Name: Avaliação do Câncer de Migração Stem Cell Usando compartimentar dispositivos microfluídicos e imagens de células vivas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Aprenda a avaliar a migração de células-tronco tumorais cerebrais usando dispositivos microfluídicos compartimentalizados e imagens de células vivas. Esta técnica permite visualizar em tempo real os estágios morfológicos da migração celular.

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PAC é parcialmente financiado por uma subvenção para T32 NIH Universidade de Wisconsin Programa de Formação de Células-Tronco (PA Clark). JSK foi parcialmente financiado pela HEADRUSH Cátedra de Pesquisa do tumor cerebral, Loff Roger Memorial GBM Fundo de Investigação, e da Fundação UW / Neurocirurgia Pesquisa tumor no cérebro e Fundo de Educação. JCW e YH são parcialmente suportados pelo NIH concessão NIBIB 1R01EB009103-01.

1. BTSC célula de dissociação BTSCs são derivadas de pré-existentes culturas são crescidas em meio isento de soro de células estaminais como neuroesferas. cultura da qual é previamente descrito 10, 11. <ol><li> Preparar a suspensão de células a partir de derivados de BTSC neuroesferas. BTSC derivados neuroesferas são recolhidas num tubo de 15 ml e centrifugado a 900 rpm durante 5 minutos. Faster centrifugação lata de cisalhamento e / ou danificar as neuroesferas. O sobrenadante é aspirado e a cultura neuroesfera é ressuspenso em 0,5 ml de pré-aquecido Accutase. Esta solução é incubada durante 5-10 minutos a 37 ° C permitindo que os neuroesferas a afrouxar. As células são mecanicamente interrompidos com 10-20 movimentos suaves de uma pipeta P100 e depois 1,5 ml de meio de células estaminais é adicionado às células de neutralizar a Accutase. </li><li> Os BTSCs são então centrifugadas a 1300 rpm durante 5 minutos, e ressuspensas em 1 ml de meio de células estaminais. </li><li> Uma alíquota de 50 ul foi removida dos suspension e colocado dentro de um tubo de microcentrífuga para contagem das células. 50 ul de azul de tripano é adicionado ao tubo de Eppendorf e a suspensão é colocada num hemocitómetro para contagem das células. </li><li> Se necessário, após a contagem das células, o meio de células estaminais adicionais é adicionada à suspensão BTSC para dar uma densidade celular de 20000 células vivas / media ul. </li></ol> 2. Fabricação de bi-camadas su-8 mestre e moldagem de selo PDMS (ver figura 1) Usamos litografia óptica e de litografia suave para fabricar su-8 mestre e PDMS selo, que são essenciais para a montagem dos dispositivos microfluidicos. Ligeiramente diferente do que o processo normal de 12, a su-8 mestre é composto de duas camadas. Os microcanais 3 mícrons de altura são fundidos em que a primeira camada / inferior mais cedo no processo, enquanto as câmaras de 250 mícrons de altura de semeadura e recepção estão na segunda camada / superior. Para que a conexão correta entre dois compartimentos de cultura (microcanaiss e câmaras), as duas camadas têm de ser alinhados com precisão na sua posição. No entanto, a espessura e opacidade da segunda camada são suficientemente grandes para bloquear o alinhador fiducial / óptica de aceder aos recursos de fundo. Aqui nós desenhar as máscaras com marcadores fiduciais sendo posicionado remotamente. Assim, esses marcadores na primeira camada pode ser selectivamente protegidos durante a rotação da segunda camada. Como resultado, ambas as camadas de recursos são feitas em um mestre e pronto para a moldagem em baixo-relevo do carimbo PDMS. <ol><li> Projetar e preparar dois foto-máscaras. Uma máscara é constituída por dois marcadores fiduciais e uma matriz de microcanais (400 m de comprimento e 10-50 uM de largura) para a primeira camada. Outra máscara consiste em semear e receber as câmaras (2 mm de comprimento e 600 um de largura), para a segunda camada. Ambas as máscaras são concebidos em Illustrator (Adobe, Califórnia), laser-impresso em filmes transparentes (peças de metal finas, Colorado), lavadas com isopropanol e seco ao ar. </li><li> Fazer com que a primeira camadasu-8 fotorresiste (Microchem, Massachusetts), de acordo com o manual do produto do fornecedor. Primeiro, spin-revestimento da pastilha pega (Materiais WRS, Califórnia) com 3-um de espessura fotorresistência de su-8 (5), seguido por mole de cozimento. O fotorresiste é então ultravioleta-exposta e curada com a máscara correspondente em contacto de perto, seguido de pós-cozimento e em desenvolvimento. </li><li> Spin-revestimento da segunda camada de 250 um de espessura, com su-8 (2100). A fim de evitar fotorresiste espesso de bloquear os marcadores fiduciais da primeira camada, que cobrem estas áreas com fita adesiva em rotação antes do revestimento da segunda camada. A fita é então arrancada para revelar os marcadores para fins de alinhamento. </li><li> UV-expor a segunda camada com a segunda máscara. Com os marcadores de alinhamento revelado, é muito simples para alinhá-los para os da segunda máscara usando