Medição de Múltiplos Parâmetros Mitocondriais em Neurônios usando Citometria de Fluxo

Pegue neurônios fixos e permeabilizados em um tubo.

Adicione um tampão de bloqueio para evitar a ligação de anticorpos não específicos.

Centrifugue a suspensão e remova o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda os neurônios no tampão.

Transfira a suspensão igualmente para tubos contendo anticorpos primários não marcados e marcados com fluoróforo.

Incubar, permitindo que os anticorpos se liguem especificamente à cadeia respiratória mitocondrial ou subunidades do complexo MRC, uma proteína associada ao DNA mitocondrial e uma proteína da membrana externa mitocondrial dentro dos neurônios.

Remova quaisquer anticorpos não ligados.

Incubar com anticorpos secundários marcados com fluoróforo que se ligam aos anticorpos primários não marcados.

Centrifugue a mistura e descarte o sobrenadante.

Ressuspenda os neurônios em tampão e transfira-os para tubos de microcentrífuga.

Realize citometria de fluxo para detectar os sinais fluorescentes nos neurônios marcados, correspondendo aos níveis de expressão das subunidades do complexo MRC e à medição dos níveis relativos de DNA mitocondrial.

Bloqueie as amostras em 1 mililitro de tampão de bloqueio e lave as células por centrifugação com PBS, conforme