Imagem de cálcio funcional em desenvolvimento de redes Cortical

O objetivo geral deste filme é demonstrar como medir a atividade da rede a partir do desenvolvimento de fatias cerebrais corticais usando um indicador fluorescente sensível ao cálcio. As fatias cerebrais DY são feitas a partir do córtex enteral em desenvolvimento de um camundongo jovem. Tanto os neurônios quanto os astrócitos são carregados com marcadores dependentes de cálcio.

Mudanças na fluorescência de corantes dependentes de cálcio refletem mudanças na atividade celular. Células não neuronais, incluindo astrócitos, micróglia e células endoteliais, podem ser coradas usando corantes marcadores específicos. A atividade da rede cortical é registrada usando lapso de tempo As células de imagem multifotônica são detectadas dentro da rede, fazendo uma pilha 3D de imagens através da região de interesse.

Mudanças na fluorescência celular em várias células podem então ser analisadas para ler a atividade da rede cortical em desenvolvimento. Um padrão característico de atividade no sistema nervoso em desenvolvimento é a atividade espontânea da rede sincronizada. A atividade sincronizada foi observada em muitas regiões neuronais em desenvolvimento diferentes, incluindo córtex da medula espinhal intacto e preparações de cultura neuronal dissociadas durante períodos de neurônios de atividade espontânea, despolarizados ao fogo, picos únicos ou explosões de potenciais de ação ativando muitos canais de ferro, incluindo canais de cálcio dependentes de voltagem levando ao influxo de cálcio.

A atividade altamente sincronizada foi medida a partir de redes locais usando eletrodos de campo ou matrizes de vários eletrodos. Isso permite altas taxas de amostragem temporal, mas fornece menor resolução espacial devido à leitura integrada da atividade celular. A resolução da atividade neural de uma única célula é possível usando a eletrofisiologia do patch clamp de neurônios individuais para medir as taxas de disparo.

No entanto, a capacidade de medir a partir de uma rede é limitada ao número de neurônios corrigidos simultaneamente e normalmente é de apenas um ou dois neurônios. O uso de corantes indicadores fluorescentes dependentes de cálcio permitiu a medição da atividade sincronizada em uma rede de células. Essa técnica fornece alta resolução espacial e amostragem temporal suficiente para registrar a atividade espontânea da rede em desenvolvimento.

Indicadores fluorescentes sensíveis ao cálcio, como o éster URA 2:00 AM, contêm grupos de ácido carboxílico que são capazes de se ligar às minas de cálcio. Esses corantes fluorescentes são ativados por comprimentos de onda de luz específicos usando microscopia de um ou dois fótons. O número de fótons emitidos pelo corante é transitoriamente alterado após a ligação do cálcio.

Essa mudança no número de fótons ou fluorescência é relatada como o sinal delta FF e corresponde a uma mudança no nível de cálcio dentro do neurônio. A medição de mudanças nos indicadores sensíveis ao cálcio é uma medida de leitura útil dos padrões de atividade da rede em células em desenvolvimento. Olá, sou Rianna Morty, e meu nome é Julie Abbots.

Somos do Departamento de Neurofisiologia Interpretativa e da universidade de Amsterdã. Temos usado imagens de cálcio para estudar a atividade funcional no desenvolvimento de tecidos no córtex de camundongos usando indicadores sensíveis ao cálcio em imagens multifocais. O objetivo deste curta-metragem é demonstrar como esses métodos podem ser usados para medir padrões de atividade espontânea e evocativa em redes em desenvolvimento no sistema nervoso.

Remova o cérebro rapidamente do crânio de um camundongo jovem para reduzir os danos aos circuitos neurais. Disseque o cérebro em uma solução de fatia gelada. A solução em fatia contém cloreto de colina em vez do sódio comumente usado em A TSF para registros neuronais.

Nesses experimentos, estamos fazendo fatias de cérebro do córtex enteral do cérebro de camundongo em desenvolvimento. Coloque um pedaço de papel de filtro em cima de uma placa de petróleo e molhe com alguns mililitros de A TSF. Transfira o cérebro para o pedaço de papel de filtro.

Dividir os hemisférios usando uma lâmina de barbear de ponta única. Separe os dois hemisférios. Coloque um de volta na solução de fatia gelada com o hemisfério restante.

Remova o cerebelo com a lâmina de barbear. Vire um hemisfério em sua linha média e faça um corte de aproximadamente um milímetro da superfície dorsal com um ligeiro ângulo da lâmina em direção à extremidade rostral. Vire o cérebro para.

Sua superfície recentemente cortada usando um pássaro de algodão e uma espátula de metal. Transfira o cérebro para o bloco de corte de metal. Empurre suavemente o cérebro para fora da espátula com um pássaro de algodão para a superfície colada.

