Site-specific Engenharia cromossomo bacteriano: ΦC31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

O objetivo geral do experimento a seguir é integrar uma construção de DNA desejada no cromossomo bacteriano em um locus predeterminado. Isso é alcançado por meio de um protocolo de conjugação envolvendo quatro cepas bacterianas modificadas. A cepa receptora possui uma sequência de integração composta por um gene de resistência à espetinomicina e ao beta-glucuronidase da e coli, flanqueado por sítios ATP, integrado ao seu cromossomo.

A linhagem doadora P JH um 10 carrega um plasmídeo contendo sítios B que flanqueiam um gene repórter de proteína fluorescente vermelha e um gene de resistência a antibióticos. A linhagem doadora PJC dois carrega um plasmídeo contendo a integrase específica de sítio do fago Streptomyces C 31 sob controle do promotor LAC. A quarta linhagem, MT 616, fornece os genes de transferência necessários para a conjugação, a transferência de plasmídeos de célula para célula, resultando na criação de trans através das linhagens receptoras.

Aquisição dos dois plasmídeos necessários para a troca mediada por integrase de cassetes. A troca do cassette doador do plasmídeo PJ H one 10 com os marcadores do cassette de local de integração no cromossomo resulta na perda dos marcadores do local de integração, SPR e UIDA, e na manutenção dos marcadores do cassette doador, RFP e GMR, no transimigrante resultante. A principal vantagem desta técnica em relação a outros métodos, como a recombinação homóloga, é a facilidade e eficiência do protocolo.

Ele também é transferível para uma ampla gama de bactérias. A cepa receptora utilizada neste vídeo é uma cepa de S milli latte preparada dois dias antes do procedimento de conjugação; inocular a partir de uma única colônia em cinco mililitros de meio TY com espectinomicina. Incubar a cepa de S milli a 30 graus Celsius por dois dias com agitação, no dia anterior ao procedimento de conjugação, inocular cada uma das seguintes cepas de E. coli em cinco mililitros de meio líquido LB suplementado com o antibiótico apropriado: DH5α contendo o plasmídeo de expressão da integrase no meio com tetraciclina, MT616, o mobilizador intermediário com cloranfenicol e DH5α contendo o plasmídeo do cassete doador no meio com gentamicina. Incubar as três cepas de E. coli durante a noite a 37 graus Celsius com agitação constante para preparar as células para o procedimento de conjugação. Transferir 1,5 mililitro de cada uma das quatro culturas para um tubo e centrifugar a 17.000 × g por 30 segundos para recolher o pellet celular, descartar o meio e ressuspender cada pellet celular em um mililitro de cloreto de sódio estéril a 0,85%. Centrifugar novamente os tubos após descartar o sobrenadante e ressuspender cada pellet em 100 microlitros de cloreto de sódio estéril a 0,85% utilizando uma pipeta. Aplicar individualmente 10 microlitros da cultura lavada de cada cepa em uma placa de ágar TY simples.

Esses pontos são pontos de controle. Em seguida, adicione 40 microlitros de cada cepa, exceto a E. coli DH5α contendo o Pjc2, em um tubo estéril e misture pipetando para cima e para baixo. Coloque 120 microlitros dessa mistura na placa de ágar TY comum. Este ponto é o controle negativo sem integrase.

Por fim, adicione 40 microlitros de cada uma das quatro cepas em um tubo estéril, misture e aliqueote 160 microlitros dessa mistura na mesma placa de ágar TDY. Esta alíquota é o ponto de cruzamento por troca de cassete mediado por integrase.

Coloque a placa em uma cabine de fluxo laminar e deixe as colônias secarem por cerca de 20 minutos após isso. Sobreponha a placa e incube a 30 graus Celsius durante a noite no dia seguinte ao streak do protocolo de cruzamento. Os dois pontos de controle e o ponto de cruzamento IMCE em placas de ágar TY suplementadas com estreptomicina e gentamicina.

A linhagem receptora S milli possui uma mutação que confere resistência de alto nível à estreptomicina, para cálculo da eficiência IMCE. Re-suspenda aproximadamente um quarto do ponto de conjugação IMCE em 500 microlitros de cloreto de sódio estéril 0,85%. Faça diluições seriadas de dez vezes até 10 à potência negativa sete. Plaque as diluições da negativa dois até 10 à potência negativa cinco em placas de ágar TY suplementadas com estreptomicina, gentamicina e xgl para seleção de transimigrantes. Plaque as diluições da negativa três até 10 à potência negativa sete em placas de ágar TY suplementadas com estreptomicina e xgl para seleção de transimigrantes e possíveis receptores. Incube as placas com os receptores totais a 30 graus Celsius por três dias.

Visualize a fluorescência RFP sob luz verde e através de um filtro vermelho e calcule a eficiência percentual do IMCE como o número de UFC dos imigrantes transfectados em comparação com o número de UFC dos receptores totais. Aproximadamente metade dos transfectados terá realizado uma troca verdadeira, tornando-se brancos e insensíveis após três dias de incubação em meio Ty suplementado com estreptomicina e gentamicina. Não deve haver crescimento nas seguintes cepas-controle: controle sem integrase s. millilata UW227, controle E. coli MT616, controle E. coli DH5α contendo PJH110 e controle E. coli DH5α contendo PJH2. Em contraste, o streak do IMCE proveniente do ponto de conjugação deve apresentar crescimento confluente no primeiro streak e muitas colônias no segundo streak. Essas duas próximas imagens mostram suspensões ressuspendidas de uma diluição 10 elevado a menos dois do ponto de conjugação em ágar TY com estreptomicina e X-gal, e em ágar TY com estreptomicina, gentamicina e X-gal.

As colônias azuis são recombinantes simples. Enquanto as colônias brancas são transintegrinas que sofreram troca verdadeira de cassete quando visualizadas sob luz verde e através de filtro vermelho, elas tendem a apresentar ausência de fluorescência no spot de acasalamento da suspensão ressuspendida na diluição negativa dois em ágar TY strept cin xgl. Em contraste, a diluição 10 elevado a menos dois da suspensão ressuspendida do spot de acasalamento em ágar Ty estreptomicina Gentamicina Xgl mostra dois níveis de fluorescência.

As colônias mais brilhantes correspondem às colônias azuis e apresentam maior expressão de RFP, presumivelmente devido à leitura atravessada a partir do promotor LAC no vetor. As colônias menos brilhantes correspondem às colônias brancas, que sofreram troca verdadeira do cassete e contêm RFP com apenas seu promotor imediato e sem leitura atravessada do promotor LAC. Essas tendências indicam que os imigrantes também devem ser sensíveis à espetomicina.

A eficiência da integração em trans, expressa como a porcentagem de imigrantes em trans em relação ao total de receptores, deve estar na faixa de 0,5%. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar a conjugação bacteriana, empregando nossas cepas modificadas, para inserir construtos de DNA no cromossomo bacteriano.