Name: Microscopia de força de protrusão: Um método para quantificar as forças desenvolvidas pela célula saliências (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Aprenda a quantificar forças de protrusão em podossomos de macrófagos usando microscopia de força atômica. Este método permite medir deformações em filmes flexíveis e converter dados em valores de força.

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Os autores agradecem a Anna Labernadie, Guillaume Charrière e Patrick Delobelle pela sua contribuição inicial para este trabalho e Matthieu Sanchez e Françoise Viala por sua ajuda com filmagem e edição de vídeo. Este trabalho tem sido apoiado pela L'Agence Nationale de la Recherche (ANR14-CE11-0020-02), la de derramar Fondation de la Recherche Médicale (FRM DEQ2016 0334894), INSERM plano de câncer, câncer de Toulouse Fondation e humano Frontier Science Program (RGP0035/2016).

1. preparação de grades Formvar-revestido
<ol><li>Limpar grelhas de microscopia eletrônica com acetona pura e secá-las com papel de filtro. Em seguida, limpe uma lâmina de microscópio com etanol puro, limpe com um papel de lente e retire a poeira com um ventilador.</li>
	<li>Coloque uma lâmina de vidro limpa de etanol verticalmente no funil de um dispositivo de fundição de filme contendo uma solução de Formvar na parte inferior. Cubra a parte superior do funil.</li>
	<li>Bomba de 100 mL de solução de Formvar (0,5% de dicloreto de etileno) com o bulbo atomizador até o nível atingir dois terços do slide.</li>
	<li>Manter a corrediça na solução por 1 min.</li>
	<li>Abra a válvula do dispositivo para drenar a solução de Formvar em um fluxo constante. Uma taxa de fluxo de 10 a 15 mL/s irá produzir um filme de Formvar de 30-80 nm. A espessura do filme é determinada pela concentração da solução de Formvar e pela taxa de drenagem. Nota: A taxa de drenagem pode ser controlada por abrindo lentamente a válvula de ventilação a pressão através da válvula de ar-para fora. A drenagem mais rápida, mais grosso o filme. Na prática, porque é difícil de prever a espessura da película da taxa de fluxo de Formvar, preparamos vários lotes de Formvar filmes e controlar sua espessura por AFM (consulte a etapa 2).</li>
	<li>Remover o slide da câmara e secar delicadamente o papel de filtro para remover qualquer líquido Formvar.</li>
	<li>Corte um retângulo de 20 x 50 mm do filme Formvar com uma lâmina de barbear.</li>
	<li>Encha um copo com água destilada limpa e lentamente mergulhar o slide verticalmente na água a flutuar fora do filme: o filme deve flutuar na superfície da água.</li>
	<li>Grades de acetona-limpo secos lugar no filme, brilhante face para cima.</li>
	<li>Coloque algumas das grades de uma lamela de vidro redonda (Ø 12 mm). Esta lamela servirá para medir a espessura da película (consulte a etapa 2).</li>
	<li>Cobri uma lâmina de microscópio com um adesivo branco redimensionado para ajustá-lo. Mergulhe o slide verticalmente na fronteira do filme Formvar flutuante até o filme inteiro adere ao slide. Remover o excesso de água do slide com papel de filtro e deixe secar à temperatura ambiente durante a noite.</li>
</ol>2. medição de espessura de filme
<ol><li>Corte o Formvar próximo a lamela com uma pinça para desconectá-lo do slide.</li>
	<li>Marque a localização da grade sob a lamela com uma caneta.</li>
	<li>Corte o Formvar em torno da grade marcada para desconectá-lo da lamela. Portanto, haverá um buraco na folha Formvar restante, que permitirá medir a espessura da película. Cobrir a lamela com PBS e coloque-a sobre uma lâmina de vidro no microscópio.</li>
	<li>Monte um cantilever de nitreto de silício sobre o bloco de vidro AFM, certificando-se que a listra dourada não é coberta pela ponta da primavera. Nota: A sensibilidade e a constante de mola do cantilever devem ter anteriormente foi calibrados em PBS.</li>
	<li>Montar o bloco de vidro para o módulo AFM e em seguida, coloque o módulo no microscópio.</li>
	<li>Colocar a lamela Formvar revestido na câmara de observação e cubra-o com 500 µ l de PBS.</li>
	<li>Digitalize a borda do buraco na folha de Formvar usando o AFM em modo de contato e um ponto de ajuste de força nN 0,5.</li>
	<li>Usar a superfície da lamela de vidro como a referência para medições de altura e avaliar a espessura de Formvar como a altura da secção transversal (executar pelo menos 10 medidas por lote de Formvar).</li>
</ol>3. semeadura de células nas grades
<ol><li>Sob uma capa estéril, colocar uma faixa (12 x 3 mm) de fita adesiva dupla-face sobre uma lamela.</li>
	<li>Cortar uma grade Formvar revestido com uma pinça e colocá-lo de cabeça para baixo sobre a fita adesiva (apenas o aro da grade deve ser anexado à fita). O filme de Formvar precisa encarar a lamela.</li>
	<li>Colocar este dispositivo em uma cultura bem.</li>
	<li>Coloque uma gota de 10 µ l de RPMI sem FCS contendo 104 macrófagos diferenciados de monócitos humanos16. Nota: Certifique-se de não tocar na grelha com a ponta da pipeta para não danificar o revestimento de Formvar.</li>
	<li>Incube durante 30 min (37 ° C, 5% CO2) para permitir que células aderem.</li>
	<li>Encha o poço com 2 mL de RPMI contendo 10% FCS.</li>
	<li>Incube o dispositivo para 2 h a 37 ° C e 5% CO2 deixar células aderem antes observação AFM.</li>
</ol>4. topografia medições das deformações induzida por Podosome
<ol><li>Cole duas tiras de fita adesiva duplicou face um fundo de vidro, placa de Petri. Nota: A distância entre as duas tiras deve ser menor que o diâmetro da grade.</li>
	<li>Cuidadosamente retire a grade chapeada com macrófagos da fita adesiva.</li>
	<li>Vire a grelha invertida para que as células de frente para o vidro e enfiar a grade entre as duas tiras adesivas.</li>
	<li>Fix a grade com duas novas tiras de adesivo duplicou face: grade assim vai ser imprensada entre duas tiras de adesivo, deixando a área central da grade acessível à ponta AFM. Nota: Certifique-se que a grade está bem fixo e não torcido; caso contrário o cantilever AFM não poderá se aproximar da superfície Formvar.</li>
	<li>Encha o prato de Petri com 2 mL de meio de cultura previamente aquecida a 37 ° C (RPMI com 10% de FCS) suplementado com 10 mM HEPES (pH 7,4).</li>
	<li>Coloque o prato de cultura em um aquecedor de prato de 37 ° C.</li>
	<li>Instale o aquecedor de prato no palco AFM.</li>
	<li>Deixe o sistema estabilizar a 37 ° C.</li>
	<li>No modo de contato com uma força de 0,5 nN, fazer uma primeira imagem global para localizar podosomes e depois digitalizar a topografia de Formvar a 3 Hz com um pixel aproximadamente 20 nm-grande. Nota: Evite varredura perto das bordas da grade.</li>
</ol>

