Síntese e caracterização de 1,2-Ditiolano modificado peptídeos auto-montagem

À medida que as estruturas para aumentar a funcionalidade das estruturas supermoleculares crescem, esse método de incorporação de grupos 1, 2-ditiolano com peptídeos de automontagem pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre a reatividade em superfícies supermoleculares. A principal vantagem desta técnica é que o acoplamento e a desproteção da molécula precursora de 1,2-ditiolane ocorrem na resina com apenas uma única etapa de purificação do peptídeo modificado final. Como o tempo que leva para os conjuntos amadurecerem em suas estruturas supermoleculares finais varia, a demonstração visual dos métodos de caracterização e resultados para os conjuntos supermoleculares é crítica.

Para sintetizar o precursor do ditilano, primeiro dissolva um grama de ácido 3-bromo-2-propriônico em aproximadamente quatro mililitros de hidróxido de sódio de um molar em um balão de reação de fundo redondo de 50 mililitros a 55 graus Celsius com agitação. Quando todo o reagente estiver suspenso em solução, fechar o balão de reacção com um septo e colocá-lo sob atmosfera de azoto. Em seguida, adicione 1,49 gramas de tioacetato de potássio e três mililitros de ácido sulfúrico de dois molares a quatro mililitros de água deionizada para criar ácido tioacético in situ.

Aspire a solução de ácido tioacético em uma seringa plástica descartável de 10 mililitros e equipe a seringa com uma agulha de calibre 18, em seguida, perfure os septos com a agulha para adicionar a mistura gota a gota ao frasco de reação e continue a reação durante a noite a 55 graus Celsius. Na manhã seguinte, monitorar a reação por cromatografia em camada delgada em placas de sílica gel 60 F254 usando uma mistura de metanol e diclorometano e visualizando o progresso da reação pela coloração verde de bromocresol. Quando a reação completa esfriar à temperatura ambiente, acidifique a mistura com ácido sulfúrico de dois molares até um pH de um.

Um óleo amarelo deve se separar da solução, depois extrair o produto com três adições de 40 mililitros de clorofórmio frio e combinar as camadas orgânicas para secar sobre sulfato de magnésio, removendo o clorofórmio sob pressão reduzida. O produto deve ser um óleo amarelo com um rendimento total de 83% e pode ser usado sem purificação adicional. Para acoplar o precursor de ditiolano ao terminal N do peptídeo de resina, adicione quatro equivalentes de precursor de ditiolano a cinco mililitros de dimetilformamida, quatro equivalentes de HBTU e 10 equivalentes de DIPEA.

Deixe a mistura de acoplamento pré-ativar durante 10 minutos à temperatura ambiente antes de adicionar a amostra à seringa frita contendo resina N-terminal. Agitar a reacção de acoplamento durante duas horas, seguidas de três lavagens de cinco mililitros em dimetilformamida fresca e repetir a reacção de acoplamento e a agitação durante a noite. Após o segundo acoplamento, lave a resina com três lavagens de dimetilformamida de cinco mililitros seguidas de três lavagens de resina de diclorometano de cinco mililitros e transfira a resina seca para um tubo de reação de microondas de 10 mililitros.

Em seguida, para desproteger o grupo tioacetato do precursor N-terminal do ditiolano, adicione dois mililitros de dimetilformamida ao tubo. Deixe a resina inchar, adicione uma pequena barra de agitação magnética ao recipiente e ressuspenda a resina com agitação magnética de baixa velocidade. Após 15 minutos, adicione dois mililitros de hidróxido de amônio concentrado ao tubo, tampe o recipiente de reação com um septo de silicone e coloque o recipiente em um reator de micro-ondas por 45 minutos a 75 graus Celsius com agitação.

