Name: A realização de experimentos de Microarray personalizado MicroRNA (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Aprenda a realizar experimentos de microarray personalizado de microRNA para análise de expressão genômica. Este método permite quantificar perfis de microRNAs e estudar regulação gênica em escala global.

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O trabalho foi suportado em parte pelo Instituto Nacional de Abuso de Drogas Center (P50 DA 011.806) e Exército dos Estados Unidos Departamento de Defesa (W81XWH-07-1-0183).

1. Impressão de microarrays miRNA personalizado <ol><li> Imprimir o microarray slides usando o microarray serviços instalação do núcleo de uma universidade ou uma empresa. A qualidade de microarray de fabricação é um dos fatores mais críticos para o sucesso de um experimento de microarray. Tente alguns serviços, se possível. Idealmente, seria imprimir 5-10 slides de cada vez, e todos os slides parecem idênticos, com bem separados, os pontos individuais. </li><li> Para suporte microarray, usamos as lâminas GAPS II revestido. </li><li> Para sondas de miRNA, usamos o nCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2. </li><li> Dissolver todos os oligonucleotídeos em 3 x SSC, 10 mM e quadruply imprimi-los nos slides. Corrigir os slides por irradiação ultravioleta acordo com as instruções para os slides GAAP II. Deslize o rótulo com uma caneta de diamante para marcar a área e laterais com as pontas de prova impressa. Loja em 22 ° C. </li></ol> 2. Preparação de amostras <ol><li> Qualquer métodoou reagente pode ser usado para isolar RNA, enquanto preserva pequenos RNAs. Geralmente usamos Trizol (Invitrogen) para extrair RNA total, com quantidade satisfatória e qualidade das preparações de RNA, medido por A 260nm e A 280nm leituras. </li><li> RNA para rotulagem, mix ~ 25 mg de RNA total com 0,5 mg de 5'-PCU-DY547-3 '6 em 1 x tampão (50 mM HEPES, pH 7.8, 20 mM MgCl 2, 10 mg / ml BSA, 10% DMSO), contendo ~ 20 unidades T4 RNA Ligase 1, suplementado com 10 mM DTT ~ e volume ~ 0,02-0,03 final do T4 10 x RNA Ligase um buffer para ATP. </li><li> Permitir a rotulagem para prosseguir no gelo dentro de uma geladeira por 2-24 horas. RNA precipitado com acetato de sódio 0,3 M e 3 volumes de etanol. Para ligação eficiente e precipitação, dissolver RNA total em mais de 2 mg / ml, e manter o volume total de ligadura em ~ 20 mL. <ol><li> Se RNA menos está disponível, a quantidade de entrada de RNA e 5'-PCU-DY547-3 'pode ser reduzida. &lt;/ Li&gt; </li><li> Se o RNA é muito diluída, adicione portador tal como o tRNA de levedura para ajudar na precipitação. </li></ol></li><li> Combinar e rótulo em mg um total de oligonucleotídeos de referência DNA correspondente a um subconjunto de miRNAs em mamíferos usando o Ulysis Alexa Fluor 647 Kit Rotulagem de Ácido Nucleico 6 como um controle para o processo de hibridização. Purificar o DNA rotulados com uma coluna CentriSep e salvar no escuro a -20 ° C. </li></ol> 3. Hibridação de microarrays <ol><li> Para utilizar os slides, pela primeira vez, pré-hibridizar os slides em uma solução filtrada de 3 x SSC, 0,1% SDS, BSA 0,2% por 30-60 min a 37 ° C. Submergir em água algumas vezes, então, em isopropanol. Secar as lâminas usando uma centrífuga com um adaptador de slide de 100 g por 5 min a 22 ° C. </li></ol> Nota: Nós usamos câmaras Corning hibridização microarray e mSeries Erie Científico de Lifterslips para realizar a hibridação microarray. <ol start="2"><li> Lavar o lifterslips em água, em seguida, em etanol, antes da secagem ao ar. Coloque um slide dentro de uma base da câmara de hibridização de microarrays, e um lifterslip em cima do slide. O lifterslip vai cobrir a área da sonda, com o seu contato com a tiras brancas slide. </li><li> No escuro, girar o precipitado, RNA marcados. Lavá-lo uma vez com etanol 70%, eo ar seco do sedimento. O pellet deve ser avermelhada. </li><li> Prepare uma solução de hibridização contendo 400 mM Na 2 HPO 4 pH 7,0, 0,8% BSA, 5% SDS, 12% formamida 6 com 1/15-1/100 mL do purificado, rotulados