alinhador de máscara óptica. A segunda camada de material fotosensitivo é então exposta e ultravioleta curado em contacto próximo, seguida de pós-cozedura e em desenvolvimento. &lt;/ Li&gt; </li><li> Anti-stick revestimento do mestre resultou. Para ajudar na remoção de PDMS curado, o su-8 mestra pode ser silanizada via deposição de vapor para fazer a superfície de um revestimento antiaderente tipo. Basta colocá-lo num exsicador durante pelo menos uma hora, com várias gotas de tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctilo) solução de silano, sob vácuo. </li><li> Moldar PDMS com o mestre. Misturar base de pré-polímero de PDMS e curador de Sylgard 184 (Dow Corning, Michigan) em 10:1 completamente. Colocá-lo num exsicador para desgaseificação a vácuo até nenhuma bolha de ar é vista. Despeje a mistura sobre a máscara e desgaseificar novamente se bolha de ar novo é introduzido. Curar o molde numa placa de aquecimento para o nível de 2 horas a 90 C. Depois de arrefecer até à temperatura ambiente, gentilmente liberar o selo PDMS. Assim, a cultura de canais são gravados em PDMS e pronto para a montagem do dispositivo. O mestre é reutilizável para a moldagem até que esteja rachado ou desgastado. O revestimento anti-aderente tem de ser executado novamente quando a viscosidade retoma. </li></ol> 3.Conjunto de dispositivos microfluidicos e cultura de células (Figura 2) A fim de células de cultura, característica-gravado selo PDMS está ligado a uma lamela de vidro para formar canais fechados. Entradas e saídas são criados para carregar a cultura / media. Por outro lado, a limpeza e outros procedimentos para o substrato de vidro e carimbo PDMS são necessários para assegurar a compatibilidade celular. <ol><li> Fazer reservatórios através do selo PDMS usando biópsia furador. Nós escolher o seu diâmetro ser de 6 mm. Estes reservatórios servem para duas finalidades. Um é para conter nutrientes extra para o crescimento celular. A outra é para o acesso de pipetas de carregamento e de aspiração a vácuo. </li><li> Embeber o selo PDMS em 70% de etanol durante 30 minutos e, em seguida, lavado com água desionizada para mais 10 min. O objectivo é eliminar potenciais resíduos orgânicos introduzidos durante o processo de fabrico, e não reticulado contaminação PDMS. Mais intensas e completa processos de limpeza, tais como extração orgânica 13 14 foram usados ​​em outra parte. No entanto, achamos desnecessário na cultura BTSC. </li><li> Esteriliza-se o carimbo de PDMS usando autoclave (121 ° C, 35 min). Este passo completa a reacção de reticulação de PDMS. A partir deste passo, e até que o passo 3.6, todos os procedimentos são tomadas de uma forma estéril. </li><li> O carimbo de PDMS é então colocada sobre uma lamela de vidro, que é previamente revestidas com poli-L-lisina. 15-17 O dispositivo é então revestida com laminina, enchendo o canal com laminina solução durante a noite a 37 ° C. A laminina é aspirado a partir do dispositivo e o dispositivo é lavado com o meio de células estaminais. </li><li> Carregar suspensão de células a partir do passo 1 em reservatórios e canais. 11 ul de células dissociadas são colocados em um reservatório de semeadura. A aspiração a vácuo é utilizada para forçar as células dentro da câmara de propagação, se necessário. Um adicional de 7 uL de células são colocadas no reservatório de semeadura adjacente. Nota: densidade celular média é de 20.000 células / uL mídia. À réer cinco minutos, a semeadura e reservatórios que recebem são inundadas com a mídia. </li><li> Coloque um 0,5-1 mm pré-autoclavadas folha PDMS no topo. A adesão superficial ocorreu naturalmente entre dois pedaços de PDMS vai fazer a cultura de células selado e pronto para a incubação de transporte, e de imagem microscópica. </li></ol> 4. De longo prazo de imagem time-lapse de BTSC migração com BioStation IM (Nikon Instruments Inc, Melville, EUA). Combinando câmara, software e incubadora numa só embalagem, este sistema microscópico permite a cultura de células de imagem sem perturbação durante dias. Além disso, o seu design único motor move a lente objetiva e mantém fase estacionária na amostra o recurso de ponto-visita. Isto torna mais prática a experiências de imagem paralelas e locomoção celular em faixa de alto rendimento do ensaio. <ol><li> Pré-equilibrar a IM Biostation durante 45 minutos para estabilizar o fornecimento de humidade, temperatura e ar. Além de vários água cont-pratos ained na câmara de amostragem é utilizado para manter a humidade adequada. </li><li> Carregar o dispositivo célula-suficiente na câmara de amostra de microscópio, e centralizá-lo, usando uma pinça micro. </li><li> Ajuste o foco, a posição de pontos e tempo-pontos em software Biostation e iniciar o lapso de tempo. </li></ol> 5. Os resultados representativos: Exemplos de inspecção visual e caracterização de migração de células de cancro por meio de um dispositivo de microfluidos compartimentalizar estão ilustrados na Figura 3 e Figura 4. A