Site-specific Engenharia cromossomo bacteriano: ΦC31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

Um método rápido e eficiente para integrar DNA estranho de juros em cepas pré-fabricados receptoras, chamadas de tensões almofada de aterragem, é descrito. O método permite site-specific integração de uma cassete de ADN no locus engenharia aterragem almofada de uma estirpe dada, por meio de conjugação e expressão da integrase ΦC31.

O objetivo geral do experimento a seguir é integrar uma construção de DNA desejada no cromossomo bacteriano em um locus predeterminado. Isso é conseguido por um protocolo de acasalamento envolvendo quatro cepas bacterianas projetadas. A cepa receptora tem uma sequência de plataforma de pouso que consiste em um gene de resistência à micina e o gene da beta glucuronidase e coli flanqueado por sítios de ATP integrados em seu cromossomo.

A cepa de doador P JH one 10 carrega um plasmídeo contendo nos sítios B flanqueando um gene de proteína fluorescente vermelha mais enchedor e um gene de resistência a antibióticos. A cepa de dois doadores PJC carrega um plasmídeo contendo a integrase específica do local do fago C 31 de streptomyces sob o controle do promotor LAC. A quarta cepa MT 616 fornece os genes de transferência necessários para a conjugação da transferência de plasmídeos de célula para célula, resultando na criação de trans através das cepas receptoras.

Aquisição dos dois plasmídeos necessários para a troca de mediada por integrase. A troca do doador do plasmídeo PJ H one 10 com os marcadores do da plataforma de pouso no cromossomo resulta na perda dos marcadores da plataforma de pouso, SPR e UIDA e na manutenção do doador RFP e GMR no imigrante trans resultante. A principal vantagem dessa técnica sobre outros métodos, como a recombinação homóloga, é a facilidade e a eficiência do protocolo.

Também é transferível para uma gama diversificada de bactérias. A cepa aceptora usada neste vídeo é uma cepa S milli latte dois dias antes do procedimento de acasalamento para a criação de integrinas trans inocular de uma única colônia em cinco mililitros de meio TY com spect micina incubar a cepa S milli a 30 graus Celsius por dois dias com agitação no dia anterior ao procedimento de acasalamento inocular cada uma das seguintes cepas de e coli em cinco mililitros de meio líquido LB suplementado com o antibiótico apropriado DH cinco alfa contendo o plasmídeo de expressão de integrase em meio com tetraciclina MT 616, o mobilizador intermediário com cloranfenicol e DH cinco alfa contendo o plasmídeo doador em meio com gentamicina, incubar as três cepas de E Coli durante a noite a 37 graus Celsius com agitação constante para preparar as células para o procedimento de acasalamento. Transfira 1,5 mililitros de cada uma das quatro culturas para um tubo e centrifugue a 17.000 vezes G por 30 segundos para coletar o pellet celular, descarte o meio e ressuspenda cada pellet celular em um mililitro de cloreto de sódio estéril a 0,85% centrifugue os tubos novamente após descartar o sobrenadante Resus suspenda cada pellet em 100 microlitros de cloreto de sódio estéril a 0,85% usando uma pipeta individualmente localize 10 microlitros de cultura lavada para cada coe em uma placa de ágar TY simples.

Esses pontos são pontos de controle. Em seguida, adicione 40 microlitros de cada cepa, excluindo a e coli DH cinco alfa contendo Pjc dois em um tubo estéril e misturado por pipetagem para cima e para baixo coloque 120 microlitros dessa mistura na placa de ágar TY simples. Este ponto é o controle negativo sem integrase.

Finalmente, adicione 40 microlitros de cada uma das quatro cepas em uma mistura de tubo estéril e localize. 160 microlitros desta mistura na mesma placa de ágar TDY. Este ponto é o ponto de acoplamento de troca de mediado por integrase.

Coloque a placa em uma capela de fluxo laminar e deixe as manchas secarem por cerca de 20 minutos depois disso. Sele a placa e incube a 30 graus Celsius durante a noite no dia seguinte à sequência do protocolo de acasalamento. Os dois pontos de controle e o ponto de acasalamento do IMCE em placas de ágar TY suplementadas com estreptomicina e gentamicina.

A cepa aceptora S milli carrega uma mutação que confere alto nível de resistência à estreptomicina para o cálculo da eficiência do IMCE Resus suspende aproximadamente um quarto do local de acasalamento do IMCE em 500 microlitros de cloreto de sódio estéril a 0,85% faz diluições seriais dez vezes maiores para 10 para a sétima placa negativa As diluições tendem para os negativos de dois a 10 para os cinco negativos em placas de ágar TY suplementadas com estreptomicina, gentamicina e xgl para selecionar imigrantes trans. As diluições da placa tendem a ser de três a 10 negativos a sete negativos em placas de ágar TY, suplementadas com estreptomicina e xgl para selecionar tanto para imigrantes trans quanto para destinatários em potencial. O total de receptores do IE incuba placas a 30 graus Celsius por três dias.

Veja o trans RFP sob luz verde e através de um filtro vermelho calcule a eficiência percentual do IMCE como UFC de imigrantes trans em comparação com a UFC do total de destinatários, aproximadamente metade dos trans terá sido submetido a uma troca verdadeira, tornando-os brancos e insensíveis após três dias de incubação em Ty suplementado com estreptomicina e gentamicina, não deve haver crescimento nas seguintes cepas de controle, nenhum controle integrase s milli latte UW 2 27 controle e coli MT 616 controle e coli DH cinco alfa contendo P JH um 10 controle e e coli DH cinco alfa contendo PJC dois controle. Em contraste, a faixa IMCE do local de acasalamento deve ter crescimento confluente na faixa da cabeça e muitas colônias na segunda linha. As próximas duas imagens mostram suspensões de 10 a menos duas diluições do local de acasalamento no ágar TY estreptomicina xgl e no ágar TY estreptomicina Gentamicina xgl no ágar TY estreptomicina Gentamicina xgl.

As colônias azuis são recombinantes simples. Enquanto as colônias brancas são integrinas trans que sofreram verdadeira troca de quando vistas sob luz verde e através de um filtro vermelho, a tendência para a diluição negativa de duas da suspensão resus do ponto de acasalamento no ágar TY strept cin xgl carece de fluorescência. Em contraste, a diluição de 10 a menos dois da suspensão resus do ponto de acasalamento em Ty estreptomicina Gentamicina Xgl Agar mostra dois níveis de fluorescência.

As colônias mais brilhantes correspondem às colônias azuis e têm maior expressão de RFP, presumivelmente devido à promoção de uma leitura do promotor LAC no vetor. As colônias menos brilhantes correspondem a colônias brancas, que passaram por uma verdadeira troca de e contêm RFP apenas com seu promotor imediato e sem leitura do promotor LAC. Esses imigrantes de tendências também devem ser sensíveis à micina.

A eficiência da integração trans expressa como a porcentagem de imigrantes trans em relação ao total de destinatários deve estar na faixa de 0,5%Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar a conjugação bacteriana usando nossas cepas projetadas para inserir construções de DNA no cromossomo bacteriano.