Síntese em fase sólida Submonomer de Polímeros Peptoid e seus Automontagem em altamente ordenada nanofolhas

O objetivo geral deste procedimento é descrever um método simples e eficiente para a síntese de peptídeos em fase sólida e a autoagregação aquosa de peptídeos em nanolâminas altamente ordenadas. Estruturalmente semelhantes aos polipeptídeos, os peptídeos são polímeros de glicina substituída em que as cadeias laterais estão ligadas ao nitrogênio em vez do carbono alfa. O processo inicia-se com a síntese de uma sequência peptídica específica por meio do método de submonômero.

O método do submonômero consiste em duas etapas químicas simples que introduzem cada monômero na cadeia sequencialmente. Primeiro, uma amina ligada a um suporte sólido é bromoacetilada. Segundo, o brometo é substituído por uma amina primária.

Esses passos são repetidos até que o comprimento da cadeia desejado seja alcançado. Após a alongamento da cadeia, o peptídeo é clivado do suporte sólido e o óleo bruto de peptídeo resultante é purificado por HPLC e caracterizado para iniciar a autoagregação de peptídeos em nanoplacas. Uma solução aquosa diluída do peptídeo é preparada em um frasco de vidro e misturada suavemente. Como etapa final.

As nanoestruturas são examinadas ao microscópio. Os resultados demonstram que um ciclo iterativo de duas etapas químicas simples pode gerar um polímero com sequência específica que se autoorganiza espontaneamente em nanoestruturas. Os peptídeos são uma classe nova de polímeros inspirados na biologia, com propriedades intermediárias entre as das proteínas e dos polímeros tradicionais.

São robustos e sinteticamente versáteis como os polímeros tradicionais, mas também são altamente ajustáveis e específicos em sequência, como as proteínas e o DNA; os peptídeos estão surgindo como um material avançado para abordar problemas-chave na biomedicina e na ciência dos materiais, tais como a identificação de fármacos bioativos ou o projeto de proteínas artificiais. As principais vantagens dos peptídeos incluem controle preciso da sequência, a disponibilidade de blocos constituintes incrivelmente diversos, síntese eficiente e estabilidade frente a proteases. O método geral de síntese manual de peptídeos, que envolve equipamentos básicos e reagentes comercialmente disponíveis, é descrito aqui, permitindo que peptídeos sejam facilmente sintetizados na maioria dos laboratórios.

A demonstração visual das etapas sintéticas é fundamental e serve como referência valiosa para indivíduos que ingressam no campo da síntese em fase sólida. Pela primeira vez aqui, a purificação e caracterização de um peptídeo anfifílico com 36 resíduos são descritas, bem como sua autoagregação em nanolâminas altamente ordenadas. Inicie este protocolo com a montagem do aparato experimental conforme descrito no protocolo escrito.

Os seguintes passos serão realizados em um vaso de reação de vidro em vez de uma cartucho descartável fritado de polipropileno, para maior clareza. Após a montagem com 100 miligramas de resina R amida em um vaso de reação fritado, hidrate a resina adicionando dois mililitros de dimetilformamida ou DMF e agite por borbulhamento durante 10 minutos. Em seguida, drene a solução por vácuo para isolar a resina inchada.

Em seguida, adicione um mililitro de piridina metílica a 20% completo em DMF para desproteger o grupo FM O. Agite por dois minutos e drene. Repita este processo por 12 minutos, depois enxágue a resina adicionando dois mililitros de DMF, agitando por 15 segundos e drenando.

Inicie o crescimento da cadeia peptídica com o primeiro ciclo de submonômero, que inclui uma bromoacetilação e uma etapa de deslocamento. Para a bromoacetilação, adicione um mililitro de ácido bromoacético 0,6 molar em DMF e 86 microlitros de dicarbonimida de diisopropila. Após agitar por 30 minutos, drene e lave com dois mililitros de DMF.

Em seguida, realize a desproteção adicionando um mililitro de uma a duas molar de amina em metil pirroglutolona e incube por 30 a 120 minutos. Após a incubação, drene e lave com dois mililitros de DMF. Novamente, continue o crescimento da cadeia peptídica repetindo o ciclo de submonômeros. Após a conclusão da desproteção final, lave com dois mililitros de DMF.

A seguir, realize uma tampa de lavagem com metano diórico e armazene o vaso de reação até a clivagem. Para iniciar a clivagem, transfira toda a resina seca para um frasco de vidro de cintilação de 20 mililitros, trabalhando dentro de uma capela e utilizando equipamento de proteção individual adequado; adicione quatro mililitros de ácido tri-fluoro-acético, ou coquetel de clivagem TFA, ao frasco de vidro de cintilação e tampe. Agite vigorosamente por 10 minutos a 2 horas à temperatura ambiente.

Alternativamente, utilize um agitador rotativo para misturar a solução. Colete a solução de clivagem com TFA filtrando a resina através de um cartucho descartável fritado de polipropileno em um novo frasco de vidro para cintilação pré-pesado de 20 mililitros. Em seguida, adicione um mililitro de coquetel de clivagem fresco para enxaguar a resina e coletar qualquer peptídeo residual.

Repita isso, enxágue duas vezes. Evapore o TFA soprando um fluxo suave de nitrogênio ou utilizando um evaporador Biot. No evaporador V 10, redissolva o óleo bruto em seis mililitros de uma mistura de acetonitrila e água na proporção de um para um.

Em seguida, congele e liofilize a amostra. Esse processo deve ser repetido mais uma vez após a segunda liofilização. Registre o peso do produto bruto e armazene-o como um pó seco a menos 20 graus Celsius, utilizando uma combinação de HPLC analítico com detector de arraste ou espectrometria de massas com ionização por spray eletrostático (LCMS).