linha celular é BTSC. Com a nossa configuração actual, as imagens da fase de cultura de células pode ser continuamente registadas durante o tempo de 5 dias (Figura 3) e tão frequente como a cada 2 segundos (Figura 4). Além de 5 dias, meios de cultura precisam ser substituídos para a reposição de nutrientes e resíduos removidos. Nosso longo prazo lapso de tempo identifica uma seqüência rotativa de seis estágios celulares durante sua migração com base nas alterações morfológicas. Como ilustrailustrado na Figura 3, descreve-los como (i) pré-migração, (ii) a iniciação, (iii) o caminho-exploração, (iv) de cruzeiro, (v) destino exloration-e (vi) após a migração. Na câmara receptora, células fusiformes permanecer na etapa (i) como em tumores de massa que são capazes de crescer, dividir e migrar gradualmente. Ao se aproximarem da entrada de microcanais, algumas células prosseguir para o estágio (ii) quando se expandir e gerar saliência adesiva. Apenas um deles é capaz de ocupar a entrada e proceder à etapa (iii), o qual pode explorar a direcção da migração. Uma vez que a célula determina a direcção da migração, procede-se a fase (iv), para cruzar com os microcanais em uma velocidade constante e elevada, o que é realizado através do microcanal inteiro. No final de microcanais, o produto de células de fase (v), para explorar o espaço aberto da câmara de recepção, e, em seguida, a etapa (vi). Em microcanais, poder migrar é maioritariamente gerada por blebbing actividade como ilustrado na figura 4, semelhante ao da amebóide cell. Blebbing celular e deformação membrana são totalmente gravado aqui. <img src="/files/ftp_upload/3297/3297fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Esquema de fabricação de dispositivos microfluídicos. Todo o processo é realizado sobre uma bolacha de alça de 3 polegadas de silício por meio de uma técnica modificada de litografia suave. 3 mícrons de altura microcanais e marcadores de alinhamento são feitos como na primeira camada. Em seguida, com 250 um de espessura su-8 é spin-revestido, enquanto que as marcas de alinhamento são cobertos com fita adesiva, de modo que possam mais tarde ser acessível para mascarar alinhador sem visão de bloqueio por fotorresiste espesso. Assim, as características da câmara pode ser feita como a segunda camada e precisamente alinhada com a primeira camada. Selo PDMS é eventualmente moldada fora do mestre resultante. <img src="/files/ftp_upload/3297/3297fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Esquema de montagem do dispositivo e processo de sementeira de células. Cercada por PDMS e gllamela bunda, o espaço de cultura 3D é composto de câmaras, reservatórios e microcanais. A câmara é enchida com a semeadura da cultura de células, enquanto que a câmara de recepção é inicialmente preenchido com células livres de meios de comunicação. Os microcanais que se conectam entre eles fornecer trilha de células migrando de um lado para receber a semeadura lado. <img src="/files/ftp_upload/3297/3297fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. BTSC migração através de microcanais. Superior: instantâneos de lapso de tempo mostrar uma única célula (destacado em verde) migra mais de 400 m do lado de semeadura para o lado de recepção. Toda a viagem leva cerca de 2 dias, envolvendo uma seqüência de alterações morfológicas celulares. A barra de escala é de 40 m. Abaixe: a representação dos desenhos animados de seis estágios de migração. Pré-migração (i): Na câmara de sementeira, as células fusiformes e divisível gradualmente migram ao longo uns dos outros. As células próximas raça entrada de microcanais uns com os outros, polarizando corpo celular e e xerting protrusão lamellipodia. Iniciação (ii): A célula migratória com a maior capacidade ocupa na entrada do canal, enquanto seus concorrentes vai recuar. Path-exploração (iii): As alterações das células migratórias para um modo amebóide com polaridade pouco. Este modo de migração é extremamente móvel e capaz de explorar caminho em todas as direcções por vesículas de membrana protuberâncias pequenas. Cruzando (iv): Uma vez que o percurso de migração é determinada, a célula se transforma em um modo adaptado amebóide mantendo uma saliência adicional grande posição para a frente. Desta forma, mantém uma célula de motilidade elevada, bem como uma orientação constante e velocidade. Destino-exploração (v): Ao fim de percurso, a célula diminui e desenvolve filopodias para explorar a câmara receptora para qualquer alvo invasão. Pós-migração (vi): Depois de entrar na câmara de recepção, a célula torna-se em forma de estrela e retém a motilidade elevada mas sem direcção determinada. "/&gt; . Figura 4 Instantâneos de lapso de tempo mostrar o ciclo de vesículas e membranas atividade deformação de um BTSC: (AB). iniciação; (BD). Expansão, (DF). Retração. As setas e curva-linhas representam a direção e localização da deformação da membrana, respectivamente. Os instantâneos são coletadas a cada 8 segundos.

