Name: Síntese em fase sólida Submonomer de Polímeros Peptoid e seus Automontagem em altamente ordenada nanofolhas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 42 s
Description: Aprenda a síntese em fase sólida de peptoides pelo método submonômero e sua automontagem em nanofolhas ordenadas. Este protocolo acessível permite criar materiais biomiméticos para nanociência e biomedicina.

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Os autores gostariam de agradecer Byoung-Chul Lee, Philip Choi e Samuel Ho para a assistência valiosa. Este trabalho foi realizado na Fundição Molecular do Lawrence Berkeley National Laboratory, que é apoiado pelo Escritório de Escritório Science, de ciências básicas da energia, do Departamento de Energia dos EUA no âmbito do contrato n º DE-AC02-05CH11231 e Redução de Ameaça de Defesa Agência nos termos do Contrato n º: IACRO-B0845281.

1. Solid-Phase Synthesis Submonomer de Polypeptoids Síntese em fase sólida (SPS) é uma técnica comum usada para sintetizar sequências específicas de biopolímeros passo a passo, diretamente sobre um suporte sólido inerte, tal como uma resina polimérica talão. Altos rendimentos de acoplamento e facilidade de remoção dos reagentes em excesso são grandes vantagens da SPS. Depois de uma reação de acoplamento à resina, reagentes em excesso são simplesmente drenado e as contas são lavadas para estar pronto para a fase seguinte da reacção. Após a reação de síntese final, os oligômeros de longa-metragem são clivadas a partir da resina eo material solução de fase pode ser mais bem estudadas. Aqui, adaptar o procedimento SPS para gerar polímeros seqüência específica peptoid. <ol><li> Setup: Todas as etapas da síntese peptoid manual pode ser realizada em um de polipropileno, descartáveis ​​(PP) cartucho poroso ou um vaso de reação fritted de vidro equipado com uma torneira de 3 vias. Realizar todas as operações em uma capela. Para as incubações na gnavio lass ou cartucho plástico, conectar um braço a uma fonte de nitrogênio para gentilmente bolha a solução para a mistura correta. Alternativamente, para incubações reação no cartucho descartável, selo ambas as extremidades do cartucho com tampas e coloque em um agitador rotativo. Para drenar misturas de reacção ou lavagens, ligue para a casa de vácuo através de um sifão. O navio deve ser poroso com uma frita grosseira. Siliconize o reactor de vidro para evitar contas de degola para as paredes do recipiente de vidro. Prepare uma solução de 5% em dichlorodimethylsilane dicloroetano (v / v). Encher um recipiente de reação limpa e seca para a parte superior com solução siliconização, deixe descansar por 30 minutos, depois escorra. Lavar o vaso uma vez com DCE e depois uma vez com metanol. A solução siliconização pode ser reutilizado, por isso deve ser salvo. Ou ar seco ou sacudir qualquer excesso de solução e asse o vidro até secar após a remoção da torneira. Vaso de reação esfriar antes de adicionar resina. </li><li> Adicionar 100 mg (0,06 mmol) de re amida Rinkpecado a um recipiente de reação fritted. Swell a resina, adicionando 2 mL de dimetilformamida (DMF). Agitar, por agitação ou borbulhamento por 10 minutos. Escorra a solução de vácuo para isolar a resina incharam. </li><li> Adicionar 1 mL de 20% 4-methylpiperidine em DMF (v / v) para desproteger o grupo Fmoc. Agitar por 2 minutos e escorra. Repita com uma incubação de 12 minutos. </li><li> Enxágüe da resina adicionando 2 mL de DMF, agitando por 15 segundos, e drenagem. 3x. </li><li> Bromoacetylation: Adicionar 1 mL de 0,6 M bromoacetic ácido (0,6 mmol) em DMF e 86 mL de N, N'-diisopropylcarbodiimide (0,93 equivalente, 0,56 mmol). Incube com borbulhar suave durante 30 minutos, depois escorra e lave com 2 mL de DMF (repita 4x). </li><li> Deslocamento: Adicionar 1 mL de 1-2 M de amina na N-methylpyrrolidinone. Incube com borbulhando para 30-120 minutos, depois escorra e lave com DMF (2 mL 4x). </li><li> Continuar a crescer a cadeia peptoid, repetindo o ciclo submonomer, passos 1.5 (bromoacetylation) e 1.6 (displacement). </li></ol><ol start="8"><li> Após o deslocamento final é feito, lavar com 2 mL de DMF (repeat 4x), em seguida, 2 mL de diclorometano (3x). Cap e armazenar o reactor até clivagem. </li><li> Pausa na síntese (opcional): Para fazer uma pausa durante uma síntese peptoid, terminar a reação de deslocamento e avance para o passo 1.8. Para continuar crescendo a cadeia peptoid, reinicie a síntese de re-inchaço da resina seca (passo 1.2) e repetindo o ciclo submonomer (passo 1.5 e 1.6). A resina pode ser secos e armazenados após qualquer deslocamento, exceto o deslocamento segundo porque o conjugado de resina peptoid-pode formar um produto cíclico diketopiperazine lado. </li><li> Para várias sínteses simultâneas, uma em fase sólida colector de vácuo extração é recomendada para maximizar a eficiência. Síntese Peptoid também pode ser automatizada por métodos de programação propriamente nos sintetizadores peptídeo disponíveis comercialmente, como a Apex Aapptec 396, sintetizador de microondas CEM Liberdade e Techno Proteinlogias sintetizador Prelude Inc.. </li></ol> 2. Clivagem e Side-Chain desproteção <ol><li> Transferir todas as resinas secas em um frasco de vidro de cintilação 20 mL. </li><li> Trabalhando dentro de um capuz e com equipamentos de protecção individual adequado, adicionar 4 mL de ácido trifluoroacético (TFA) cocktail de clivagem 1 (por exemplo, 95% aq. TFA, ver discussão) para o frasco de vidro de cintilação e tampa. Agitar durante 10 minutos a 2 horas à temperatura ambiente (ver discussão). </li><li> Coletar a solução de clivagem TFA, filtrando a resina através de um descartáveis, cartucho PP fritted em um novo, 20 mL frasco de vidro pré-pesados ​​de cintilação. A descartáveis, PP pipeta é conveniente para transferir as soluções cocktail de clivagem. </li><li> Adicionar 1 mL de coquetel de clivagem doce para lavar a resina e recolher qualquer peptoid residual. 