Name: Procedimento para a Engenharia de pulmão (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 50 s
Description: Aprenda a engenharia de tecido pulmonar funcional usando matriz extracelular descelularizada e biorreator biomimético. Este método permite troca gasosa eficaz em transplantes in vivo para medicina regenerativa.

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Agradecemos a Maegan B. Colehour para ajudar com o desenvolvimento de biorreatores. Estes estudos foram financiados pela Yale University Departamento de Anestesia e pelo NIH conceder HL 098220 (para LEN). THP foi apoiado pelo NIH T32 GM007171.

1. Biorreator Assembléia Figura detalhada (s) do projeto de biorreatores e montagem tanto para decelularização e cultura são fornecidos nas Figuras 1 e 2, respectivamente. Todos os componentes devem ser esterilizados antes da montagem do biorreator. Os seguintes pontos específicos são observados: CONEXÕES: <ol><li> A cânula arterial é composto por um encaixe luer-lock ligado a um Y-divisor por um pequeno segmento de tubulação. O conector luer-lock está ligado ao tubo de perfusão, eo segmento do Y que não é suturada com a artéria pulmonar é conectado a uma válvula unidirecional. A válvula unidirecional é orientada de modo fluido que pode ser retirado para a tubulação (na direção oposta, como perfusão), mas durante toda a perfusão dos órgãos médio flui para o pulmão. </li><li> A cânula traqueal também consiste de um conector luer-lock ligado a um Y-divisor com tubulação. O luer-lock se conecta a um circuito de respiração entre o reservatório de traquéia e da câmara principal. O segmento do conector Y que não é suturado à traquéia também é conectado a uma válvula unidirecional. A válvula unidirecional é orientada da mesma forma como a cânula arterial. </li></ol> FUNÇÕES: <ol start="3"><li> As válvulas de sentido único nas cânulas arterial e traqueais são utilizados para limpar as bolhas de ar na tubulação, permitindo a inversão do fluxo na tubulação e, portanto, permitir bolhas de ar a ser removido. </li><li> O "loop respiração" inclui duas válvulas de sentido único, posicionado como meio que segue um caminho diferente dentro e fora do pulmão. Uma descrição mais detalhada desta funcionalidade é fornecida em uma publicação prévia do nosso 2 laboratório. </li><li> Perfusão vascular é fornecido utilizando uma bomba de rolete. Medium é perfundido na artéria pulmonar através da cânula em anexo, flui através da vasculatura pulmonar e as veias pulmonares diretamente no biorreator principal, onde meio é elaborado para perfusão. </li></ol> 2. Colheita de órgãos <ol><li> Euthanize adultos (3-6 meses de idade) ratos Fischer 344 por overdose de sódio pentobarbital, de acordo com diretrizes estabelecidas pela American Veterinary Medical Association (60 IP mg / kg). Nota: a solução pentobarbital inclui heparina de 100 unidades / ml para a anticoagulação. </li><li> Spray ou limpar o peito e abdômen com álcool 70%. </li><li> Abrir a cavidade torácica, expondo o coração e os pulmões, tomando cuidado para não danificar os pulmões. Fazer com cuidado uma pequena janela através do diafragma na cavidade torácica, causando os pulmões para retrair e expanda esta incisão horizontal para expor as bases dos pulmões. Faça duas incisões verticalmente através das costelas, e retrair a caixa torácica para expor o coração e os pulmões. </li><li> Preparar um sistema de perfusão gravidade, ou seja, utilizando uma seringa com êmbolo removido, uma torneira de 3 vias, e ~ 20 centímetros de tubo com um 1.5inch, agulha 21 gauge. Manter a seringa em ~ 20 centímetros acima do animal usando um suporte de anel. Assegurar que todo o ar é retirado o tubo de