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O dispositivo micro e gravação de imagem técnica apresentada aqui permite uma caracterização visual da morfologia celular durante a migração. Em comparação com os métodos convencionais existentes, a plataforma microfluídica apresenta vantagens de custo-eficácia, alto rendimento e flexibilidade de design. O sistema de visualização apresentado microscópico permite estudo e gravação de longo prazo a migração de células vivas. O recurso de lente motorizado faz com que seja possível controlar vários caminhos de migração de uma imagem de alta-resolução, sem perturbar a amostra. Durante a montagem do dispositivo, o carimbo de PDMS não é permanentemente ligada ao lamela de vidro para a conveniência do revestimento PDL (passo 3.4). É crítico para conseguir uma boa vedação para o sucesso deste protocolo. Contaminação introduzida a partir da fabricação do dispositivo, tais como bolhas de ar no selo ou poeiras / detritos sobre o substrato, podem pôr em risco a ligação e provocar fugas de fluido. Portanto, TREATIng do dispositivo de uma maneira livre de poeira é importante para impedir a falha do dispositivo. Antes da PDL-revestimento, as lamelas de vidro são o ácido nítrico e a solução tratada PDL é centrifugada para eliminar as poeiras / detritos. Encontramos fita adesiva, álcool lavar, e banho de água muito útil na remoção de pó / resíduos do selo PDMS, se um quarto limpo não é acessível. Após o selo PDMS fazer contato com a lamela de vidro, batendo a marca delicadamente com uma pinça facilita o selo. BTSCs podem ser enriquecidos a partir de amostras humanas sala de operação através de cultura em meio de esfera de células-tronco, similar à cultura de células estaminais neurais normais 10. BTSCs enriquecidos desta forma demonstrar estaminais célula-como propriedades, tais como a expressão de marcadores de células-tronco (CD133, nestina), a diferenciação de várias linhagens neurais (glial e neuronal), e iniciação do tumor em um modelo de ratinho imunodeficiente ortotópico com tão pouco como 100 células 18. Apesar de algum debate existe sobre purificaçãocação e manutenção de BTSCs 1, 19-21, esfera crescidos BTSCs melhor manter o fenótipo e genótipo do tumor parental 22-24. O espaço compartimentado imita o ambiente fisiológico para a migração celular. Em nosso dispositivo, BTSC exibem uma forte capacidade de migração através de um espaço de tamanho limitado, regulando morfologia celular. Nossa caracterização das alterações celulares morfológicas indica o modo de transformações em uma seqüência etapa seis que podem modelar uma nova descrição detalhada possível de invasão BTSC do cérebro adjacente. Na fase inicial, as células ganhar uma quantia significativa de polaridade e gerar saliências adesivas para ancorar-se de forma eficaz no interior do microcanal. Uma vez que a ocupação célula do microcanal é estabelecida, ele converte para um modo de cruzeiro e mantém este modo para toda a viagem através de um microcanal. Nesta fase, a motilidade BTSC manter elevado e consistente direcção mas conservar a energia. Emterestingly, parece que um microcanal é restrita a uma célula de cruzeiro de cada vez, de tal modo que, quando um produto de células únicas para esta fase, recuo células outro do microcanal. Este mecanismo garante provável eficácia de tumor espalhando e evita o consumo excessivo de nutrientes em microcanais. Depois de completar a migração através do microcanal, uma célula recupera a sua propensão para saliências multidirecionais e posterior exploração alvos de invasão ou caminhos de migração novas. O dispositivo microfluídico compartimentalizando oferece um romance in vitro significa a criação de um microambiente para estudar infiltração BTSC de parênquima cerebral. Este método pode ser facilmente adaptado para o estudo do cancro da célula tronco (CSC) e linhas de células migratórias derivadas de outros tipos de tumor. A cultura de células no dispositivo micro pode ser realizado em qualquer laboratório de biologia moderna que está equipado com uma incubadora e experiência de cultura de tecidos. Equipado com um su-8 master, PDMSfundição e montagem de dispositivos são viáveis ​​com alguma formação fundamental em litografia macia. Além disso, a plataforma pode também ser estendido para outras aplicações, integrando com outros módulos funcionais tais como misturador de gradiente, padronização de superfície, de controlo de fluido e microeléctrodo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Meio Dulbecco modificado por Eagle (DMEM), glicose elevada </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11965 </td><td> Cérebro de células-tronco de tumores (BTSC) fontes de cultura </td></tr><tr><td> F12 Ham </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 31765 </td><td> Cérebro de células-tronco de tumores (BTSC) fontes de cultura </td></tr><tr><td> B27 suplemento de vitamina A menos </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 12587-010 </td><td> Cérebro de células-tronco de tumores (BTSC) fontes de cultura </td></tr><tr><td> Antibiótico-antimicótico (PSA) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15240 </td><td> Cérebro de células-tronco de tumores (BTSC) fontes de cultura </td></tr><tr><td> Factor de Crescimento Epidérmico (EGF), recombinante humano </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> PHG0313 &lt;/ Td&gt; <td> Cérebro de células-tronco de tumores (BTSC) fontes de cultura </td></tr><tr><td> Factor de Crescimento de Fibroblastos básico (bFGF), recombinante humano </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> PHG0021 </td><td> Cérebro de células-tronco de tumores (BTSC) fontes de cultura </td></tr><tr><td> Sal de sódio de heparina, a partir de mucosa intestinal porcina </td><td> Sigma </td><td> H1027-250KU </td><td> Cérebro de células-tronco de tumores (BTSC) fontes de cultura </td></tr><tr><td> Laminina (mouse natural) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 23017-015 </td><td> Cérebro de células-tronco de tumores (BTSC) fontes de cultura </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> Millipore </td><td> SCR005 </td><td> Cérebro de células-tronco de tumores (BTSC) fontes de cultura </td></tr><tr><td> Stem meio celular </td><td></td><td></td><td><ul><li> 30% Hams F12 </li><li> 70% DMEM </li><li> 1% de antibiótico-antimicótico </li><li> 2% B27, sem vitamina A </li><li> EGF (20 ng / mL) e bFGF / heparina (20 ng/ Ml bFGF, 5 heparina mg / ml) Misture os ingredientes e filtro estéril antes do uso </li></ul></td></tr><tr><td> Factor de Crescimento de Fibroblastos básico (bFGF) / Heparina </td><td></td><td></td><td><ul><li> Concentração aliquota de 20 ug / ml </li><li> Para 25 ^ g: Adicionar 1,25 mL de heparina 5mg/mL e 25 ug bFGF. </li><li> Para 250 mg: Adicione 1 ml de heparina 5mg/mL a 250 mg bFGF. Transferência para 15 mL cónico e adicionar 11,5 mL de heparina 5 mg / mL de cónica. </li><li> Loja como 50 uL ou 250 ul de aliquotas a -80 ° C. </li></ul></td></tr><tr><td> Factor de Crescimento Epidérmico (EGF) </td><td></td><td></td><td><ul><li> Concentração aliquota de 20 ug / ml </li><li> Para 200 ug: Adicione 1 ml estéril DMEM (Gibco 11965-118) e 200 ug de EGF. Transferência para 15 mL cónico e adicionar 9 ml de DMEM. </li><li> Para 500 jig: Adicione 1 ml estéril DMEM (Gibco 11965-118) e 200 ug de EGF. Transferência para 50 mL cónico e adicionar 24 mL de DMEM. <li> Armazenar até 50 &amp; mu; L ou 250 ul de aliquotas a -80 ° C. </li></ul></td></tr><tr><td> Heparina </td><td></td><td></td><td><ul><li> Concentração alíquota de 5 mg / ml </li><li> Pesar 100 mg heparina. </li><li> Adicionam-se 100 mg de heparina a 20 ml (70%) DMEM (30%) F12-(1%), PSA (14 mL DMEM, F12 6 mL, 200 mL de PSA) </li><li> Filtro estéril </li><li> Loja como 50 uL ou 250 ul de aliquotas a -80 ° C </li></ul></td></tr><tr><td> su-8 fotorresiste </td><td> Microchem </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Silício punho </td><td> Materiais WRS </td><td> 3P01-5SSP-INV </td><td></td></tr><tr><td> tricloro-(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctilo) silano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 448931 </td><td></td></tr><tr><td> PDMS Sylgard 184 </td><td> Dow Corning </td><td></td><td></td></tr><tr><td> laminina </td><td> BD Bioscience </td><td></td><td> 50 ug /ml em tampão PBS para a concentração final </td></tr><tr><td> Biostation IM </td><td> Nikon instrumentos </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação do câncer de migração stem cell usando compartimentar dispositivos microfluídicos e imagens de células vivas

Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Using Compartmentalizing Microfluidic Devices and Live Cell Imaging

Nos últimos 40 anos, os Estados Unidos investiram mais de 200 bilhões de dólares em pesquisa de câncer, resultando em apenas uma redução de 5% na taxa de mortalidade. Um dos principais obstáculos para melhorar os resultados dos pacientes é a má compreensão dos mecanismos subjacentes à migração celular associada com metástase invasão agressiva de células de câncer, e resistência à terapêutica 1. Glioblastoma multiforme (GBM), o mais prevalente tumor cerebral maligno primário adulto 2, exemplifica esta dificuldade. Apesar padrão cirurgia, radiação e quimioterapia, a sobrevida média do paciente é de apenas 15 meses, devido à infiltração GBM agressivo no cérebro adjacente e recorrência do câncer rápida 2. As interações de mecanismos celulares aberrantes migratórias e do microambiente tumoral provável diferenciar o câncer das células normais 3. Assim, a melhoria de abordagens terapêuticas para GBM exigir uma melhor compreensão dos mecanismos de migração de células de cancro. Trabalhos recentes sugerem thata pequena subpopulação de células dentro de GBM, do cérebro de células-tronco do tumor (BTSC), podem ser responsáveis ​​pela resistência à terapêutica e de recorrência. Mecanismos subjacentes capacidade migratória BTSC estão apenas começando a ser 1,4 caracterizados. Devido a uma limitação na inspecção visual e a manipulação geométrica, os ensaios de migração convencionais 5 estão restritos a quantificar as populações de células totais. Em contraste, dispositivos microfluídicos permitir uma análise única célula por causa da compatibilidade com microscopia moderna e controle sobre micro-ambiente 6-9. Nós apresentamos um método para caracterização detalhada de BTSC migração usando compartimentar dispositivos microfluídicos. Estes dispositivos PDMS-feitas lançar o meio de cultura de tecidos em três compartimentos conectados: semeando câmara, câmara receptora e ponte microcanais. Nós adaptado o dispositivo de tal forma que ambas as câmaras segurar meios suficientes para apoiar BTSC viável para 4-5 days sem troca de mídia. BTSCs altamente móveis inicialmente introduzidos na câmara de sementeira são isolados após a migração embora bridging microcanais para a câmara de recepção paralela. Esta migração simula a propagação do cancro celular através dos espaços intersticiais do cérebro. As imagens de fase ao vivo da morfologia celular durante a migração são registrados durante vários dias. BTSC altamente migratório pode, portanto, ser isolado, recultivadas, e analisadas mais. Microfluídica compartimentar pode ser uma plataforma versátil para estudar o comportamento migratório de BTSCs e outras células-tronco cancerosas. Através da combinação de geradores de gradiente, manuseamento de fluido, micro-eléctrodos e de outros módulos microfluidicos, estes dispositivos podem também ser utilizados para o rastreio de drogas e diagnóstico da doença 6. Isolamento de uma subpopulação de células migratórias agressivo permitirão estudos de mecanismos moleculares subjacentes.