Fatias de 300 micrômetros de cérebro são cortadas para velocidades de corte de tecido jovem e a frequência da lâmina é normalmente mais lenta do que as usadas para tecidos mais maduros. Depois de cortado, transfira cada fatia usando uma pipeta de vidro As fatias são transferidas para a câmara de retenção, que contém A TSF oxigenado à temperatura ambiente. O A CSF contém uma proporção mais alta de magnésio para cálcio do que a solução A CSF.

Usado para gravar fatias são deixadas por uma hora para se recuperar. Para carregar as células com um indicador dependente de cálcio ou marcador específico da célula, as fatias precisam ser transferidas para uma câmara para o procedimento de coloração. Embora as câmaras comerciais estejam disponíveis, uma pode ser facilmente montada a partir de equipamentos de laboratório padrão por um custo muito baixo.

Para fazer uma câmara de coloração, você precisará do seguinte equipamento básico de laboratório, duas placas de Petri de plástico, uma seringa de 10 mililitros, uma seção de tubo de sílica, uma inserção de cultura de células com uma super cola de membrana semipermeável, três pequenos conectores de tubo e uma agulha de transporte fino. Pegue a placa de Petri grande e faça um pequeno orifício com uma haste aquecida na parede lateral. Pegue a pequena placa de Petri e faça um orifício de diâmetro de tamanho semelhante, grande o suficiente para a passagem do tubo de silicone.

Passe uma seção de tubo de silicone pelo orifício e forme um laço dentro do prato pequeno. Use super cola para selar a extremidade aberta da tubulação. Em seguida, cole o restante do tubo na parede interna da pequena placa de Petri.

Coloque a placa de Petri pequena no centro da grande e cole no lugar. Pegue a extremidade restante do tubo de silicone e passe-o pelo pequeno orifício na parede lateral da placa de Petri. Pegue uma agulha fina e faça pequenos furos no tubo de silicone dentro da placa de Petri.

Faça os furos em intervalos uniformemente espaçados para uma fusão uniforme. Faça uma cultura de células bem com uma membrana semipermeável usando um bisturi aquecido. Corte o centímetro superior do poço para deixar um prato raso para segurar as fatias durante a incubação.

Coloque o prato raso no centro do prato pequeno cercado pelo tubo de silicone poroso. Faça um furo de aproximadamente meio a um centímetro de diâmetro na tampa do prato grande. Pegue uma seringa de plástico de 10 mililitros usando um bisturi aquecido.

Faça um corte angular para remover a extremidade da seringa. Aplique super cola na superfície de corte do tubo da seringa. Cole-o diretamente sobre o orifício na tampa grande da placa de Petri.

Conecte um conector de tubo à extremidade da ponta da seringa. Coloque o prato raso no centro da pequena placa de Petri, certificando-se de que o tubo de gás poroso esteja ao redor do prato. Este tubo é então conectado a um suprimento de gás carbógeno para oxigenar as fatias.

Durante a incubação, recoloque a tampa do prato grande, que também é conectado diretamente ao suprimento de gás através da ponta da seringa. Isso trará um suprimento de carro e gás sobre as fatias durante a incubação para evitar o branqueamento do corante. Todos os procedimentos são realizados com o mínimo de luz possível, e tanto o corante quanto as fatias são mantidos no escuro.

Encha a câmara de coloração com aproximadamente um mililitro e meio de A TSF do porta-fatias. Coloque a câmara de interface dentro e encha com outro mililitro de A TSF. É importante manter um bom suprimento de oxigênio para manter o tecido saudável e para uma boa carga da fatia.

A coloração ocorre a cerca de 35 graus C para facilitar a absorção do corante nos neurônios enquanto a câmara de coloração está aquecendo. Prepare o corante indicador para fira 2:00 AM Ester. Adicione nove microlitros de DMSO com um microlitro de ácido cônico a um frasco de 50 microgramas.

DMSO e ácido cônico. Atuam como agentes permanentes para permitir que o corante seja absorvido pela membrana lipídica. Vortex o frasco para injetáveis durante 15 minutos para garantir que o corante está completamente dissolvido.

Para coloração, transfira cada fatia para a interface. Insira na câmara de coloração. Acaricie o corante diretamente na região de interesse acima das fatias, feche a tampa da câmara de coloração.

Deixe as fatias incubadas no escuro por 20 a 40 minutos, dependendo da idade dos maus usados. Após a incubação, transfira as fatias de volta para o suporte da fatia para lavar o excesso de corante restante. Os protocolos de coloração para imagens de cálcio também podem ser adaptados para tecidos mais antigos.