2x. </li><li> Evaporar TFA soprando um fluxo suave de nitrogênio ou usando um Biotage V10 evaporador. </li><li> Redissolver o petróleo bruto em 6 mLde acetonitrila / água 1:1 (v / v) para HPLC. Congelar e lyophilize. Repetir. </li><li> Registre o peso do produto cru. Store como um pó seco a -20 ° C </li><li> Clivagem de teste (opcional): A clivagem de teste em 0,5% da resina pode ser realizada para determinar rapidamente a pureza ea massa do peptoid sintetizado e se as condições corretas de clivagem foram escolhidos. Clivagens teste são especialmente úteis para monitorar o progresso da síntese. </li></ol> 3. Caracterização e Purificação da Polypeptoid <ol><li> Através de uma combinação de análise HPLC, electrospray LC-MS, e / ou MALDI-TOF, determinar a pureza do produto bruto e se o peso molecular desejado está presente. </li><li> Prepare uma solução ~ mg / mL 50-10 do pó seco peptoid em água com acetonitrila mínimo, conforme necessário para a solubilidade. Solução clara filtro do produto peptoid bruto com 0,45 mM filtro de seringa para remover a poeira e partículas. </li><li> Analítica HPLC e electrospray LC-MS: Prepare a ~ 20 mg / mL solução peptoid bruto. Filtro com um 200 mL 0,45 mM filtro e injectar 20 mL. </li><li> MALDI: Misture 1 mL de ~ 20 peptoid mg / mL com 1 mL da matriz. Spot 1 mL na placa MALDI e deixar secar ao ar. Matriz e modo de aquisição está dependente da amostra (Fig. 5). </li><li> Purificar a mistura de crude peptoid com fase reversa HPLC prep. Escolha o gradiente e coluna (C4 ou C18) com base na hidrofobicidade de polypeptoid. Combine frações purificadas, congelar e lyophilize, resultando em um pó branco macio. Registre o peso do produto final. </li><li> Formação de HCl sal (opcional): Recolher o pó liofilizado em 100 mM HCl (aq.), com acetonitrila mínimo. Transferência para pré-pesados ​​frasco de vidro. Congelar e re-lyophilize. 2x. Nova pesagem para determinar a massa de pó peptoid. </li></ol> 4. Formação Nanosheet Peptoid Esta seção describes o protocolo para formar folhas de uma única cadeia, seqüência específica, anfifílicos 36-mer peptoid (Fig. 1). Após a vertente peptoid é sintetizado, purificado e liofilizado, como descrito acima, o pó resultante branco é dissolvido em DMSO para fazer uma solução estoque 2 mM. <ol><li> Prepare 500 mL de solução 20 mM peptoid (10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 8,0 em água) num frasco de vidro um dram. Tampão na formação da folha Primeiro, adicione 445 mL de água Milli-Q, 50 mL de tampão 10x folha de formação, e vortex para misturar. Em seguida, adicionar 5 mL de solução estoque 2 mM peptoid e gentilmente solução redemoinho. Tampe o frasco de vidro. </li><li> Folhas são formadas pela agitação suave da solução aquosa diluída peptoid. Lentamente inclinar o frasco de vidro da posição horizontal para a posição vertical resultados em folhas. Suave agitação também produz folhas, no entanto, as folhas tendem a ser menores e com menos arestas retas. Uma análise mais aprofundada do mecanismo de formação da folha é reported separadamente. 2 </li><li> Para muitos de alta qualidade folhas, gire os frascos de vidro sobre o eixo horizontal lentamente (&lt;RPM 1) para um a três dias. Uma meios técnicos RKVSD Rotamix rotador tubo ou um roqueiro personalizado pode executar esta continuamente. </li><li> Diálise de nanofolhas (opcional): Em certas aplicações, pode ser necessário para remover qualquer cadeias livre peptoid ou buffers / sais. Molhe um Float-a-Lyzer 100 kD membrana no buffer desejado por 15 minutos. Carga 500 mL de solução folha peptoid na câmara de amostra. Mergulhe em 500 mL de tampão desejado, mexendo com uma barra de agitação magnética a 60 rpm. Permitir a diálise de folhas para prosseguir por 4 horas. Cada hora de troca, com um estoque fresco de uma solução tampão. </li></ol> 5. Microscopia de fluorescência de nanofolhas <ol><li> Imagens de fluorescência das nanofolhas foram fotografadas com Nile Red, um corante ambientalmente sensíveis, cuja intensidade de fluorescência aumenta quando ela está localizada em hydrophobic ambientes (Fig. 2). </li><li> Adicionar 1 mL de 100 M Nile Red para 100 mL da solução nanosheet para obter uma concentração final de 1 mM de Nilo Vermelho. </li><li> Faça uma solução de agarose 1% em água quente e despeje em uma placa de Petri de plástico. Garantir que a solução de agarose é de aproximadamente 1 / 8 de polegada de espessura e deixe a solução esfriar em repouso sobre uma superfície plana. Após os conjuntos de agarose, use uma espátula para cortar e transferir 1 cm x 1 cm e praças uma lâmina de vidro. </li><li> Para coletar as folhas no mesmo plano, spot 1 mL de solução de folha no pedaço de agarose. Permitir que a agarose para absorver o tampão por 2 minutos, deixando as folhas na superfície. Imagem dentro de 15 minutos, caso contrário o agarose começará a deformar-se devido à desidratação. </li><li> Às folhas de imagem em solução, 15 mL de carga dentro de uma junta de 20 milímetros 0,12 mm de diâmetro sobre uma lâmina de vidro. Cobrir com uma lamela. Se as folhas são simplesmente imprensado entre uma lâmina de vidro e lamínula sem uma junta, muitas folhas will cisalhamento ea evaporação aparentemente menor fará com que as folhas que constantemente se mover. </li><li> Folhas de imagem sob iluminação de epifluorescência (Olympus IX81 por exemplo, um microscópio invertido equipado com um iXonEM Andor + espectros EMCCD com um vermelho Texas filtro). </li></ol> 6. Microscopia eletrônica de varredura (MEV) de nanofolhas <ol><li> Plasma etch de substrato de silicone (opcional): O chips de silício são gravadas plasma para auxiliar na adsorção de folhas. Colocar os chips de silício na câmara de vácuo de um aspirador de plasma (por exemplo Harrick Plasma Cleaner / Esterilizador PDC-32G). Bomba de até 200 mTorr e definir a bobina de RF para 18W (alta definição para PDC-32G). Etch por 2 minutos. </li><li> Queda de 20 mL de solução de folha de peptoid sobre um substrato de silício plasma