de referência DNA (2,4) por amostra de RNA. A quantidade de DNA de referência adicionada depende de quantos diferentes oligonucleotídeos são rotulados (2.4). Se houver mais de 100, em seguida, menos de diluição é necessária. </li><li> Dissolver o sedimento RNA bem com ~ 60 mL da solução de hibridização. </li><li> Adicionar 20 l de água para cada um dos poços de umidificação na base da câmara Corning microarray de hibridização. </li><li> Adicionar tele mistura de RNA e DNA rotulados de referência para o slide. Use a ponta da pipeta fina, suave toque na borda da lifterslip, e permitir que a solução para entrar no espaço entre o lifterslip e deslize através de sucção. </li><li> Coloque a câmara de hibridação tampa sobre a base, em seguida, selar a câmara com clipes de metal. </li><li> Coloque toda a câmara dentro do saco plástico que vem com a cassete da câmara de Corning. </li><li> Coloque a cassete da câmara (s) dentro de um recipiente com papel toalha molhada; cobrir o recipiente com filme plástico e coloque-o dentro de um 37 ° C úmido, cultura de células incubadora para ~ 24 horas. Estas precauções (3.6, 3.9, 3.10) garantir que a solução de hibridização não seca durante a incubação. </li></ol> 4. Pós-processamento de hibridização <ol><li> Desmonte a câmara de cassetes, um por um. Slides submergir e na sua lifterslip em 2 x SSC a 22 ° C. O lifterslip caberá naturalmente fora do slide. Coloque-o em 0,8 x SSC. Lavaros slides em 0,8 x SSC duas, três vezes em 0,4 x SSC, 1-2 min no total. Secar as lâminas usando uma centrífuga com um adaptador de slide. Lave o lifterslips com água e guarde para reutilização posterior. </li><li> Digitalizar os slides com qualquer scanner apropriado, por exemplo, a Perkin Elmer 5000 ou ScanArray Molecular Devices Axon GenePix 4000B scanner microarray. Varredura em comprimentos de onda próximo a 547 nm e 647 nm para obter os arquivos de imagem correspondente. </li><li> Use programas como o BlueFuse para quantificar intensidade dos pixels na entrada, arquivos de imagem de 4.2). Inspecionar os pontos individuais com o programa para excluir manchas anormais na microarrays de análise mais aprofundada. Essas manchas anormais geralmente surgem a partir de impressão de slides pobres ou deslize após a manipulação de hibridização. </li><li> Utilizar programas como Excel e GeneSpring para análise de dados e apresentação. Considerações gerais para normalização de dados microarray aplicar, o que está além do escopo deste artigo. </li><li> Uma vez que os sinais satisfatórios são obtidos after 4.3), tira as lâminas de microarrays para reutilização 7. Enxágüe as lâminas em água, em seguida, mergulhar na pré-aquecido, 1 mM NaOH e 0,1 x SSC em um prato de coloração a 62 ° C por 10-20 minutos. Repita a incubação uma vez. Lave o C. slides algumas vezes em água por até 60 minutos com agitação suave a 22 ° Secar as lâminas usando uma centrífuga, e armazenar a 22 ° C. </li><li> Para utilizar os slides regenerados, não é necessário pré-hibridizar-los novamente. Basta lavá-los em água seguido de isopropanol, seco e as lâminas direita antes de hibridização. </li></ol> 5. Resultados representativos: Temos em grande parte seguido os procedimentos descritos para perfil de expressão de miRNA mundial em milhares de amostras, ou seja, RNAs isolados de zebrafish a espécime humana sob diversas condições. A Figura 1 mostra uma imagem digitalizada de um microarray de demonstrar sinais de hibridação muito precisa e forte na slide. O Relacionados Pearsonsobre os coeficientes técnicos entre réplicas de hibridização de microarrays são ~ 0.99 7, indicando excelente reprodutibilidade. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3250/3250fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 Imagem composta de uma lâmina de microarray miRNA digitalizados após hibridização. Manchas vermelhas resultou de hibridizações pelo DNA de referência, pontos verdes a partir da amostra de RNA DY547-rotulados, enquanto as manchas amarelas eram de hibridizações por ambos DNA e RNA para as mesmas sondas.