<ol><li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Cells+Feel+and+Respond+to+the+Stiffness+of+Their+Substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate.</a> Science. 310, 1139-1143 (2005).</li>
<li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+Homeostasis+and+the+Malignant+Phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional Homeostasis and the Malignant Phenotype.</a> Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Elasticity+Directs+Stem+Cell+Lineage+Specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li>
<li>Gilbert, P. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Adaptation+to+Biomechanical+Stress+across+Length+Scales+in+Tissue+Homeostasis+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular Adaptation to Biomechanical Stress across Length Scales in Tissue Homeostasis and Disease.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 67, 141-152 (2017).</li>
<li>Vining, K. H., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Forces+Direct+Stem+Cell+Behaviour+in+Development+and+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanical Forces Direct Stem Cell Behaviour in Development and Regeneration.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2017).</li>
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<li>Labernadie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protrusion+Force+Microscopy+Reveals+Oscillatory+Force+Generation+and+Mechanosensing+Activity+of+Human+Macrophage+Podosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Protrusion Force Microscopy Reveals Oscillatory Force Generation and Mechanosensing Activity of Human Macrophage Podosomes.</a> Nature Communications. 5, 5343(2014).</li>
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<li>Proag, A., Bouissou, A., Vieu, C., Maridonneau-Parini, I., Poincloux, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Force+and+Spatial+Dynamics+of+Macrophage+Podosomes+by+Multi-Particle+Tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Force and Spatial Dynamics of Macrophage Podosomes by Multi-Particle Tracking.</a> Methods. 94, 75-84 (2016).</li>
<li>Cougoule, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Migration+of+Macrophages+Requires+Hck+for+Podosome+Organization+and+Extracellular+Matrix+Proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Migration of Macrophages Requires Hck for Podosome Organization and Extracellular Matrix Proteolysis.</a> Blood. 115, 1444-1452 (2010).</li>
<li>Cougoule, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+Leukocytes+and+Macrophages+of+Various+Phenotypes+Have+Distinct+Abilities+to+Form+Podosomes+and+to+Migrate+in+3d+Environments%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Blood Leukocytes and Macrophages of Various Phenotypes Have Distinct Abilities to Form Podosomes and to Migrate in 3d Environments.</a> European Journal of Cell Biology. 91, 938-949 (2012).</li>
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<li>Maridonneau-Parini, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Macrophage+3d+Migration%3A+A+Therapeutic+Challenge+to+Limit+Tissue+Infiltration%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Review%22%5BJournal%5D)">Control of Macrophage 3d Migration: A Therapeutic Challenge to Limit Tissue Infiltration.</a> Immunology Review. 262, 216-231 (2014).</li>
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<li>Lizarraga, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diaphanous-Related+Formins+Are+Required+for+Invadopodia+Formation+and+Invasion+of+Breast+Tumor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Diaphanous-Related Formins Are Required for Invadopodia Formation and Invasion of Breast Tumor Cells.</a> Cancer Research. 69, 2792-2800 (2009).</li>
<li>Carman, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+Diapedesis+Is+Initiated+by+Invasive+Podosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Transcellular Diapedesis Is Initiated by Invasive Podosomes.</a> Immunity. 26, 784-797 (2007).</li>
<li>Sage, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+Recognition+Is+Facilitated+by+Invadosome-Like+Protrusions+Formed+by+Memory%2FEffector+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen Recognition Is Facilitated by Invadosome-Like Protrusions Formed by Memory/Effector T Cells.</a> Journal of Immunology. 188, 3686-3699 (2012).</li>
<li>Sens, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Invasive+Podosome-Like+Structure+Promotes+Fusion+Pore+Formation+During+Myoblast+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">An Invasive Podosome-Like Structure Promotes Fusion Pore Formation During Myoblast Fusion.</a> Journal of Cell Biology. 191, 1013-1027 (2010).</li>
<li>Takito, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Transient+Appearance+of+Zipper-Like+Actin+Superstructures+During+the+Fusion+of+Osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The Transient Appearance of Zipper-Like Actin Superstructures During the Fusion of Osteoclasts.</a> Journal of Cell Science. 125, 662-672 (2012).</li>
<li>Shilagardi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-Propelled+Invasive+Membrane+Protrusions+Promote+Fusogenic+Protein+Engagement+During+Cell-Cell+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Actin-Propelled Invasive Membrane Protrusions Promote Fusogenic Protein Engagement During Cell-Cell Fusion.</a> Science. 340, 359-363 (2013).</li>
<li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+Form+an+Expanding+Diffusional+Barrier+That+Coordinates+Phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier That Coordinates Phagocytosis.</a> Cell. 164, 128-140 (2016).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Propriedades do material
A escolha do material para a membrana deformável, no nosso caso Formvar, precisa cumprir alguns requisitos. O material deve ser transparente à luz visível e apresentam fluorescência auto limitada para permitir as observações em campo claro e microscopia de fluorescência. A rugosidade do filme fino deve estar abaixo de 10 nm para evitar qualquer efeito topográfico na adesão celular e para permitir a observação clara das saliências induzida por célula po...