tratado. Deixe descansar por 3 minutos. Retire o excesso de solução com a ponta do Kim-wipe. Pipeta mL 20 de água sobre a superfície e remover o excesso de solução novamente para remover tampão e sais. Repita 4x. </li><li> Alternativamente, disqueyze as soluções folha peptoid contra água para retirar tampão eo sal. Queda de 20 mL de solução de folha de dialisado de plasma em substratos tratados com silício. O ar seco da amostra. </li><li> Folhas de imagem com SEM (por exemplo Zeiss Gémeos Ultra-55 Microscópio Eletrônico de Varredura Analítica) com um detector na lente e no feixe de energias entre 1 kV e 5 kV (Fig. 3). </li></ol> 7. Notas de Segurança: <ol><li> Dimetilformamida e diclorometano são razoavelmente suspeitos carcinógenos. </li><li> N, N'-Diisopropylcarbodiimide, 4-methylpiperdine e ácido bromoacetic são perigosos para a pele, olhos e trato respiratório. Eles devem ser usados ​​na capa com cuidado. Pode ser tóxico se inalado ou absorvido através da pele, ea exposição pode resultar em sensibilização. Recipientes vazios retêm resíduos do produto (líquido / vapor) e devem ser cuidadosamente lavados antes de removê-los do capô. </li><li> TFA é um ácido forte, e é extremamente destrutivo para o trato respiratório superior, olhos epele. TFA também é volátil-keep soluções concentradas de TFA na capa em todos os momentos, para evitar danos respiratórios. Utilizar EPI adequado e cuidado ao manusear soluções de TFA. Luvas de mudar rapidamente se eles entram em contato com TFA, e imediatamente limpar todos os derramamentos. </li></ol> 8. Resultados representativos: Esta seção descreve a síntese, caracterização e purificação de uma seqüência específica de cadeia peptoid 36-mer que se dobra em um nanosheet altamente ordenada 3 (Fig. 1). O bloco de carga peptoid H-[Nae-NPE] 9 - [NPE-nce] 9-NH 2 foi sintetizado em 100 mg de resina amida Rink. A 2 M de solução de amina foi usado para todas as reações de deslocamento, que foram realizadas por 60 minutos para o resíduo de 18/01 e 120 minutos para o resíduo 19-36. t-butil beta-alanina HCl foi convertido para a base livre (ver discussão), enquanto feniletilamina e boc-etilenodiamina foram ambos usados ​​directly. A resina foi clivado com TFA 95%, triispropylsilane 2,5%, 2,5% de água por 2 horas. TFA foi evaporado eo óleo viscoso resultante (~ 180 mg) foi re-dissolvido em 6 mL de acetonitrila: água 1:1 (v / v). Pureza do produto (Fig. 4) e presença da massa do produto foi confirmada por análise de RP-HPLC (30-80% em acetonitrila gradiente de água, ambos contendo 0,1% (v / v) TFA, em 1 mL / min, durante 30 minutos a 60 ° C com um C18, 5 mm, 50 X coluna mm 2) e MALDI (Fig. 5). Purificação com fase reversa HPLC em uma coluna C18 Vydac (10 mM, 22 mm x 250 mm) procedeu, utilizando um gradiente de 30-60% de acetonitrila em água com TFA 0,1% mais de 60 minutos a 10 mL / min. A coluna foi carregada com 60 mg de produto bruto para cada corrida cromatográfica. As frações purificadas foram combinadas com base na pureza da RP-HPLC analítico (Fig. 4) e liofilizados para produzir ~ 80 mg de um pó branco macio. Purificada peptoid bloco carga molecularde peso foi confirmado por MALDI. 1 mL de 100 M purificada peptoid em acetonitrila: água 1:1 (v / v) foi misturada com 1 mL da matriz (5 mg / mL de ácido α-ciano-4-hidroxicinâmicos em acetonitrila: água 1:1 v / v e 0,1% TFA) e 1 mL foi visto na placa de MALDI. Após a amostra seca ao ar, foi colocado no 4800 MALDI Applied Biosystem / MDS SCIEX Analyzer TOF / TOF. Os modos de aquisição e processamento foram de baixa massa linear. O peso calculado foi inserido na massa direcionados para ajustar automaticamente para o tempo de atraso. A intensidade do laser foi definido para 3400. A massa observada, 4981,2, corresponde intimamente à massa calculada de 4981,74. O pó liofilizado purificado foi dissolvido em DMSO para fazer uma solução estoque 2 mM, o que pode ser armazenado a 4 ° C. Folhas foram preparados pelo protocolo referido e fotografada com microscopia óptica de fluorescência e SEM (Fig. 2 e 3). Uma variedade de formas com tamanhos recurso que variam até 300 mm, são observados, e notably, bordas retas são proeminentes. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3373/3373fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 Seqüência do bloco de carga peptoid H-[Nae-NPE] 9 -. [NPE-nce] 9-NH 2. A única cadeia, taxa de bloco, polypeptoid anfifílicos 36-mer auto-montagem em altamente ordenado, bidimensional nanofolhas 3. O peso molecular é calculada 4.981,74. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3373/3373fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Imagens de microscopia de fluorescência nanofolhas peptoid. Folhas foram formadas a partir de uma solução de 20 mM peptoid em 10 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8,0. As folhas foram fotografadas em agarose com 1 Hm Nilo Vermelho. Barras de escala são 100 mm. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3373/3373fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Digitalizando imagens de microscopia eletrônicade nanofolhas peptoid. Folhas foram formadas a partir de uma solução de 20 mM peptoid em 10 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8,0. Barras de escala são 5 mm. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3373/3373fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4"> Figura 4 inverter fase analítica HPLC traço de H-[Nae-NPE] 9 -. [Nce-NPE] 9-NH 2. O petróleo bruto e purificado analítica HPLC trace (30-80% no gradiente 1 mL / min, durante 30 minutos a 60 ° C com um C18, 5 mm, 50 x coluna mm 2) do bloco bruto e purificado carga peptoid H-[ Nae-NPE] 9 - [NPE-nce] 9-NH 2 é mostrado. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3373/3373fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 5"> Figura 5 MALDI-TOF espectroscopia de massa traço de H-[Nae-NPE] 9 -. [Nce-NPE] 9-NH 2. A massa observada, 4981,2, está em estreita concordância com a massa calculada, 4981,74.