<ol><li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functions+of+animal+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The functions of animal microRNAs.</a> Nature. 431, 350-355 (2004).</li>
<li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92-105 (2009).</li>
<li>Chekulaeva, M., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+miRNA-mediated+post-transcriptional+regulation+in+animal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of miRNA-mediated post-transcriptional regulation in animal cells.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 21, 452-460 (2009).</li>
<li>Farazi, T. A., Spitzer, J. I., Morozov, P., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNAs+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">miRNAs in human cancer.</a> J. Pathol. 223, 102-115 (2011).</li>
<li>Small, E. M., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pervasive+roles+of+microRNAs+in+cardiovascular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pervasive roles of microRNAs in cardiovascular biology.</a> Nature. 469, 336-342 (2011).</li>
<li>Thomson, J. M., Parker, J., Perou, C. M., Hammond, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+custom+microarray+platform+for+analysis+of+microRNA+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression.</a> Nat. Methods. 1, 47-53 (2004).</li>
<li>Zhang, X., Xu, W., Tan, J., Zeng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stripping+custom+microRNA+microarrays+and+the+lessons+learned+about+probe%3Aslide+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Stripping custom microRNA microarrays and the lessons learned about probe:slide interactions.</a> Anal. Biochem. 386, 222-227 (2009).</li>
<li>Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRBase%3A+tools+for+microRNA+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">miRBase: tools for microRNA genomics.</a> Nucl. Acids. Res. 36, D154-D158 (2008).</li>
<li>Landgraf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mammalian+microRNA+expression+atlas+based+on+small+RNA+library+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing.</a> Cell. 129, 1401-1414 (2007).</li>
<li>Chiang, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+microRNAs%3A+experimental+evaluation+of+novel+and+previously+annotated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes.+Dev%22%5BJournal%5D)">Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes.</a> Genes. Dev. 24, 992-1009 (2010).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Apesar dos avanços recentes nas tecnologias de seqüenciamento de profundidade, microarray continua a ser uma opção viável para high-throughput análise de DNA e RNA. Comparado ao seqüenciamento de profundidade, as experiências microarray são mais baratos, e um laboratório de biologia molecular típico pode executar a maioria dos experimentos e análise de dados in-house, o que permite flexibilidade e economiza tempo. No futuro, é provável microarrays adequado para interrogar intensamente conjuntos de genes, por exemplo, to...

<table border="1"><tbody><tr><th> Itens </th><th> Vendedor </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> NCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2 </td><td> Invitrogen </td><td> MIRMPS201 </td><td> Desenhado com base nos miRBase Release 9.0 (Outubro de 2006). Ele contém ~ 1140 sem modificações, 34-44 nt oligonucleotídeos longos como sondas para voar worm,, peixe-zebra, rato, rato, e miRNAs humanos, e um número de sondas de controle interno, como snoRNAs. As sondas de miRNA são doublets das seqüências complementares de miRNAs maduros, daí o tamanho de ~ 44 nt. Para a análise de um pode se concentrar em miRNAs de um genoma particular (s) de interesse. </td></tr><tr><td> Trizol </td><td> Invitrogen </td><td> 15596018 </td><td> Temos também utilizado enriquecido, fração de RNA pequeno de rotulagem, embora total de amostras de RNA são mais rápidos e mais fáceis de preparar e de quantificar e adequado para aplicações a jusante como a análise de mRNA. </td></tr><tr><td> T4 RNA Ligase 1 </td><td> New England Biolabs </td><td> M0204L </td><td></td></tr><tr><td> Ulysis Alexa Fluor 647 Kit Rotulagem de Ácido Nucleico </td><td> Invitrogen </td><td> U21660 </td><td> Este kit ou produtos similares podem ser usados ​​para rotular amostras experimentais RNA ou um RNA de controlo (em vez de DNA de controle) também. </td></tr><tr><td> 5&#39;-PCU-DY547-3 &#39; </td><td> Dharmacon </td><td> Feitos </td><td> Fração pequena do RNA pode ser igualmente marcada pela ligadura. </td></tr><tr><td> Colunas CentriSep </td><td> Separações Princeton </td><td> CS-901 </td><td></td></tr><tr><td> GAPSII corrediça revestida </td><td> Corning </td><td> 40004 </td><td> Outros tipos de slides podem ser usados ​​também. </td></tr><tr><td> Hibridização câmaras de microarray </td><td> Corning </td><td> 2551 ou 40080 </td><td> Outros tipos de câmaras de hibridação e lamínulas também deve funcionar. Utilização de máquinas de hibridização comercialmente disponíveis podem reduzir o tempo de hibridização significativamente, por exemplo, a ~ 2 horas. </td></tr><tr><td> Lifterslips </td><td> ThErmo / Erie Scientific </td><td> 25X60I-M5439-001-LS </td><td></td></tr><tr><td> BlueFuse </td><td> BlueGenome </td><td></td><td></td></tr><tr><td> GeneSpring </td><td> Agilent </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a realização de experimentos de microarray personalizado microrna