Quando a reação de micro-ondas estiver completa, transfira a resina para uma seringa limpa, descartável e frita e lave a resina com duas lavagens de dimetilformamida de cinco mililitros e duas lavagens de metanol de cinco mililitros. Após a última lavagem, adicione cinco mililitros de coquetel de clivagem à seringa contendo resina para uma incubação de 1 hora e meia com agitação suave em temperatura ambiente. Para preparar um mililitro de peptídeo bruto para cromatografia líquida de alta eficiência ou purificação por HPLC, adicione 400 microlitros de peptídeo concentrado em acetonitrila a 600 microlitros de água suplementada com 0,1% de ácido trifluoroacético e filtre a solução através de um filtro de seringa de 22 micrômetros em um frasco de HPLC.

Para purificar o peptídeo, use uma coluna semipreparativa C18 a uma taxa de fluxo de três mililitros por minuto em um gradiente linear de 15 a 55% de acetonitrila em 20 minutos com os detectores UV ajustados para 222 nanômetros e 330 nanômetros. Em seguida, colete e combine os picos de interesse. Para confirmação do produto peptídico por tempo de voo de dessorção/ionização a laser assistido por matriz ou espectrometria de massa MALDI-TOF, misture 0,5 microlitros do pico coletado em uma placa de dessorção/ionização a laser assistida por matriz contendo 0,5 microlitros de matriz de ácido 2,5-dihidroxibenzóico.

Para preparar uma solução de automontagem, dissolva um miligrama do pó de peptídeo liofilizado em uma mistura de 20% de acetonitrila e HEPES 10 milimolares em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro, depois vortex a solução de montagem e deixe a amostra montar em temperatura ambiente. Quando o conjunto peptídico atingir a maturação, seque de oito a 10 microlitros da solução de montagem como um filme fino no cristal de diamante de reflexão total atenuado e monitore o desaparecimento de um pico de água grande e largo de 1640 a 1631 centímetros inversos à medida que o filme seco se forma. Adquira espectros de fundo e infravermelho de 1500 a 1800 centímetros inversos, com média de 50 varreduras com uma resolução de dois centímetros inversos, subtraindo as varreduras de fundo antes de cada varredura de amostra.

A assinatura infravermelha para montagem de chapas beta deve ser observada como um pico agudo entre 1625 e 1635 centímetros inversos. Quando as amostras de peptídeos amadurecerem em estruturas supermoleculares ricas em folhas beta, carregue 10 microlitros da solução de montagem de peptídeos na superfície de uma grade de carbono de microscópio eletrônico de transmissão e permita que os conjuntos sejam adsorvidos na superfície da grade por um a dois minutos. Toque o papel de filtro na borda da grade para remover o excesso de amostra e adicione 10 microlitros de mancha de acetato de uranila a 2% recém-preparada na superfície da grade para uma incubação de dois a três minutos, em seguida, remova o excesso de mancha com papel de filtro e coloque a grade em um dessecador a vácuo durante a noite antes da imagem do dia seguinte por microscopia eletrônica de transmissão.

Além da síntese inicial de uma etapa da molécula precursora de ditilano, o restante da síntese do peptídeo modificado por 1, 2-ditioano ocorre em suporte sólido. A conversão do ácido 3-bromo-2-propriônico em ácido 3-2-propanóico, o precursor do ditilano, é confirmada por ressonância magnética nuclear de prótons e carbono-13 antes de ser acoplada à amina N-terminal livre de um peptídeo ainda na resina. Após a desproteção, o peptídeo bruto é purificado por HPLC de fase reversa e a massa do produto é confirmada por espectrometria de massa MALDI-TOF.

A espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier e dicroísmo circular pode ser usada para monitorar a automontagem do peptídeo 1,2-ditioano purificado em fibras amilóides maduras para caracterizar sua conformação de folha beta estendida. As fibras podem então ser visualizadas por microscopia eletrônica de transmissão. Embora esses métodos possam ser usados para modificar o terminal N de qualquer sequência de peptídeos ainda na resina, é importante lembrar que as condições de automontagem do peptídeo devem ser otimizadas para cada peptídeo.

Essas técnicas, que adicionam grupos 1,2-ditiolano a peptídeos de automontagem, permitirão que pesquisadores no campo de biomateriais explorem a reatividade da superfície supermolecular.