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<li>Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+nanomolar+ligands+for+7-transmembrane+G-protein+coupled+receptors+from+a+diverse+%28N-substituted%29glycine+peptoid+Library%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Discovery of nanomolar ligands for 7-transmembrane G-protein coupled receptors from a diverse (N-substituted)glycine peptoid Library.</a> J. Med. Chem. 37, 2678-2685 (1994).</li>
<li>Alluri, P., Liu, B., Yu, P., Xiao, X., Kodadek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+coactivator-binding+peptoids+from+a+combinatorial+library%5BTitle%5D)+AND+%22Moleular+Biosystems%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of coactivator-binding peptoids from a combinatorial library.</a> Moleular Biosystems. 2, 568-579 (2006).</li>
<li>Figliozzi, G. M., Goldsmith, R., Ng, S., Banville, S. C., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+N-%28substituted%29glycine+peptoid+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Synthesis of N-(substituted)glycine peptoid libraries.</a> Methods Enzymol. 267, 437-447 (1996).</li>
<li>Culf, A. S., Ouellette, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+synthesis+of+N-substituted+glycine+oligomers+%28%26alpha%3B+peptoids%29+and+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Solid-phase synthesis of N-substituted glycine oligomers (&alpha; peptoids) and derivatives.</a> Molecules. 15, 5282-5335 (2010).</li>
<li>Burkoth, T. S., Fafarman, A. T., Charych, D. H., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+unprotected+heterocyclic+side+chains+into+peptoid+oligomers+via+solid-phase+submonomer+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Incorporation of unprotected heterocyclic side chains into peptoid oligomers via solid-phase submonomer synthesis.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 8841-8845 (2003).</li>
</ol>

