Avaliação do Câncer de Migração Stem Cell Usando compartimentar dispositivos microfluídicos e imagens de células vivas

O objetivo geral deste procedimento é inspecionar e caracterizar visualmente a migração de células cancerígenas por meio de um dispositivo microfluídico compartimentalizador. Isso é conseguido primeiro dissociando neuroesferas pré-existentes de células-tronco tumorais cerebrais cultivadas em meio livre de soro. O segundo passo é fabricar um mestre SU de oito camadas bicamadas e usar o molde de litografia macia A-P-D-M-S stamp que tem um design compartimentado.

Em seguida, monte o dispositivo microfluídico e carregue-o com células-tronco tumorais cerebrais. Finalmente, a imagem de lapso de tempo de longo prazo da migração de células-tronco do tumor cerebral é realizada usando um sistema microscópico tudo-em-um. Em última análise, os resultados mostram que as células-tronco tumorais cerebrais exibem uma sequência rotativa de estágios morfológicos durante sua migração através do espaço ultraconfinado.

A principal vantagem desta técnica sobre massas existentes, como a Câmara Transwell Boyton, é que o microdispositivo permite a inspeção visual do processo de migração, colocação controlada de células e a entrega precisa de fatores. Portanto, a tecnologia microfórica possui recursos de seleção e navegação de célula única confiáveis, eficientes e econômicas. As implicações dessa técnica se estendem à terapia de metástase e recorrência do câncer, porque a análise de células únicas de células altamente migratórias pode identificar potenciais alvos quimioterápicos futuros.

Embora esse método possa fornecer informações sobre o comportamento de migração do sistema cancerígeno, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como desenvolvimento embrionário, respostas imunes, cicatrização de feridas e regeneração de órgãos. Começando com a suspensão celular de lanças neuros derivadas de BTSC. Agrupe as células em um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugue-as a 900 RPM por cinco minutos, mas não mais rápido.

Aspire o super natin. Em seguida, permita que as neuroesferas se soltem incubando-as em 0,5 mililitros de Accutane pré-aquecido por cinco a 10 minutos a 37 graus Celsius. Após a incubação, interrompa mecanicamente as células com 10 a 20 movimentos suaves de uma pipeta P 100.

Em seguida, adicione 1,5 mililitros de meio de células-tronco para neutralizar a centrífuga Accutane, a suspensão celular a 1300 RPM por cinco minutos e ressuspenda as células em um mililitro de meio de células-tronco. Verifique a densidade celular com um hemocitômetro e ajuste a densidade para 20.000 células por microlitro. Para iniciar a fabricação do mestre SU oito, prepare duas máscaras fotográficas usando o Adobe Illustrator e o filme de transparência de impressão a laser com Image Setter incorporado.

A primeira camada de máscara fotográfica consiste em dois marcadores fiduciais e uma matriz de microcanais, e a segunda camada de máscara fotográfica tem as câmaras de assento e recepção. Limpe as duas camadas da máscara com isopropanol e deixe-as secar ao ar. Agora gire a camada de um wafer de alça com três mícrons de espessura SU oito fotorresistentes, seguido de cozimento macio.

Em seguida, com a máscara fotográfica de primeira camada em contato próximo com uv, exponha a foto, resista e deixe-a curar. Em seguida, pós-asse e desenvolva o wafer curado. Cubra as áreas de marcadores fiduciais do wafer do cabo com fita adesiva.

Em seguida, gire o revestimento do wafer com fotorresistência de 250 mícrons de espessura. Depois, retire a fita para revelar os marcadores para fins de alinhamento. Coloque a segunda camada de fotorresiste e alinhe os marcadores fiduciais.

Em seguida, exponha e cure a máscara fotográfica da segunda camada, seguida de pós-cozimento e revelação. Agora ize o mestre SU oito por meio de deposição de vapor para reduzir a aderência da superfície. Coloque as bolachas em um dessecador com várias gotas de solução de Tri Chloro cline sob vácuo por pelo menos uma hora.