Um dispositivo de microfluidos para a investigação de compartimentalizar cancro migração de células estaminais é descrito. Esta plataforma inovadora cria um microambiente viável celular e permite a visualização microscópica de locomoção de células vivas. Altamente móveis células cancerosas são isolados para estudar os mecanismos moleculares de infiltração agressiva, levando potencialmente a terapias mais eficazes no futuro.

Avaliação do Câncer de Migração Stem Cell Usando compartimentar dispositivos microfluídicos e imagens de células vivas

Nos últimos 40 anos, os Estados Unidos investiram mais de 200 bilhões de dólares em pesquisa sobre o câncer, resultando em uma redução de apenas 5% na taxa de mortalidade. Um principal...

O objetivo geral deste procedimento é inspecionar e caracterizar visualmente a migração de células cancerígenas por meio de um dispositivo microfluídico compartimentalizado. Isso é realizado primeiramente dissociando neuroesferas pré-existentes de células-tronco tumorais cerebrais cultivadas em meio livre de soro. O segundo passo é fabricar um molde mestre de SU-8 em camada dupla e utilizar um carimbo de PDMS por litografia suave com um desenho compartimentalizado.Em seguida, monte o dispositivo microfluídico e carregue-o com células-tronco de tumor cerebral. Por fim, a aquisição de imagens de longo prazo em lapso de tempo da migração de células-tronco de tumor cerebral é realizada utilizando um sistema microscópico integrado. Em última análise, os resultados mostram que as células-tronco de tumor cerebral exibem uma sequência contínua de estágios morfológicos durante sua migração por espaços ultraconfinados.A principal vantagem dessa técnica em relação a métodos existentes, como a câmara Transwell Boyton, é que o microdispositivo permite a inspeção visual do processo de migração, o posicionamento controlado de células e a entrega precisa de fatores. Portanto, a tecnologia microforça possui características de seleção e navegação celular única confiável, eficiente e com custo-benefício. As implicações dessa técnica estendem-se para a terapia de metástase e recorrência do câncer, pois a análise de células individuais altamente migratórias pode identificar potenciais alvos futuros para quimioterapia.Embora este método possa fornecer informações sobre o comportamento migratório de sistemas cancerígenos, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como desenvolvimento embrionário, respostas imunes, cicatrização de feridas e regeneração de órgãos. Iniciando com a suspensão celular de neuroesferas derivadas de BTSC. Reúna as células em um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugue-as a 900 RPM por cinco minutos, mas não mais rápido que isso.Aspire o sobrenadante. Em seguida, permita que os neuroesferoides se soltem incubando-os em 0,5 mililitros de Accutase pré-aquecido por cinco a 10 minutos a 37 graus Celsius. Após a incubação, rompa mecanicamente as células com 10 a 20 movimentos suaves de uma pipeta P100.Em seguida, adicione 1,5 mililitros de meio de células-tronco para neutralizar a centrifugação com Accutase, centrifugue a suspensão celular a 1300 RPM durante cinco minutos e re-suspenda as células em um mililitro de meio de células-tronco. Verifique a densidade celular com um hemocitômetro e ajuste a densidade para 20.000 células por microlitro. Para iniciar a fabricação do molde mestre SU-8, prepare duas máscaras fotolitográficas utilizando o Adobe Illustrator e filme transparente impresso a laser com Image Setter incorporado.A máscara fotográfica da primeira camada consiste em dois marcadores fiduciais e uma matriz de microcanais, e a segunda camada da máscara fotográfica possui as câmaras de acomodação e recepção. Limpe ambas as camadas da máscara com isopropanol e deixe secar ao ar. Em seguida, aplique por centrifugação um wafer de suporte com uma camada de 3 µm de espessura de resistência fotográfica SU-8, seguida de pré-assamento.Em seguida, com a primeira máscara fotolitográfica em contato próximo com luz UV, exponha a foto, resista e deixe curar. Depois, faça a pós-cozimento e desenvolva a pastilha curada. Cubra as áreas dos marcadores de referência da pastilha de manuseio com fita adesiva transparente.Em seguida, aplique o fotoresiste de 250 mícrons de espessura sobre a pastilha por meio de spin coating. Depois, remova a fita para expor os marcadores destinados ao alinhamento. Aplique a segunda camada de fotoresiste e alinhe os marcadores fiduciais.Em seguida, exponha à UV e cure a máscara fotolitográfica da segunda camada, seguido de pré-assamento e revelação. Agora, silanize o molde de SU-8 por deposição em fase vapor para reduzir a aderência superficial. Coloque as pastilhas em um dessecador com várias gotas de solução de triclorosilano sob vácuo por pelo menos uma hora.O