Isso requer uma etapa adicional de pré-incubação. Transfira as fatias velhas para um prato raso de pré-incubação cheio de três mililitros de LCR e oito microlitros de solução crema four a 0,5% Aqueça a 35 graus C por três minutos. Em seguida, transfira as fatias para a interface, insira na câmara de coloração e siga os procedimentos normais de coloração.

Também é possível corar essas fatias para células não neuronais, ou seja, astrócitos, microglia e células endoteliais. A rumina de enxofre 1 0 1 pode ser usada para corar astrócitos para domina de enxofre. Faça uma solução de pipeta micromolar de 10 micromolares o corante roxo sobre a região de interesse nas fatias.

Deixar incubar durante um período de 15 minutos. Transfira as fatias de volta para a câmara de retenção para remover o excesso de corante. O conjugado FSE da lectina do tomate pode corar para microglia e células endoteliais.

Para a lectina do tomate, faça uma solução de 20 microgramas por mililitro. Acaricie o corante sobre a região de interesse nas fatias. Deixe as fatias incubarem por um período de 45 minutos.

Em seguida, transfira as fatias de volta para a câmara de retenção. Durante a imagem, as fatias precisam ser estáveis ao microscópio. Normalmente, uma harpa de metal é colocada para segurar o tecido, no entanto, ela pode distorcer de forma desigual a superfície da fatia, dando apenas um campo de visão limitado em foco para evitar a imagem.

Essas fatias são coladas à câmara de gravação usando solução de POLIETILINA ou PEI. O PEI é um polímero usado para aumentar a fixação das células a uma superfície por pelo menos uma hora. Antes de colocar as fatias nas câmaras de registro, encha essas câmaras com alguns mililitros de solução de PEI para cobrir o piso da câmara.

Em primeiro lugar, enxágue o PEI da câmara com água destilada, seguido por uma solução de LCR trans. Transfira uma fatia para a câmara de registro e remova o excesso de solução de LCR A. Posicione a fatia no meio da câmara usando um pincel fino.

Remova todo o LCR A usando pequenos pedaços de papel de filtro absorvente. Tome cuidado para garantir que a fatia não tenha mais A CSF em torno de suas bordas. Finalmente, acaricie meio mililitro de A CSF suavemente na fatia sem soltá-la da câmara.

Coloque as câmaras em um grande recipiente de interface oxigenado e deixe por mais uma hora no escuro. As alterações nos corantes indicadores sensíveis ao cálcio podem ser registradas com microscopia de um ou dois fótons. Usamos um laser de safira de titânio acoplado a um microscópio Olympus para permitir a imagem de dois fótons em nossas redes neuronais.

Além disso, usamos um sistema de escopo de acabamento de biotecnologia L Vision com uma câmera MATSU de martelo EM CCD para aumentar as taxas de varredura de quadros. Posicione a câmara de fatia sob o microscópio com um fluxo estável de A-T-S-F-A-T-S-F oxigenado contendo 1.6 milimolar de cálcio e 1.5 milimolar. O magnésio é aquecido a aproximadamente 30 graus C na configuração usando luz branca.

Localize a região de interesse na fatia e concentre-se na superfície. Apague as luzes e feche a porta do gabinete de gravação. Para reduzir os níveis de luz de fundo.

Muitos pacotes de software comerciais ou abertos diferentes estão disponíveis para gravar e analisar imagens Em nosso laboratório, usamos software inspetor para aquisição da Lavis Biotech. Para iniciar a geração de imagens, selecione o modo de câmera CCD para detecção. Defina o comprimento de onda relevante para o seu indicador.

Para fira 2:00 AM Ester, definimos a excitação para 820 nanômetros no software do escopo de compensação. Selecione o modo de digitalização 64 B. Escolha o tamanho ideal, campo de visão e resolução de pixels para sua região de interesse.

Selecione uma taxa de quadros e rotação de pixels apropriadas, se necessário, para a amostragem da imagem. Abra o obturador do laser pronto para imagens contínuas. Usando o modo de imagem contínua.

Ajuste o ganho e a intensidade do laser e concentre-se na rede neuronal que deseja visualizar. Pare a verificação. Selecione as configurações de lapso de tempo para taxa de quadros e duração da sequência.

Após a imagem de lapso de tempo, faça uma pilha Z de imagens marcando 20 mícrons acima e 20 mícrons abaixo em etapas de um mícron. Essa pilha Z é usada para detecção de células durante a análise. Exporte os arquivos gravados como uma pilha de imagens TIFF.

Para concluir, mostramos o uso de indicadores de cálcio para medir a atividade espontânea síncrona da rede no córtex em desenvolvimento. Mais detalhes sobre a metodologia e os reagentes podem ser encontrados nas folhas de dados que acompanham este filme para permitir que você configure a técnica em seu próprio laboratório.