As células animais interagirem fisicamente com a matriz e as outras células que constituem o seu ambiente1. Isso é necessário para que eles migram, internalizar os corpos, adquirir informações externas ou diferenciar. Em tais processos, a célula deve gerar forças mecânicas e, como numerosos estudos têm demonstrado ao longo dos últimos anos, a capacidade de uma célula para gerar forças e sonda ambiente influencia seu comportamento biológico, dirigindo por exemplo proliferação ou diferenciação de2,3. Por sua vez, a medição de forças celulares é uma grande ajuda para estudar o Regulamento de geração de força e entender a sua implicação na célula destino4,comportamento e tecido5.
Últimos anos têm testemunhado o desenvolvimento de inúmeras técnicas para medir as forças que uma célula pode exercer sobre seu ambiente6. A maioria destes têm sido fundamentais para revelar que a tração forças que células exercem como eles puxam em sondas móveis ou um substrato deformável. No entanto, as forças mecânicas envolvidas em protrusão no ambiente extracelular sofrem com a falta de técnicas de medição e são até à data não bem caracterizada.
Para contornar essa limitação, apresentamos um método para medir forças exercidas ortogonalmente ao substrato. Ela consiste no chapeamento de células vivas em uma folha fina e elástica que pode deformar-se na direção ortogonal, tornando possível medir a deformação do substrato pelas células e deduzir as forças envolvidas. Topografia de substrato é medida com resolução nanoescala usando microscopia de força atômica e a avaliação das forças de deformação baseia-se no conhecimento da geometria do cêntrica estruturas celulares7,8, 9.
Aqui, descrevemos a configuração e a sua aplicação para medir as forças geradas pela podosomes, estruturas de adesão cêntrica formadas por macrófagos para sua migração mesenquimal em ambientes tridimensionais10,11, 12,13,14,15,16,17. Acreditamos que esta técnica vai avançar a compreensão da geração de força e sua regulação em muitos processos celulares que envolvem protrusão.