molde mestre estará então pronto para uso na moldagem de PDMS. Comece misturando completamente a base do pré-polímero com o agente de cura numa proporção de 10 para 1. Em seguida, coloque a mistura em um dessecador para desgaseificação a vácuo até que nenhuma bolha de ar seja visível.Despeje a mistura sobre a máscara e desgaseifique novamente. Se novas bolhas de ar forem introduzidas, cure o molde em uma placa aquecedora nivelada por duas horas a 90 graus Celsius. Após esfriar até a temperatura ambiente, remova cuidadosamente o carimbo de PDMS.Assim, os canais de cultivo são gravados em PDMS e estão prontos para a montagem do dispositivo microfluídico. O molde mestre pode ser reutilizado para moldagem até que se quebre ou desgaste. Quando o molde mestre ficar pegajoso, o revestimento antiaderente pode ser reaplicado.Inicie criando entradas e saídas no dispositivo microfluídico através do carimbo de PDMS. Usando uma punção de biópsia, limpe o carimbo de PDMS mergulhando-o em etanol 70% por 30 minutos e, em seguida, enxaguando-o com água desionizada por 10 minutos. Esterilize e complete as reações de reticulação do carimbo de PDMS por autoclavagem.Agora, coloque o carimbo de PDMS sobre uma lamínula de vidro revestida com poli-L-lisina. Em seguida, o dispositivo é revestido com laminina preenchendo as câmaras com solução de laminina por meio das entradas dos reservatórios e incubado durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, aspire a laminina do dispositivo.Em seguida, lave o dispositivo inundando-o duas vezes com meio de células-tronco. Agora, carregue 11 microlitros de células dissociadas em um dos reservatórios de semeadura. Se necessário, use aspiração a vácuo para forçar as células para dentro da câmara. Em seguida, carregue mais sete microlitros de células no reservatório de acomodação adjacente.Após cinco minutos, os reservatórios de assentamento e recepção estarão cheios de meio. Agora, coloque uma folha estéril de PDMS com espessura de 0,5 a um milímetro sobre o dispositivo. A adesão superficial natural do PDMS a si mesmo selará o dispositivo; uma vez selado, ele estará pronto para transporte, incubação e imageamento microscópico.Pré-equilibre o biot, IM, operando-o durante 45 minutos. Para estabilizar sua temperatura, umidade e suprimento de ar, adicione várias placas com água à câmara de amostra para obter a umidade adequada. Carregue o dispositivo preparado na câmara de amostra do microscópio.Centralize o dispositivo usando pin&ccedil;as microsc&oacute;picas. Agora defina os pontos de foco e os pontos de tempo usando o software Biot e inicie as grava&ccedil;&otilde;es com lapso de tempo, se necess&aacute;rio. Ap&oacute;s cinco dias em cultura, substitua o meio de cultura.Os BTCs semeados no dispositivo foram continuamente registrados por imagem de contraste de fase. Durante cinco dias na câmara de assentamento, células em forma de fuso permaneceram na fase pré-migração. À medida que se aproximavam da entrada do microcanal, algumas células se expandiram e geraram protrusões adesivas.Apenas uma célula conseguiu ocupar a entrada e explorar a direção da migração. Uma vez que a célula determinou a direção da migração, prosseguiu percorrendo todo o microcanal em alta velocidade constante. Ao final do microcanal, a célula passou a explorar o espaço aberto da câmara receptora antes de finalmente ingressar nela.Ao observar as células com intervalos de imagem de dois segundos, a potência migratória pareceu ser gerada principalmente por atividade de borbulhamento, semelhante à de células OID. Ao realizar o procedimento, é importante lembrar que o design do dispositivo é tão flexível que as dimensões dos microcanais podem ser manipuladas para alcançar um grau desejado de migração celular. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como criar um dispositivo microfluídico compartimentalizado exclusivo, adequado para o cultivo de suas células de interesse, e então realizar imagens de lapso de tempo de longo prazo para definir qualitativa e quantitativamente as características migratórias dessas células seguindo este procedimento.Outros métodos, como o sequenciamento de nova geração ou microarranjos de DNA, podem ser aplicados para responder perguntas adicionais, como quão geneticamente diferentes são as células cancerígenas altamente migratórias.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Nós demonstramos que a expressão de receptores de mais de fator de crescimento epidérmico (EGFR) aumenta a motilidade das células-tronco neurais (NSCs) usando um romance agarose gel com base em dispositivo microfluídicos. Esta tecnologia pode ser facilmente adaptável a outros sistemas de células de mamíferos, onde fontes de células são escassos, como células-tronco neurais, ea volta em torno do tempo é crítica.

