A realização de experimentos de Microarray personalizado MicroRNA

O objetivo geral deste procedimento é realizar um experimento de micro RNA microarray. Isso é feito primeiro adquirindo lâminas de microarray impressas que contêm uma biblioteca de sondas de micro RNA e preparando amostras de RNA com qualidade e quantidade adequadas. Em seguida, a amostra de RNA e DNA controlado A é marcada com corantes fluorescentes.

Em seguida, os ácidos nucléicos marcados são adicionados a uma lâmina de microarray para hibridização. Finalmente, a lâmina de microarray é lavada e digitalizada e a lâmina é regenerada. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a expressão genômica ampla de microRNAs por meio da análise da lâmina para intensidades de hibridização das sondas de microRNA individuais.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da expressão gênica, como como as condições fisiológicas normais ou as condições patológicas diferenciais afetam as necessidades micro de expressão em escala global. A qualidade da fabricação de microarrays é um dos fatores mais críticos para o sucesso de um experimento de microarrays. Depois de isolar o RNA usando um método que preserva pequenos RNAs e suspendê-lo novamente em uma concentração igual ou superior a dois miligramas por mililitro, rotule o RNA em um volume de reação de 20 microlitros misturando primeiro cerca de 25 microgramas de RNA total com 0,5 microgramas de cinco primos P-C-U-D-Y 5 4 7 3 primos em um tampão X HEPs suplementado com T quatro RNA Ligase 1D TT, e um TP. Se houver menos RNA disponível, reduza a quantidade de RNA e a reação.

Se o RNA estiver muito diluído, adicione um transportador como levedura, TRNA para ajudar na precipitação, incube a reação no gelo dentro de uma geladeira por duas a 24 horas. Em seguida, adicione acetato de sódio a 0,3 molar e, em seguida, três volumes de etanol e precipite o RNA durante a noite a 20 graus Celsius negativos. Para usar as lâminas pela primeira vez, pré-hibridize-as em uma solução filtrada de três XSSC, 0,1% SDS e 0,2% BSA por 30 a 60 minutos a 37 graus Celsius.

Em seguida, mergulhe os slides na água algumas vezes. Em seguida, em isopropanol, secar as lâminas com uma centrífuga com um adaptador de lâminas a 100 vezes G durante cinco minutos a 22 graus Celsius. Enxágue as tiras do elevador em água.

Em seguida, em etanol antes de secar ao ar, coloque uma lâmina dentro de uma base de câmara de hibridização de microarray e uma lâmina de elevação no topo da lâmina para que a lâmina de elevação cubra a área da sonda e suas tiras brancas. Entre em contato com a lâmina no escuro, gire o RNA rotulado precipitado, lave-o uma vez com etanol a 70% e seque o pellet ao ar. O pellet deve ser de cor avermelhada.

Prepare uma solução de hibridização usando um 15º a um centésimo em volume do DNA de referência marcado purificado por amostra de RNA Dissolva o pellet de RNA completamente com cerca de 60 microlitros da solução de hibridização para garantir que a solução de hibridização não seque. Durante a incubação, adicione 20 microlitros de água a cada um dos poços umidificadores. Na base da câmara de hibridização de microarray.

Adicione uma mistura de RNA marcado e DNA de referência à lâmina. Usando uma ponta de pipeta fina, toque suavemente a borda do deslizamento do elevador e através da sucção. Deixe a solução entrar no espaço entre o deslizamento e a corrediça do elevador.

Coloque a tampa da câmara de hibridização sobre a base. Em seguida, sele a câmara com clipes de metal. Coloque toda a câmara dentro do saco plástico que acompanha o da câmara.

Por fim, coloque o da câmara dentro de um recipiente com uma toalha de papel molhada. Em seguida, cubra o recipiente com filme plástico e coloque-o dentro de uma incubadora de cultura de células úmidas a 37 graus Celsius por cerca de 24 horas. Para processar as lâminas após a hibridização, desmonte os da câmara um por um, submerja uma lâmina e seu elevador deslize em dois XSSC a 22 graus Celsius.

O deslizamento do elevador cairá naturalmente da corrediça, lave as corrediças em 0,8 XSSC duas vezes e depois três vezes em 0,4 XSSC por um total de um a dois minutos. Seque as lâminas usando uma centrífuga com um adaptador de lâminas. Em seguida, digitalize as lâminas com um scanner de microarray e use um programa como o blue fuse para quantificar as intensidades nos arquivos de imagem.

Inspecione pontos individuais para excluir pontos anormais que geralmente surgem da impressão de lâminas de poros ou manuseio de lâminas Após a hibridização. Para análise e apresentação de dados, use programas como gene springing e excel para reutilizar o microarray. Descasque a lâmina enxaguando-a em água e, em seguida, mergulhando-a em uma placa de coloração de NAOH milimolar pré-aquecido e 0,1 XSSC a 62 graus Celsius por 10 a 20 minutos.

Repita a incubação uma segunda vez. Lave as lâminas várias vezes em água por até 60 minutos com agitação suave a 22 graus Celsius. Seque as lâminas usando uma centrífuga e armazene 22 graus Celsius.

As lâminas podem ser usadas sem pré-hibridização. Esta figura mostra uma imagem digitalizada de um microarray demonstrando sinais de hibridização muito precisos e fortes. As manchas vermelhas resultaram da hibridização das manchas verdes de DNA de referência da amostra de RNA marcada com DY 5 47, e as manchas amarelas foram da hibridização do DNA e do RNA com as mesmas sondas.

Os coeficientes de correlação de Pearson entre réplicas técnicas de hibridização de microarray são de cerca de 0,99, indicando excelente reprodutibilidade. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar um experimento de microraios personalizado, não apenas para quantificar a micronase, mas também para quantificar outros tipos de ácido nucléico, como mRNAs.