O mestre estará então pronto para ser usado para moldar o PDMS com o mestre. Comece misturando bem a base de pré-polímero com cura na proporção de 10 para um. Em seguida, coloque a mistura em um dessecador para desgaseificação a vácuo até que nenhuma bolha de ar seja vista.

Despeje a mistura sobre a máscara e desgaseifique novamente. Se novas bolhas de ar forem introduzidas, cure o molde em uma placa quente nivelada por duas horas a 90 graus Celsius. Depois de esfriar até a temperatura ambiente, solte suavemente o carimbo PDMS.

Assim, os canais de cultura são gravados no PDMS e prontos para a montagem do dispositivo microfluídico. O mestre é reutilizável para moldagem até que esteja rachado ou desgastado. Quando o mestre fica pegajoso, o revestimento antiaderente pode ser reaplicado.

Comece fazendo entradas e saídas no dispositivo microfluídico através do carimbo PDMS. Usando uma punção de orifício de biópsia, limpe o carimbo PDMS mergulhando-o em etanol a 70% por 30 minutos e, em seguida, enxaguando-o com água deionizada por 10 minutos. Esterilize e complete as reações de reticulação do carimbo PDMS por meio de autoclavagem.

Agora coloque o carimbo PDMS em uma lamínula de vidro revestida com poli L lisina. O dispositivo é então revestido com laminado, enchendo as câmaras com solução laminada através das entradas do reservatório e incubado durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, aspire o laminado do dispositivo.

Em seguida, lave o dispositivo inundando-o duas vezes com meio de células-tronco. Agora carregue 11 microlitros de células dissociadas em um dos reservatórios de semeadura Se necessário, use aspiração a vácuo para forçar as células a entrar na câmara. Em seguida, carregue mais sete microlitros de células no reservatório de assentos adjacente.

Após cinco minutos, os reservatórios de assentos e receptores serão inundados com mídia. Agora coloque uma folha PDMS estéril de 0.5 a um milímetro de espessura no dispositivo. A adesão natural da superfície do PDMS consigo mesmo selará o dispositivo uma vez selado, ele está pronto para transporte, incubação e imagens microscópicas.

Pré-equilibre o biot, IM executando-o por 45 minutos. Para estabilizar sua temperatura, umidade e suprimento de ar, adicione vários pratos de água à câmara de amostra para obter a umidade adequada. Carregue o dispositivo preparado na câmara de amostra do microscópio.

Centralize o dispositivo usando uma micropinça. Agora defina os pontos de posição de foco e pontos de tempo usando o software Biot e inicie as gravações de lapso de tempo, se necessário. Após cinco dias na cultura, substitua os meios de cultura.

Os BTCs semeados no dispositivo foram continuamente registrados por imagem de fase. Por cinco dias na câmara de assentos, as células fusiformes permaneceram no estágio de pré-migração. Ao se aproximarem da entrada do microcanal, algumas células se expandiram e geraram saliências adesivas.

Apenas uma célula foi capaz de ocupar a entrada e explorar a direção da migração. Uma vez que a célula determinou a direção da migração, ela passou a cruzar todo o microcanal em alta velocidade constante. No final do Microchannel, a célula começou a explorar o espaço aberto da câmara receptora antes de finalmente entrar nela.

Ao observar as células com intervalos de imagem de dois segundos, o poder migratório parecia ser gerado principalmente por atividade de tagarelice semelhante à de células OID. Ao tentar o procedimento, é importante lembrar que o design do dispositivo é tão flexível que as dimensões do microcanal podem ser manipuladas para atingir um grau desejado de migração celular. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como criar um dispositivo microfluídico de compartimentação exclusivo adequado para cultivar suas células de interesse e, em seguida, realizar imagens de lapso de tempo de longo prazo para definir qualitativa e quantitativamente as características migratórias dessas células após este procedimento.

Outros métodos, como sequenciamento de próxima geração ou microarray de DNA, podem ser aplicados para responder a perguntas adicionais, como quão geneticamente diferentes são as células cancerígenas altamente migratórias.