A pureza do produto bruto e se o peso molecular desejado está presente podem ser determinados seguindo os procedimentos descritos no texto. A mistura bruta do peptídeo pode então ser purificada por HPLC preparativa em fase reversa de acordo com o procedimento escrito. Esta seção descreve o protocolo para formar lâminas a partir de uma sequência de cadeia única de peptídeo anfifílico 36 me específico.

Após a síntese, purificação e liofilização da cadeia peptídica, o pó branco resultante é dissolvido em DMSO para preparar uma solução estoque de dois milimolares. Em seguida, obtenha um arquivo Dr.Glass para preparar uma solução peptídica de 20 micromolares. Primeiro, adicione 445 microlitros de água milli Q e 50 microlitros de tampão 10 x para formação de folhas.

Vortex a ampola para misturar. Em seguida, adicione cinco microlitros de uma solução estoque de peptídeo a dois milimolares e deixe inchar suavemente. As lâminas da solução resultante são formadas pela agitação suave da solução aquosa diluída de peptídeo.

Inclinando lentamente o frasco de vidro com tampa da posição horizontal para a posição vertical. Resulta em uma agitação suave em folhas, produzindo também folhas. No entanto, as folhas tendem a ser menores e com menos bordas retas em comparação com muitas folhas de alta qualidade.

Gire lentamente os frascos de vidro em torno do eixo horizontal por um dia utilizando um rotador de tubos ou um agitador personalizado para coloração fluorescente de nanolâminas; adicione um microlitro de vermelho de Nile a 100 micromolares a 100 microlitros da solução de nanolâminas para obter uma concentração final de um micromolar de Nile. O vermelho de Nile é um corante sensível ao ambiente cuja intensidade de fluorescência aumenta quando se localiza em ambientes hidrofóbicos. Em seguida, prepare uma solução de aros a 1% em água quente e despeje em uma placa de Petri de plástico.

Certifique-se de que a solução de aros tenha aproximadamente um oitavo de polegada de espessura e deixe a solução esfriar sem perturbação sobre uma superfície plana. Após a solidificação do aros, use uma espátula para cortar quadrados de um centímetro por um centímetro. Em seguida, transfira os quadrados cortados para uma lâmina de vidro para coletar as folhas no mesmo plano e aplique um microlitro da solução de folha sobre o pedaço de aros.

Após dois minutos, os aros devem absorver o tampão, deixando as lâminas na superfície. Imagem a lâmina dentro de 15 minutos. Alternativamente, para imagens de lâminas e solução, carregue 15 microlitros dentro de uma junta de 0,12 milímetro de diâmetro de 20 milímetros em uma lâmina de vidro.

Cubra a amostra com uma lamínula e realize a imagem em poucos dias para executar a MEV de nanofolhas. Primeiro, faça a corrosão a plasma de pastilhas de silício para auxiliar na absorção das nanofolhas. Em seguida, adicione 20 microlitros de solução de folhas peptídicas sobre um substrato de silício tratado por plasma e deixe a solução repousar; após três minutos, remova o excesso de solução com a ponta de uma pipeta de papel Kim, adicione 20 microlitros de água sobre a superfície e novamente retire o excesso de solução para eliminar tampão e sais.

Alternativamente, as soluções de folhetos peptídicos são diálisadas contra água para remover tampão e sal. Nesse caso, 20 microlitros da solução de folhetos dialisada podem ser depositados sobre os substratos de silício tratados por plasma e deixados secar ao ar. Após a solução de folhetos secar nos substratos de silício tratados por plasma, o folheto pode ser analisado por MEV utilizando um detector in lens com energias de feixe entre um quilovolt e cinco quilovolts.

A síntese, caracterização e purificação de um peptídeo com carga de bloco específico de sequência de 36 me que se dobra em uma nano folha bidimensional altamente ordenada foi realizada. As aminas utilizando a síntese do peptídeo com carga de bloco de 36 me ligarão etileno diamina a fenetilamina e beta alanina t butila. Após a síntese, o peptídeo bruto foi clivado da resina com TFA aquoso a 95%.

Após a solução de TFA ter sido coletada e evaporada, o peptídeo bruto com carga do bloco 36 me foi purificado por HPLC em fase reversa. A massa do peptídeo com carga do bloco purificado foi então confirmada por moldy.

A massa observada de 4981,2 corresponde de perto à massa calculada de 4981,74. O pó liofilizado foi dissolvido em DMSO para preparar uma solução estoque de dois milimolares e armazenado a quatro graus Celsius. Lâminas foram preparadas pelo protocolo mencionado anteriormente e analisadas por microscopia óptica de fluorescência.

Uma variedade de formas com tamanhos de características que variam até 300 micrômetros é observada, e notavelmente bordas retas são proeminentes. A MEV também foi utilizada para imaginar as folhas, revelando de forma semelhante bordas retas proeminentes. Este vídeo descreve um protocolo simples e eficiente para a síntese em fase sólida de peptídeos e a autoagregação aquosa de peptídeos em nanofolhas.

Como literalmente centenas de aminoácidos estão prontamente disponíveis e podem ser utilizados neste protocolo, o espaço de projeto acessível com polipeptídeos é praticamente ilimitado. Os peptídeos são materiais promissores para pesquisas em biomedicina e nanociência devido à sua flexibilidade sintética, robustez e capacidade de organização. Em particular, em nível atômico, as nanoestruturas lamelares servem como uma plataforma potencial para esqueletos de exibição bidimensional, miméticos de membranas, sensores biológicos, miméticos de proteínas e fabricação de dispositivos.

Trabalhar com reagentes corrosivos, como trior, ácido acético e ácido bromoacético, é extremamente perigoso; para prevenir lesões, realize todas as reações em uma capela de exaustão e use equipamento de proteção individual adequado.