Não temos nada a revelar.

Aplicações e Significado Este protocolo descreve um método simples e eficiente de síntese peptoid eo aquosa auto-montagem do Peptóides em nanofolhas. A maioria dos laboratórios são facilmente capazes de sintetizar Peptóides porque os materiais de baixo custo, conhecimentos básicos e técnicas simples são utilizados 4. Da mesma forma, a auto-montagem de ultra-fina e altamente ordenada nanofolhas se limita a exigir repetidas frasco uma inclinação de uma solução aquosa diluída peptoid 2. Peptóides são promissores materiais para a pesquisa biomédica e nanociência, porque eles são robustos e flexíveis ainda sinteticamente seqüência específica e altamente sintonizável 5. Peptóides demonstraram atividade biológica (6,7 terapêutica, diagnóstico 8, a entrega intracelular 9-10) e dobra em nanoestruturas hierárquico 3, 11-14. Por causa de sua síntese modular, combinatória peptoid librAries 15-19 pode ser facilmente sintetizados e testados para uma ampla série de atividades ou propriedades. Em particular, o nanofolhas servir como uma plataforma potencial para andaimes bidimensional de exibição, miméticos de membrana, sensores biológicos, miméticos de proteínas e fabricação de dispositivos. Com as seqüências praticamente inesgotável diferentes possíveis, o campo da pesquisa peptoid está expandindo rapidamente. Variáveis ​​em fase sólida síntese submonomer de polypeptoids Por causa da possibilidade de escolher entre um alfabeto incrivelmente grande e diversificada de monômeros de 20, o método submonomer precisa de modificações pontuais para casos em que o aumento da eficiência de acoplamento de cada etapa irá melhorar o rendimento global do produto. Incorporação de cadeias laterais desprotegidas heterocíclicos requer o uso de ácido cloroacético em vez de ácido bromoacetic 21. Maior tempo de deslocamento e maiorconcentrações de amina são geralmente empregadas após cerca de 20 engates para longas sequências peptoid ou aminas menos nucleofílico. Aquecimento do recipiente de reação a 35 ° C, usando um recipiente de reação de jaqueta de água, ajuda a conduzir a reação. Para altamente voláteis como aminas isopropilamina, cuidados devem ser tomados para evitar a evaporação. Aminas na forma de um sal de HCl, como HCl beta-alanina t-butil, precisa ser livre baseado antes de ser introduzido na reação de deslocamento. Isto pode ser conseguido através da dissolução ou suspensão do amina em DCM (~ 5g amine/25 mL DCM), e neutralizar com uma solução equimolar de hidróxido de sódio aquoso em um funil de separação. A camada DCM é coletado ea camada aquosa é lavado com DCM adicionais. As camadas DCM combinados são secas sobre sulfato de sódio e filtrada para um balão de fundo pré-pesados ​​rodada. Remover solvente por evaporação rotativa para produzir um óleo, e registrar o peso do produto. During passo a clivagem, TFA cocktail de clivagem e tempo de clivagem é dependente do número e variedade de grupos protetores utilizados. Diretrizes para cocktails de clivagem são semelhantes aos tradicionais clivagens peptídeo desproteção 1. Geralmente, 10 minutos incubações são necessários para seqüências sem proteger grupos ou seqüências com poucos altamente ácido lábil grupos de proteção (por exemplo, BOC, por tritila). Duas horas incubações são recomendados para seqüências com mais difícil proteger os grupos (por exemplo, t-butil éster, Mtr, PBF) ou sequências com muitos grupos de proteção para garantir a desproteção total de cada cadeia. Crude produtos peptoid geralmente se dissolvem em acetonitrila: água 1:1 (v / v), mas maiores proporções de acetonitrila são comuns com cadeias laterais com uma alta hidrofobicidade global.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Dimetilformamida </td><td> EMD </td><td> EM-DX1726P-1 </td><td> 99% + </td></tr><tr><td> N-methylpyrrolidinone </td><td> BDH </td><td> BDH1141-4LP </td><td> 99% </td></tr><tr><td> Ácido Bromoacetic </td><td> Acros Organics </td><td> 200000-106 </td><td> 99% </td></tr><tr><td> 4 Methylpiperidine </td><td> Sigma Aldrich </td><td> M73206 </td><td> 96% </td></tr><tr><td> N, N&#39;-diisopropylcarbodiimide </td><td> Chem-Impex </td><td> 001100 </td><td> 99,5% </td></tr><tr><td> Diclorometano </td><td> EMD </td><td> EMD-DX0835 </td><td> ACS grau </td></tr><tr><td> Acetonitrila </td><td> EMD </td><td> EM-AX0145P-1 </td><td> 99,8% </td></tr><tr><td> Ácido trifluoroacético </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T6508 </td><td> 99% </td></tr><tr><td> Triisopropylsilane </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 233781 -10G </td><td> Para a clivagem TFA </td></tr><tr><td> 1,2-Dicloroetano </td><td> JT Baker </td><td> JTH076-33 </td><td> Para siliconização de vasos de reacção de vidro </td></tr><tr><td> Fenetilamina </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 407267-100ML </td><td> &gt; 99,5% Hydrophobic amina da cadeia lateral </td></tr><tr><td> Boc-etilenodiamina </td><td> CNH Technologies </td><td> C-1112 </td><td> Amina da cadeia lateral catiônicos </td></tr><tr><td> t-butil beta-alanina HCl </td><td> Chem-Impex Internacional </td><td> 04407 </td><td> Amina da cadeia lateral aniônicos </td></tr><tr><td> α-ciano-4-ácido hidroxicinâmicos </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C8982-10X10MG </td><td> Para MALDI matriz </td></tr><tr><td> Nile Red </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 19123-10mg </td><td> Para fluorescência de imagem </td></tr><tr><td> Dichlorodimethylsilane </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 80.430-F-500G </td><td> Para siliconização de vasos de reacção de vidro </td></tr><tr><td> Carrinho PP descartáveis ​​frittedcume </td><td> Separações Aplicada </td><td> 2416 </td><td> 6 mL de polipropileno cartucho com 20 milímetros PE fritas </td></tr><tr><td> Descartáveis ​​de 3 vias luer adaptador </td><td> Cole Parmer </td><td> 31200-80 </td><td> Torneira para descartáveis ​​vaso de reação manual de síntese </td></tr><tr><td> Luer Lock Ring </td><td> Cole Parmer </td><td> 45503-19 </td><td> ¼ fitting &quot;para o recipiente de reação manual de síntese descartáveis </td></tr><tr><td> Acessórios Luer </td><td> Cole Parmer </td><td> 45500-20 </td><td> ¼ fitting &quot;para o recipiente de reação manual de síntese descartáveis </td></tr><tr><td> Descartáveis ​​PP pipetas </td><td> VWR </td><td> 16001-194 </td><td> Para transferências de TFA </td></tr><tr><td> Luer seringa de plástico bloqueio </td><td> Científica Nacional </td><td> S7515-5 </td><td> 6 seringas mL </td></tr><tr><td> Um frasco de vidro dram </td><td> VWR </td><td> 66011-041 </td><td> Com resinas fenólicas moldado com tampa de rosca de polivinil-faced forro de celulose </td></tr><tr><td> 20 mL Scinfrasco tillation </td><td> VWR </td><td> 66022-060 </td><td> Com tampa de PP em anexo e liner folha de celulose </td></tr><tr><td> Seguro-Seal espaçador adesiva </td><td> Invitrogen </td><td> S-24736 </td><td> Para fluorescência de imagem </td></tr><tr><td> Lâminas de vidro </td><td> Microscopia Eletrônica de Ciências </td><td> 63411 </td><td> Para fluorescência de imagem </td></tr><tr><td> Tampa de deslizamento </td><td> VWR </td><td> 48366-067 </td><td> Para fluorescência de imagem </td></tr><tr><td> 4 pastilha de silício &quot; </td><td> Ted Pella </td><td> 16007 </td><td> Pré-dice em fichas milímetros 5x7 </td></tr><tr><td> 0,45 filtro </td><td> VWR, Acrodisc </td><td> 28143-924 </td><td> Para HPLC. Membrana de PTFE </td></tr><tr><td> Agarose </td><td> BD </td><td> 212272 </td><td> Para fluorescência de imagem </td></tr><tr><td> SPE Manifold a vácuo </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 57044 </td><td> Exemplo de múltiplas vácuo SPE </td></tr><tr><td> Vaso poroso de vidro </td><td> Ace vidro </td><td> 6402-12 </td><td> Porosidade Cfrita </td></tr><tr><td> Plasma Cleaner / Esterilizador </td><td> Harrick Plasma </td><td> PDC-32G </td><td> Exemplo de produto de limpeza de plasma para preparar chips de silício para SEM </td></tr></tbody></table>

