Síntese em fase sólida Submonomer de Polímeros Peptoid e seus Automontagem em altamente ordenada nanofolhas

O objetivo geral deste procedimento é descrever um método simples e eficiente para a síntese de peptídeos em fase sólida e a automontagem aquosa de peptídeos em nano folhas altamente ordenadas. Estruturalmente semelhantes aos polipeptídeos, os peptídeos estão em polímeros de glicina substituídos, onde as cadeias laterais estão ligadas ao nitrogênio em vez do carbono alfa. O processo começa sintetizando uma sequência peptídica específica por meio de outro método de submonômero.

O método do submonômero consiste em duas etapas químicas simples que introduzem cada monômero na cadeia sequencialmente. Primeiro, uma amina ligada a um suporte sólido é bromoacetilada. Em segundo lugar, o brometo é deslocado por uma amina primária.

Essas etapas são repetidas até que o comprimento da cadeia desejado seja alcançado Após o alongamento da cadeia, o peptídeo é clivado do suporte sólido e o óleo peptídico bruto resultante é purificado por HPLC e caracterizado para iniciar a automontagem de peptídeos em nano folhas. Uma solução tampão aquosa diluída do peptídeo é preparada em um frasco de vidro e misturada suavemente. Como etapa final.

As nano folhas são examinadas ao microscópio. Os resultados demonstram que um ciclo iterativo de duas etapas químicas simples pode produzir um polímero específico de sequência que se auto-monta espontaneamente em nano folhas. Os peptídeos são uma nova classe de polímeros bioinspirados com propriedades entre as proteínas e os polímeros tradicionais.

Eles são robustos e sinteticamente versáteis como os polímeros tradicionais, mas também são altamente ajustáveis e específicos de sequência, como proteínas e peptídeos de DNA estão emergindo como um material avançado para resolver problemas-chave em biomedicina e ciência de materiais, como a identificação de drogas bioativas ou o design de proteínas artificiais. As principais vantagens dos peptídeos incluem controle preciso da sequência, disponibilidade de blocos de construção incrivelmente diversos, síntese eficiente e estabilidade da protease. O método geral de síntese manual de peptídeos envolvendo equipamentos básicos e reagentes disponíveis comercialmente é descrito, permitindo que os peptídeos sejam facilmente sintetizados na maioria dos laboratórios.

A demonstração visual das etapas sintéticas é crítica e serve como uma referência valiosa para indivíduos que entram no campo da síntese em fase sólida. Pela primeira vez aqui, a purificação e caracterização de um peptídeo anfifílico 36 mers descritos, bem como sua auto-montagem em nano folhas altamente ordenadas. Comece este protocolo com a configuração do aparato experimental conforme descrito no protocolo escrito.

As etapas a seguir serão executadas em um recipiente de reação de vidro em vez de um cartucho descartável de polipropileno para maior clareza. Após a configuração de 100 miligramas de resina de R amida em um vaso de reação frita, inche a resina adicionando dois mililitros de dimetil forma amida ou DMF agite borbulhando por 10 minutos. Em seguida, drene a solução por vácuo para isolar a resina inchada.

Em seguida, adicione um mililitro de metil piridina a 20% em DMF para proteger o grupo FM O. Agite por dois minutos e escorra. Repita esse processo por 12 minutos e, em seguida, enxágue a resina adicionando dois mililitros de DMF, agitando por 15 segundos e drenando.

Comece a aumentar a cadeia peptídica com o primeiro ciclo de submonômero, que inclui uma acetilação de bromo e uma etapa de deslocamento. Para a acetilação do bromo, adicione um mililitro de ácido bromoacético 0,6 molar em DMF e 86 microlitros de ácaro di isopropil carbo. Depois de agitar por 30 minutos, escorra e enxágue com dois mililitros de DMF.

Em seguida, execute o deslocamento adicionando um mililitro de amina de um a dois molares na incubação final de metil pirogenona por 30 a 120 minutos após a incubação, drene e enxágue com dois mililitros de DMF. Novamente, continue a aumentar a cadeia peptídica repetindo o ciclo do submonômero. Após o deslocamento final, enxágue com dois mililitros de DMF.

Siga isso com uma touca de lavagem de diora metano e armazene o vaso de reação até a clivagem. Para iniciar a clivagem, transfira toda a resina seca para um frasco de vidro de cintilação de 20 mililitros trabalhando dentro de um capuz e, usando equipamento de proteção individual adequado, adicione quatro mililitros de ácido trifluoroacético ou coquetel de clivagem TFA ao frasco de vidro de cintilação e tampa. Mexa bem por 10 minutos a duas horas em temperatura ambiente.

Como alternativa, use um agitador rotativo para misturar a solução. Colete a solução de clivagem TFA filtrando a resina através de um cartucho descartável de polipropileno fritado em um novo frasco de vidro de cintilação pré-pesado de 20 mililitros. Em seguida, adicione um mililitro de coquetel de clivagem fresco para enxaguar a resina e coletar qualquer peptídeo residual.

Repita isso, enxágue duas vezes. Evapore o TFA soprando um fluxo suave de nitrogênio ou usando uma carga de biot. V 10 evaporador vermelho dissolver o petróleo bruto em seis mililitros de um a um aceto nitrilo e água.

Em seguida, congele e liofilize a amostra. Este processo deve ser repetido mais uma vez após a segunda liofilização. Registre o peso do estoque de produtos brutos como um pó seco a menos 20 graus Celsius por meio de uma combinação de HPLC analítica mofada e/ou LCMS por pulverização elétrica.