Avaliar motilidade celular Neural Stem Usando um dispositivo Agarose Gel baseado microfluídicos

Neste vídeo, realizamos um ensaio de migração de células-tronco tumorais cerebrais para analisar o efeito da droga de interesse na migração de células-tronco tumorais cerebrais vivas usando placa de migração de quimiotaxia. A imagem de células vivas facilita a visualização e quantificação da migração celular durante o ensaio.

Ensaio de migração de células-tronco tumorais cerebrais (BTSC) para estudos de tratamento medicamentoso: uma técnica de imagem de células vivas in vitro para analisar o efeito do tratamento medicamentoso na migração de BTSCs

Um método quantitativo para estudar a migração espontânea de células em um microambiente confinado unidimensional é descrito. Este método tira vantagem de canais microfabricados e pode ser utilizado para estudar a migração de grande número de células em condições diferentes nas experiências individuais.

Estudo da migração celular em Canais microfabricados

Este protocolo detalha um método personalizada para medir a migração celular em resposta a quimioatractores, que também podem ser utilizados para determinar a taxa de difusão de um fármaco a partir de uma matriz de polímero.

A Câmara customizáveis ​​para a migração celular de medição

Este estudo relata dois métodos diferentes para a análise de migração e invasão celular: o ensaio de câmara Boyden e em vitro vídeo baseado em microscópio cicatrização ensaio. São descritos os protocolos para estes dois experimentos, e suas vantagens e desvantagens são comparadas.

Avaliação do processo de migração e invasão celular: uma comparação da risque baseado no microscópio a ferida do ensaio e o ensaio de câmara Boyden

Aqui, descrevemos técnicas de imagem ao vivo-celular para medir quantitativamente a migração e invasão de células-tronco tumor glioblastoma cerebral ao longo do tempo e sob várias condições de tratamento.

Imagem latente da viver-pilha ensaios de migração de células-tronco do estudo Glioblastoma cerebral Tumor e invasão

Uma placa de imagem baseada em HMCA é apresentada para o desempenho do ensaio de invasão. Este prato facilita a formação de esferoides tridimensional (3D) tumor e a medição da invasão de células de câncer na matriz extracelular (ECM). A quantificação de ensaio de invasão é conseguida análise semiautomático.

Análise de invasão de células de câncer e usando a matriz de hidrogel Microcâmara (HMCA) de despistagem de drogas antimetastática-baseado placas

O atual protocolo descreve um método integrado, investigando a migração de células de câncer e invasão em uma única plataforma em tempo real, fornecendo uma opção facilmente reproduzível e tempo-eficiente para estudar a morfologia e mobilidade celular.

Um fluxo de trabalho simples migração/invasão usando um automatizado Imager viver-pilha

Aqui, apresentamos um protocolo para preparar e esculpir uma barreira cerebral sanguínea microambienta tumoral metastático e, em seguida, quantificar seu estado usando imagens confocal e inteligência artificial (machine learning).

Quantificando o microambique do tumor metastático cerebral usando um modelo 3D de chip de órgão, aprendizado de máquina e tomografia confocal

Na era da imunoterapia e do perfil genômico de célula única, a biologia do câncer requer novas ferramentas in vitro e computacionais para investigar a interface tumor-imune em um contexto espaço-temporal adequado. Descrevemos protocolos para explorar co-culturas microfluídicas imunes a tumores em cenários 2D e 3D, compatíveis com monitoramento dinâmico e multiparamétrico de funções celulares.

Modelos de Co-Cultura Microfluídica para Dissecar a Resposta Imune em Microambientes Tumorais in vitro

Aprenda a avaliar a migração de células-tronco tumorais cerebrais usando dispositivos microfluídicos compartimentalizados e imagens de células vivas. Esta técnica permite visualizar em tempo real os estágios morfológicos da migração celular.

Avaliação do Câncer de Migração Stem Cell Usando compartimentar dispositivos microfluídicos e imagens de células vivas

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