síntese em fase sólida submonomer de polímeros peptoid e seus automontagem em altamente ordenada nanofolhas

Solid-phase Submonomer Synthesis of Peptoid Polymers and their Self-Assembly into Highly-Ordered Nanosheets

Peptóides são uma nova classe de biomimético, não-natural, seqüência específica heteropolímeros que resistem à proteólise, apresentam atividade biológica potente, e dobre em nanoestruturas de ordem superior. Estruturalmente similares aos peptídeos, Peptóides são poli N-substituído glycines, onde as cadeias laterais estão ligados ao nitrogênio, em vez de o alfa-carbono. Sua facilidade de síntese e diversidade estrutural permite que testes de princípios básicos de design para dirigir de novo desenho e engenharia de novos materiais biologicamente ativos e nanoestruturados. Aqui, um simples manual de protocolo de síntese peptoid é apresentado que permite a síntese de polypeptoids de cadeia longa (até 50mers) em excelentes rendimentos. Apenas equipamentos básicos, técnicas simples (por exemplo, transferência de líquidos, filtração), e reagentes disponíveis no mercado são necessários, fazendo Peptóides uma adição acessível a toolkits muitos pesquisadores. A espinha dorsal peptoid é cultivado um monômero em um tempo via o método submonomer que consiste em um ciclo de duas etapas além de monômero: acilação e deslocamento. Ácido, primeiro bromoacetic ativadas in situ com N, N&#39;-diisopropylcarbodiimide acylates uma resina-bound amina secundária. Deslocamento, segundo nucleofílica do brometo de uma amina primária segue para introduzir a cadeia lateral. O ciclo de duas etapas é iterado até que o comprimento da cadeia desejado seja alcançado. A eficiência de acoplamento deste ciclo de dois passos rotineiramente excede 98% e permite a síntese de Peptóides enquanto 50 resíduos. Altamente sintonizável, precisa e quimicamente seqüências diversas são realizáveis ​​com o método submonomer como centenas de aminas primárias prontamente disponíveis pode ser diretamente incorporadas. Peptóides estão emergindo como um material versátil biomimético para pesquisa nanobioscience por causa de sua sintética flexibilidade, robustez, e ordenando a nível atômico. O dobramento de uma única cadeia, anfifílicos, informação rica em polypeptoid em um nanosheet altamente ordenado foi recentemente demonstrada. Este é um peptoid 36-mer, que consiste em apenas três diferentes monômeros comercialmente disponíveis: hidrofóbica, catiônicas e aniônicas. O cadeias laterais hidrofóbicas feniletil estão enterrados no núcleo nanosheet enquanto a amina iônicos e cadeias laterais carboxila alinhar nos rostos hidrofílico. O nanofolhas peptoid servir como uma plataforma potencial para miméticos de membrana, miméticos de proteínas, fabricação de dispositivos e sensores. Métodos para a síntese peptoid, formação da folha, e as imagens de microscopia são descritos e fornecer um método simples para que projetos futuros nanosheet peptoid.

Um simples e gerais método de síntese manual de peptoid envolvendo equipamentos básicos e reagentes disponíveis comercialmente é delineado, permitindo Peptóides para ser facilmente sintetizado na maioria dos laboratórios. A síntese, purificação e caracterização de um 36mer peptoid anfifílicos é descrito, bem como a sua auto-montagem em altamente ordenado nanofolhas.

Síntese em fase sólida Submonomer de Polímeros Peptoid e seus Automontagem em altamente ordenada nanofolhas

Peptoides são uma nova classe de heteropolímeros biomiméticos, não naturais e de sequência específica que resistem à proteólise, exibem atividade biológica potente e ...