<table><tbody><tr><td>Grades de níquel de malha 200</td><td>Papel</td> de filtro Sigma-Aldrich <td>1001-055</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>Lâminas <td>de</td></tr><tr><td>microscópio</td><td>Fisher Scientific</td><td>10235612</td><td></td></tr><tr><td>Adesivos brancos 26 x 70 mm</td> Dispositivo de fundição de filme <td>Avery</td><td>DP033-100</td><td></td></tr><tr><td>com válvula em sua saída</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>71305-01</td><td></td></tr><tr><td>Razorblades</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>1.08543.0250</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>VWR</td><td>20066.321</td><td></td></tr><tr><td>Formvar Solução a 0,5% em dicloreto de etileno</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>15820</td><td></td></tr><tr><td>12 mm lamínulas</td><td>VWR</td><td>631-0666</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido</td> Microscópio de Força Atômica <td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert 200</td><td></td></tr><tr><td></td><td>JPK Instruments</td><td>NanoWizard III</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de amostra controlado por temperatura&nbsp;</td><td>JPK Instruments</td><td>BioCell</td><td></td></tr><tr><td>Cantilever de nitreto de silício com uma constante nominal de mola de 0,01 N/m</td><td>Veeco Instruments</td><td>MLCT-AUHW</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Fita adesiva dupla face</td><td>APLI AGIPA</td><td>118100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td>Placas de Petri com fundo de vidro <td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>35 mm</td><td>WPI</td><td>FD35-100</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopia de força de protrusão: um método para quantificar as forças desenvolvidas pela célula saliências

Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

Em inúmeros contextos biológicos, células animais precisam interagir fisicamente com o seu ambiente através do desenvolvimento de forças mecânicas. Entre estes, as forças de tração foram bem caracterizadas, mas há uma falta de técnicas que permite a medição de protrusão forças exercidas pelas células ortogonalmente à sua carcaça. Nós projetamos uma instalação experimental para medir as forças de protrusão exercidas pelas células aderentes em sua carcaça. Células banhadas em uma folha de Formvar compatível com deformam o substrato e a topografia resultante é mapeada por microscopia de força atômica (AFM) à escala nanométrica. Valores de força então são extraídos de uma análise do perfil deformação baseado na geometria das estruturas celulares cêntrica. Portanto, as forças exercidas pelas unidades individuais salientes de uma célula viva podem ser medidas ao longo do tempo. Esta técnica permitirá que o estudo da geração de força e sua regulação em muitos processos celulares que envolvem protrusão. Aqui, descrevemos o seu aplicativo para medir as forças cêntrica geradas por podosomes formado por macrófagos humanos.

O protocolo acima descreve como preparar a instalação experimental para quantificar as forças de protrusão aplicadas pelos macrófagos podosomes sobre um substrato de Formvar. Isto é conseguido usando AFM e é ilustrado na Figura 1.
Ao analisar uma imagem topográfica de protuberâncias abaixo podosomes usando o software de processamento de dados JPK, um polinômio de terceiro grau se encaixam convém sub...

Aqui, detalhamos as técnicas experimentais utilizadas para avaliar as forças de saliência que podosomes aplicar sobre um filme compatível, desde a preparação do filme para a análise automatizada de imagens topográficas.

Microscopia de força de protrusão: Um método para quantificar as forças desenvolvidas pela célula saliências

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction ...