Performing Custom MicroRNA Microarray Experiments

microRNAs (miRNAs) são uma grande família de ~ 22 nucleotídeos (nt) longas moléculas de RNA, que são amplamente expressos em eucariotos 1. Genomas complexos codificam pelo menos centenas de miRNAs, que principalmente inibir a expressão de um vasto número de genes-alvo pós-transcricionalmente 2, 3. miRNAs controlam uma ampla gama de processos biológicos 1. Além disso, a expressão de miRNA alterados tem sido associado com doenças humanas como câncer e miRNAs podem servir como biomarcadores para doenças e prognóstico 4, 5. É importante, portanto, entender a expressão de miRNAs e funções sob diversas condições. Três abordagens principais têm sido empregadas para expressão perfil de miRNA: real-time PCR, microarranjos, seqüenciamento e profunda. A técnica de microarray miRNA tem a vantagem de ser de alto rendimento, geralmente menos caro, ea maioria das etapas experimentais e análise pode ser carried em um laboratório de biologia molecular na maioria das universidades, as escolas médicas e hospitais associados. Aqui, nós descrevemos um método para a realização de experimentos de microarray miRNA personalizado. Um conjunto de sonda de miRNA serão impressas em lâminas de vidro para produzir microarrays miRNA. RNA é isolado usando um método ou reagente que preserva espécies de pequenos RNA, e então marcadas com um corante fluorescente. Como controle, oligonucleotídeos referência DNA correspondente a um subconjunto de miRNAs também estão marcadas com um corante fluorescente diferente. O DNA de referência servirá para demonstrar a qualidade do slide e hibridação e também será utilizado para a normalização de dados. O RNA e DNA são misturados e hibridizado com uma lâmina de microarray contendo sondas para a maioria dos miRNAs na base de dados. Após a lavagem, o slide é digitalizada para obter imagens e intensidades dos pontos individuais quantificadas. Esses sinais-prima será processada e analisada como os dados da expressão do miRNAs correspondente. Microaslides rray pode ser descascado e regenerado para reduzir o custo de microarrays e para reforçar a coerência das experiências microarray. Os mesmos princípios e procedimentos são aplicáveis ​​a outros tipos de experimentos de microarray personalizado.

Um procedimento simples de realizar experimentos de microarray personalizado microRNA é descrito. As etapas incluem isolar RNA, rotulagem RNA e DNA de referência, hibridação as amostras para microarrays, a digitalização da microarrays, quantificar e analisar os sinais de hibridização.

A realização de experimentos de Microarray personalizado MicroRNA

os microRNAs (miRNAs) são uma grande família de moléculas de RNA com aproximadamente 22 nucleotídeos (nt) de comprimento que são amplamente expressas em eucariotos 1. Genomas complexos codificam ...

O objetivo geral deste procedimento é realizar um experimento de microarranjo de microRNA. Isso é realizado primeiramente adquirindo lâminas de microarranjo impressas que contêm uma biblioteca de sondas de microRNA e preparando amostras de RNA com qualidade e quantidade adequadas. Em seguida, o RNA e uma amostra de DNA controlada são marcados com corantes fluorescentes.Em seguida, os ácidos nucleicos marcados são adicionados a uma lâmina de microarranjo para hibridização. Por fim, a lâmina de microarranjo é lavada, escaneada e regenerada. Em última instância, podem ser obtidos resultados que mostram a expressão em todo o genoma de microRNAs por meio da análise da lâmina quanto às intensidades de hibridização das sondas individuais de microRNA.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de expressão gênica, como como condições fisiológicas normais ou condições patológicas afetam diferencialmente as necessidades de expressão de microRNAs em uma escala global. A qualidade da fabricação do microarranjo é um dos fatores mais críticos para o sucesso de um experimento com microarranjo. Após o isolamento de RNA utilizando um método que preserve os pequenos RNAs e res

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Biologia

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