O objetivo geral deste procedimento é descrever um método simples e eficiente para a síntese de peptídeos em fase sólida e a autoagregação aquosa de peptídeos em nanolâminas altamente ordenadas. Estruturalmente semelhantes aos polipeptídeos, os peptídeos são polímeros de glicina substituída em que as cadeias laterais estão ligadas ao nitrogênio em vez do carbono alfa. O processo inicia-se com a síntese de uma sequência peptídica específica por meio do método de submonômero.O método do submonômero consiste em duas etapas químicas simples que introduzem cada monômero na cadeia sequencialmente. Primeiro, uma amina ligada a um suporte sólido é bromoacetilada. Segundo, o brometo é substituído por uma amina primária.Esses passos são repetidos até que o comprimento da cadeia desejado seja alcançado. Após a alongamento da cadeia, o peptídeo é clivado do suporte sólido e o óleo bruto de peptídeo resultante é purificado por CLAE e caracterizado para iniciar a automontagem de peptídeos em nanofolhas. Uma solução aquosa diluída do peptídeo é preparada em um vial de vidro e misturada suavemente. Como etapa final.As nanoestruturas são examinadas ao microscópio. Os resultados demonstram que um ciclo iterativo de duas etapas químicas simples pode gerar um polímero com sequência específica que se autoorganiza espontaneamente em nanoestruturas. Os peptídeos são uma classe nova de polímeros inspirados na biologia, com propriedades intermediárias entre as das proteínas e dos polímeros tradicionais.Eles são robustos e sinteticamente versáteis como os polímeros tradicionais, mas também são altamente ajustáveis e específicos em sequência, como as proteínas e o DNA. Os peptídeos estão surgindo como um material avançado para abordar problemas fundamentais na biomedicina e na ciência dos materiais, tais como a identificação de fármacos bioativos ou o projeto de proteínas artificiais. As principais vantagens dos peptídeos incluem controle preciso da sequência, disponibilidade de blocos constituintes incrivelmente diversos, síntese eficiente e estabilidade frente a proteases. O método geral de síntese manual de peptídeos, que envolve equipamentos básicos e reagentes comercialmente disponíveis, é descrito aqui, permitindo que peptídeos sejam facilmente sintetizados na maioria dos laboratórios.A demonstração visual das etapas sintéticas é fundamental e serve como referência valiosa para indivíduos que ingressam na área da síntese em fase sólida. Pela primeira vez aqui, a purificação e caracterização de um peptídeo anfifílico com 36 resíduos são descritas, bem como sua automontagem em nanolâminas altamente ordenadas. Inicie este protocolo com a montagem do aparato experimental conforme descrito no protocolo escrito.Os seguintes passos serão realizados em um vaso de reação de vidro em vez de uma cartucho fritado descartável de polipropileno, para maior clareza. Após a montagem, adicione 100 miligramas de resina de amida R a um vaso de reação fritado e deixe a resina absorver o solvente, adicionando dois mililitros de dimetilformamida ou DMF, agitando mediante borbulhamento por 10 minutos. Em seguida, drene a solução por vácuo para isolar a resina inchada.Em seguida, adicione um mililitro de piridina metílica a 20% completo em DMF para desproteger o grupo FM O. Agite por dois minutos e drene. Repita este processo por 12 minutos, depois enxágue a resina adicionando dois mililitros de DMF, agitando por 15 segundos e drenando.Inicie o crescimento da cadeia peptídica com o primeiro ciclo de submonômero, que inclui uma bromoacetilação e uma etapa de deslocamento. Para a bromoacetilação, adicione um mililitro de ácido bromoacético 0,6 molar em DMF e 86 microlitros de diisopropilcarbodiimida. Após agitar por 30 minutos, drene e lave com dois mililitros de DMF.Em seguida, realize o deslocamento adicionando um mililitro de amina de um a dois molar em metil pirógeno, incube por 30 a 120 minutos. Após a incubação, drene e lave com dois mililitros de DMF. Novamente, continue o crescimento da cadeia peptídica repetindo o ciclo de submonômero. Após a conclusão do deslocamento final, lave com dois mililitros de DMF.A seguir, realize uma tampa de lavagem com metano diórico e armazene o vaso de reação até a clivagem. Para iniciar a clivagem, transfira toda a resina seca para um frasco de vidro de cintilação de 20 mililitros, trabalhando dentro de uma capela e utilizando equipamento de proteção individual adequado; adicione quatro mililitros de ácido tri-fluoro-acético, ou coquetel de clivagem TFA, ao frasco de vidro de cintilação e tampe. Agite vigorosamente por 10 minutos a 2 horas à temperatura ambiente.Alternativamente, utilize um agitador rotativo para misturar a solução. Colete a solução de clivagem com TFA filtrando a resina por meio de uma cartela descartável fritada de polipropileno em um novo frasco de vidro para cintilação de 20 mililitros previamente pesado. Em seguida, adicione um mililitro de coquetel de clivagem fresco para enxaguar a resina e coletar qualquer peptídeo residual.Repita este passo, enxágue duas vezes. Evapore o TFA passando um fluxo suave de nitrogênio ou utilizando um evaporador Biot Charge. No evaporador V 10, redissolva o óleo bruto em seis mililitros de uma mistura de acetonitrila e água na proporção de 1:1.Em seguida, congele e liofilize a amostra. Esse processo deve ser repetido mais uma vez após a segunda liofilização. Registre o peso do produto bruto e armazene-o como um pó seco a menos 20 graus Celsius, utilizando uma combinação de HPLC analítica com detector de arranjo de diodos e/ou espectrometria de massas com ionização por spray eletrospray (LCMS).A pureza do produto bruto e se o peso molecular desejado está presente podem ser determinados seguindo os procedimentos descritos no texto. A mistura bruta de peptídeos pode então ser purificada por meio de CLAE preparativa em fase reversa, conforme o procedimento descrito. Esta seção descreve o protocolo para formar folhas a partir de uma sequência de cadeia única específica de peptídeo anfifílico com 36 me.Após a síntese, purificação e liofilização da cadeia peptídica, o pó branco resultante é dissolvido em DMSO para preparar uma solução estoque de dois milimolares. Em seguida, obtenha um arquivo Dr.Glass para preparar uma solução de peptídeo de 20 micromolares. Primeiro, adicione 445 microlitros de água milli Q e 50 microlitros de tampão 10 x para formação de folha.Vortex a ampola para homogeneizar. Em