 0,1 molar por 15 minutos. Após duas lavagens com 500 microlitros de água destilada, lave as lamínulas duas vezes em 500 microlitros de uma série graduada de etanol com uma incubação de 10 minutos em cada lavagem.

Para realizar a secagem de pontos críticos, coloque as lamínulas em um secador de pontos críticos e cubra-as com etanol 100% e, em seguida, pressione o botão liga / desliga e abra o tanque de dióxido de carbono. Pressione o botão Cool por aproximadamente 30 segundos até que a temperatura diminua para 0 graus Celsius. Em seguida, pressione o botão Preencher até que uma bolha apareça na janela da câmara.

Em seguida, pressione o botão Purge até que o cheiro de etanol do escapamento de purga desapareça. Em seguida, pressione o botão Esfriar novamente, até que a temperatura diminua para 0 graus Celsius. Pressione novamente os botões Preencher e Eliminar para desativá-los. Em seguida, feche o tanque de dióxido de carbono. Pressione novamente o botão Cool para desligá-lo e, em seguida, pressione o botão Heat. Defina a temperatura para 42 graus Celsius e a pressão para 1.200 libras por polegada quadrada.

Assim que a pressão e a temperatura se estabilizarem, pressione o botão Sangrar para permitir que a pressão diminua lentamente. Quando a pressão da câmara atingir 150 libras por polegada quadrada, pressione o botão Vent e espere até que a pressão diminua para 0 libras por polegada quadrada. Desligue o secador de pontos críticos e remova as lamínulas.

Em seguida, usando abas adesivas de carbono, monte as lamínulas nos suportes de amostra de alumínio para microscopia eletrônica de varredura. Em seguida, prossiga para o revestimento por pulverização catódica usando ouro ou paládio em um revestidor por pulverização catódica.

Ligue o botão liga/desliga do revestidor por pulverização catódica. Depois que o vácuo atingir 30 militorrs, lave a câmara para remover a umidade e o ar desligando o interruptor de gás e girando a válvula de gás fino no sentido anti-horário. Quando o vácuo aumentar para 200 militorrs, desligue o interruptor de gás e espere até que o vácuo atinja 30 militorrs, Em seguida, lave a câmara novamente para remover a umidade e o ar conforme demonstrado. Depois de lavar a câmara três vezes, pressione o botão Timer e ajuste o botão Voltage até que o medidor leia 10 miliamperes. Em seguida, remova as lamínulas revestidas da câmara.

Para visualizar e quantificar os babados da membrana, insira as lamínulas de amostra na câmara de um microscópio eletrônico de varredura. Feche a porta e pressione o botão Evac. Abra o software de operação do microscópio e ajuste a tensão de aceleração para 15 quilovolts e a distância de trabalho para 10 milímetros. Pressione o botão Coordenadas e mova-se pelo controlador até que as células apareçam no centro da tela de observação. Defina a ampliação para 3500x e crie uma imagem da amostra clicando no botão Foto.