O objetivo geral deste procedimento é quantificar as forças de protrusão usando microscopia de força atômica. Isso é feito primeiro preparando as grades revestidas com fórmula e medindo a espessura desse filme. A terceira etapa desse processo consiste em assentar as células nas grades e deixá-las aderir.A etapa final do procedimento é obter imagens do filme sob as células usando microscopia de força atômica. Ao aderir ao substrato, os micrófagos formam estruturas de adesão submicrométricas chamadas podossomos. Por fim, a deformação do filme utilizado pelos podossomos será quantificada e convertida em forças usando um modelo mecânico caseiro.Coloque uma luz de vidro limpa com etanol no dispositivo de fundição de filme de funil e cubra a parte superior do funil. Colocar a solução de fomvar no funil até que o nível atinja dois terços da lâmina. Deixar agir durante um minuto e depois escorrer a solução de formvar num jato constante.Observe que a espessura do filme depende tanto da taxa de fluxo quanto da concentração da solução de formvar. Seque esta luz escura e corte retângulos com uma lâmina de barbear afiada. Mergulhe a lâmina em seu copo cheio de água destilada para que o filme fomvar flutue na superfície da água.Coloque cuidadosamente grades limpas de acetona nos filmes, com a face brilhante para cima com uma lamínula de 12 milímetros de diâmetro em cima de alguns deles. Eles serão usados para o experimento de avaliação de espessura. Eventualmente, mergulhe um slide coberto de adesivos para recuperar todo o filme e as grades.Contorne a tira coberta de vidro com uma pinça para cortar o formvar e solte-o da lâmina. Monte a localização da grade abaixo do deslizamento coberto e, em seguida, contorne a grade com uma pinça para retirá-la. O orifício no filme fomvar assim criado será fotografado para medir sua espessura.Monte um nitrato de silício no bloco de vidro AFM, certificando-se de que a faixa dourada não esteja abaixo da ponta da mola. Monte o bloco de vidro no módulo AFM e coloque este último no estágio do microscópio. Coloque a lamínula revestida com fomvar na câmara de observação com PBS por cima.Digitalize a borda entre fomvar e vidro no modo de contato e com um ponto de 0,5 nano newton. No software de processamento de dados, use a superfície do vidro como referência de altura e meça a espessura do fomvar na seção transversal. Sob um capuz estéril, pegue uma lamínula de 12 milímetros e cole uma tira da fita adesiva sobre ela.Contorne a grade revestida com uma pinça e coloque-a com a face brilhante para cima, de modo que apenas os lados se prendam ao adesivo. Isso é para evitar que o fomvar seja rasgado ao remover a grade da fita. Coloque a tira de cobertura em uma placa estéril de seis poços e canalize em uma gota de 10 milímetros de meio de cultura livre de soro.Deve conter aproximadamente 10 mil células e, neste caso, são micrófagos diferenciados dos monócitos humanos. Certifique-se de não tocar na grade com a ponta do flautista no processo, para não danificar o revestimento do fomvar. Incube por meia hora para deixar as células aderirem, depois encha o poço com meio suplementado com soro e incube novamente por duas horas, antes da observação do AFM.Coloque duas tiras paralelas de fita dupla face em uma placa de Petri com fundo de vidro, certificando-se de que a largura entre elas seja um pouco menor, em comparação com o diâmetro da grade. Em seguida, destaque a grade previamente semeada com células e coloque-a em cima das duas fitas com as células voltadas para baixo. Fixe a grade colocando duas outras tiras em cima das anteriores.Encha o prato com meio de cultura pré-aquecido suplementado com hepe's. Coloque o prato no aquecedor de pratos previamente ajustado para 37 graus Celsius. Instale o conjunto no estágio AFM.Quando a temperatura do sistema estiver estável em 37 graus Celsius, prossiga para a varredura da superfície do fomvar, que deve ser realizada no modo de contato, com um ponto de ajuste de 0,95 nano newton e visualize as deformações associadas ao protozoário na janela de visualização de dados de deflexão. Aqui estão os resultados representativos e as etapas de processamento para produzir formações com AFM para as medições gráficas. Como você pode ver nesta imagem, protuberâncias na superfície fomvar são detectadas.Para converter essas informações fotográficas em valores de força, é necessário primeiro ter acesso à alta diferença local. Para fazer isso, um ajuste polinomial de terceiro grau deve ser subtraído de sua linha de varredura independentemente. Em seguida, o uso de um algoritmo de imagens dedicado caseiro permite avaliar os valores da força de protrusão do mapa de altura do AFM e do modelo mecânico da protrusão mediada por protozoários.Graças a este procedimento, podemos investigar os mecanismos envolvidos na geração de força de protrusão em protozoários. Obrigado por assistir e boa sorte por seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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