seguida, adicione cinco microlitros de uma solução estoque de peptídeo a dois milimolares e agite suavemente. As lâminas da solução resultante são formadas pela agitação suave da solução aquosa diluída de peptídeo.Inclinando lentamente o frasco de vidro com tampa da posição horizontal para a posição vertical. Resulta em agitação suave em folhas, também produz folhas. No entanto, as folhas tendem a ser menores e com menos bordas retas em comparação com muitas folhas de alta qualidade.Gire lentamente os frascos de vidro em torno do eixo horizontal por um dia utilizando um rotador de tubos ou um agitador personalizado para a coloração fluorescente de nanolâminas; adicione um microlitro de vermelho de Nile a 100 micromolares a 100 microlitros da solução de nanolâminas para obter uma concentração final de um micromolar de Nile. O vermelho de Nile é um corante sensível ao ambiente, cuja intensidade de fluorescência aumenta quando se localiza em ambientes hidrofóbicos. Em seguida, prepare uma solução de aros a 1% em água quente e despeje em uma placa de Petri de plástico.Assegure-se de que a solução de aros tenha aproximadamente um oitavo de polegada de espessura e deixe a solução esfriar sem perturbação sobre uma superfície plana. Após a solidificação do aros, use uma espátula para cortar quadrados de um centímetro por um centímetro. Em seguida, transfira os quadrados cortados para uma lâmina de vidro para coletar as folhas no mesmo plano, aplicando um microlitro da solução de folha sobre o pedaço de aros.Após dois minutos, os aros devem absorver o tampão, deixando as lâminas na superfície. Imagem a lâmina dentro de 15 minutos. Alternativamente, para imagens de lâminas e solução, carregue 15 microlitros dentro de uma junta de 0,12 milímetro de diâmetro de 20 milímetros em uma lâmina de vidro.Cubra a amostra com uma lamínula e realize a imagem em poucos dias para executar a MEV de nanofolhas. Primeiro, faça a corrosão a plasma de pastilhas de silício para auxiliar na absorção das nanofolhas. Em seguida, adicione 20 microlitros de solução de folhas peptídicas sobre um substrato de silício tratado por plasma e deixe a solução repousar; após três minutos, remova o excesso de solução com a ponta de uma pipeta de papel Kim, adicione 20 microlitros de água sobre a superfície e, novamente, remova o excesso de solução por capilaridade para eliminar o tampão e os sais.Alternativamente, as soluções de folhetos peptídicos são diálisadas contra água para remover tampão e sal. Nesse caso, 20 microlitros da solução de folhetos diálisada podem ser depositados sobre os substratos de silício tratados por plasma e deixados secar ao ar. Após a solução de folhetos secar nos substratos de silício tratados por plasma, o folheto pode ser analisado por MEV utilizando um detector interno a energias do feixe entre um quilovolt e cinco quilovolts.A síntese, caracterização e purificação de um peptídeo com carga em bloco 36 me específico para sequência, que se dobra em uma nano folha bidimensional altamente ordenada, foi realizada. As aminas utilizando a síntese do peptídeo com carga em bloco 36 me ligarão etilenodiamina a fenetilamina e t-butil beta-alanina. Após a síntese, o peptídeo bruto foi clivado da resina com TFA aquoso 95%.Após a solução de TFA ter sido coletada e evaporada, o peptídeo bruto com carga do bloco 36 me foi purificado por HPLC em fase reversa. A massa do peptídeo com carga do bloco purificado foi então confirmada por moldy.A massa observada de 4981,2 é muito próxima da massa calculada de 4981,74. O pó liofilizado foi dissolvido em DMSO para preparar uma solução estoque de dois milimolares e armazenado a quatro graus Celsius. Lâminas foram preparadas pelo protocolo acima mencionado e analisadas por microscopia óptica de fluorescência.Uma variedade de formas com tamanhos de características que variam até 300 micrômetros é observada, e notavelmente bordas retas são proeminentes. A MEV também foi utilizada para imagens das lâminas, revelando de forma semelhante bordas retas proeminentes. Este vídeo descreve um protocolo simples e eficiente para a síntese em fase sólida de peptídeos e a autoagregação em meio aquoso de peptídeos em nanolâminas.Como literalmente centenas de blocos de construção de aminoácidos estão prontamente disponíveis e podem ser utilizados neste protocolo, o espaço de design acessível com polipeptídeos é praticamente ilimitado. Os peptídeos são materiais promissores para pesquisas em biomedicina e nanociência devido à sua flexibilidade sintética, robustez e capacidade de organização. Em particular, no nível atômico, as nanoestruturas em folha servem como uma plataforma potencial para andaimes de exibição bidimensional, miméticos de membranas, sensores biológicos, miméticos de proteínas e fabricação de dispositivos.Trabalhar com reagentes corrosivos, como trior, ácido acético e ácido bromoacético, é extremamente perigoso; para prevenir lesões, realize todas as reações em uma cabine de segurança química e use equipamentos de proteção individual adequados.

solid-phase-submonomer-synthesis-peptoid-polymers-their-self-assembly

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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Este artigo fornece protocolos para o projeto e auto-montagem de nanoestruturas de oligômeros de ácido nucleírico de peptídeos modificados gama em misturas de solventes orgânicos.

Auto-montagem de ácidos nucleicos de peptídeos modificados gama em nanoestruturas complexas em misturas de solventes orgânicos

Um protocolo para a síntese e caracterização de monocamadas de estrutura metal-orgânica automontadas é fornecido usando cristais de estrutura metal-orgânica (MOF) enxertados com polímero. O procedimento mostra que as partículas MOF enxertadas com polímero podem ser automontadas em uma interface ar-água, resultando em estruturas monocamada bem formadas e independentes, conforme evidenciado por imagens de microscopia eletrônica de varredura.

Síntese e caracterização de monocamadas de estrutura metal-orgânica automontadas usando partículas revestidas com polímero

Aprenda a síntese em fase sólida de peptoides pelo método submonômero e sua automontagem em nanofolhas ordenadas. Este protocolo acessível permite criar materiais biomiméticos para nanociência e biomedicina.

Síntese em fase sólida Submonomer de Polímeros Peptoid e seus Automontagem em altamente ordenada nanofolhas

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