A pureza do produto bruto e a presença do peso molecular desejado podem ser determinadas seguindo os procedimentos descritos no texto. A mistura de peptídeos brutos pode então ser purificada com HPLC de preparação de fase reversa de acordo com o procedimento escrito. Esta seção descreve o protocolo para formar folhas a partir de um peptídeo anfifílico 36 me específico de sequência de cadeia única.

Depois que a fita peptídica é sintetizada, purificada e liofilizada, o pó branco resultante é dissolvido em DMSO para fazer uma solução estoque de dois milimolares. Em seguida, obtenha um arquivo Dr.Glass para preparar uma solução de peptídeo 20 micromolar. Primeiro, adicione 445 microlitros de água mili Q e 50 microlitros de tampão de formação de 10 folhas.

Vortex o frasco para misturar. Em seguida, adicione cinco microlitros de uma solução estoque de peptídeo de dois milimolares e inche suavemente. As folhas de solução resultantes são formadas pela agitação suave da solução peptídica aquosa diluída.

Inclinar lentamente o frasco de vidro tampado da posição horizontal para a posição vertical. Resulta em folhas agitando suavemente, também produz folhas. No entanto, as folhas tendem a ser menores e com menos bordas retas para muitas folhas de alta qualidade.

Gire os frascos de vidro em torno do eixo horizontal lentamente por um dia usando um rotador de tubo ou um balancim personalizado para coloração fluorescente de nano folhas, adicione um microlitro de 100 micromolares de vermelho do Nilo a 100 microlitros da solução de nano folha para obter uma concentração final de um micromolar Nilo. O vermelho é um corante ambientalmente sensível cuja intensidade de fluorescência aumenta quando está localizado em ambientes hidrofóbicos. Em seguida, faça uma solução de 1% de aros em água quente e despeje em uma placa de Petri de plástico.

Certifique-se de que a solução de aros tenha aproximadamente um oitavo de polegada de espessura e deixe a solução esfriar sem ser perturbada em uma superfície plana. Depois que o aros endurecer, use uma espátula para cortar quadrados de um centímetro por um centímetro. Em seguida, transfira os quadrados cortados para uma lâmina de vidro para coletar as folhas no mesmo plano, coloque um microlitro de solução de folha no pedaço de aros.

Após dois minutos, o aros deve absorver o buffer deixando as folhas na superfície. Visualize a planilha em 15 minutos. Alternativamente, para folhas de imagem e solução carregar 15 microlitros dentro de uma junta de 20 milímetros de diâmetro 0,12 milímetros em uma lâmina de vidro.

Cubra a amostra com uma lamínula e imagem dentro de alguns dias para realizar o SEM de nano folhas. Primeiros chips de silício gravados a plasma para auxiliar na absorção das nano folhas. Em seguida, coloque 20 microlitros de solução de folha de peptídeo em um substrato de silício tratado com plasma e deixe a solução descansar após três minutos, remova o excesso de solução com a ponta de uma pipeta Kim 20 microlitros de água na superfície e novamente absorva o excesso de solução para remover o tampão e os sais.

Alternativamente, as soluções de folha peptídica são dialisadas contra água para remover tampão e sal. Nesse caso, 20 microlitros da solução de folha dialisada podem ser jogados sobre os substratos de silício tratados com plasma e deixados secar ao ar. Depois que a solução da folha secou nos substratos de silício tratados com plasma, a folha pode ser visualizada com SEM usando um detector de lente em energias de feixe entre um quilovolt e cinco quilovolts.

Foi realizada a síntese, caracterização e purificação de um peptídeo de carga de bloco de 36 me específico de sequência que se dobra em uma nano folha bidimensional altamente ordenada. As aminas que usam a síntese do peptídeo de carga de bloqueio de 36 me transformarão em etilenodiamina em fenetil, amina e t butil beta alanina. Após a síntese, o peptídeo bruto foi clivado da resina com 95% de AGT aquoso.

Após a coleta e evaporação da solução de TFA. O peptídeo bruto de carga de bloqueio de 36 me foi purificado com HPLC de fase reversa. A massa do peptídeo de carga de bloco purificado foi então confirmada por mofo.

A massa observada 4981.2 corresponde à massa calculada de 4981.74. O pó liofilizado foi dissolvido em DMSO para fazer uma solução estoque de dois milimolares e armazenado a quatro graus Celsius. As folhas foram preparadas pelo protocolo supracitado e imagem com microscopia óptica de fluorescência.

Uma variedade de formas com tamanhos de recursos que variam de até 300 mícrons são observadas e, notavelmente, bordas retas são proeminentes. O SEM também foi usado para obter imagens das folhas, revelando bordas retas proeminentes. Este vídeo descreve um protocolo simples e eficiente para a síntese de peptídeos de face sólida e a automontagem aquosa de peptídeos em nanofolhas.

Uma vez que literalmente centenas de blocos de construção estão prontamente disponíveis e podem ser usados neste protocolo, o espaço de design acessível com polipeptídeos é praticamente ilimitado. Os peptídeos são materiais promissores para a pesquisa em biomedicina e nanociência devido à sua flexibilidade sintética, robustez e ordenação. No nível atômico em particular, as nano folhas servem como uma plataforma potencial para andaimes de exibição bidimensionais, miméticos de membrana, sensores biológicos, miméticos de proteínas e fabricação de dispositivos.

Trabalhar com reagentes corrosivos, como trior, ácido acético e ácido bromoacético, é extremamente perigoso para evitar lesões, realizar todas as reações em uma capela e usar equipamento de proteção individual adequado.