perfusão. </li><li> Corte o átrio direito para drenar sangue, impedindo-a de volta para os pulmões. Corte o átrio esquerdo para permitir a drenagem fácil de sangue e perfusato dos pulmões também pode ser útil, mas não é necessário. </li><li> Inserir a agulha na base do ventrículo direito e abra a torneira para perfundir os pulmões com uma solução de heparina e nitroprussiato de sódio (50U/ml e 1ug/ml, respectivamente) em PBS. Confirmar que a artéria pulmonar se enche com líquido de perfusão, e que o sangue é clearing dos pulmões. Se necessário, encher a seringa com líquido de perfusão adicional. Normalmente apenas 10ml ~ é necessária. </li><li> Continue perfusão até que os pulmões são claras de sangue, então pare de perfusão. </li><li> Dissecar o livre traquéia, até no pescoço, tanto quanto possível. Garantir a traquéia é separado do esôfago. Dissecar todas as conexões restantes para o coração, pulmões e traquéia, e remover em bloco. </li><li> Usando uma tesoura bisturi ou afiada, corte o ápice do coração, expondo os ventrículos direito e esquerdo. </li><li> Canular o tronco pulmonar através do ventrículo direito, e sutura no local. Remova qualquer excesso de tecido ventricular esquerda. </li><li> Canular a traquéia e sutura no local. Certifique-se que ambas as cânulas traqueais e pulmonares arterial estão posicionados de tal forma que não há força de torção na traqueia, pulmões ou grandes vasos (Figura 1). </li><li> Garantir que não há bolhas de ar na cânula arterial, uma vez que as bolhas de ar presas no sistema pode impedir o fluxo constante de através do órgão. Em alguns casos, uma bolha de ar pode parar completamente flow.To fluido conseguir isso, coloque o bloco do coração / pulmão em um frasco contendo PBS. Use uma seringa com agulha para injetar uma pequena quantidade de PBS para a cânula de coração para expulsar as bolhas. </li><li> Lavagem das vias respiratórias com PBS 4-5 vezes, para remover o ar, tanto quanto possível do pulmão. </li><li> Após o passo lavagems são completos, inflar o pulmão com PBS contendo nitroprussiato de sódio (SNP) em 1ug/ml. Coloque uma rolha na cânula traqueal, para que a solução permanece no pulmão. Permitir que o pulmão para incubar por até 30 minutos, a mesma solução flui através da vasculatura através da artéria pulmonar, para permitir a vasodilatação. </li><li> Conectar coração / pulmões para uma tampa de biorreator utilizando as conexões luer-lock ligado ao cânulas em forma de Y, descrito em "Assembléia biorreator" acima. (Figura 1). </li></ol> 3. Decelularização órgão <ol><li> Conecte a tampa (com pulmões ligados) aos aparelhos decelularização (Figura 1). A cânula da artéria pulmonar deve ligar para a linha de perfusão, ea cânula traqueal deve free float. Assegurar que todas as linhas são claras de ar. Como descrito acima, de ar nas linhas podem ser uma fonte de decelularização pobres, impedindo o fluxo de fluido decllularization. Ar preso no sistema pode também persistem no tempo da cultura, quando pode ter um impacto negativo sobre a sobrevivência da célula 3. </li><li> Inflar o pulmão com PBS / SNP até os pulmões estão cheios, mas não exageradas. Imediatamente tampa da cânula traqueal, para que o pulmão permanece inflado. </li><li> Perfundir pulmão com PBS / SNP por pelo menos 15 min a ~ 15 mmHg (20cm H 2 O de pressão). Depois de 15min ou mais, retire a tampa da cânula traqueal para permitir que o pulmão esvaziar. </li><li> Continue a perfusão com PBS / SNP por 30min. Se necessário, recarga PBS / SNP para garantir a pressão de perfusão é mantida em 10-15 mmHg. </li><li> Começar a perfusão com solução decelularização (CHAPS 8mm, 1M NaCl, 25mM EDTA em 1X PBS). Tome cuidado para garantir que todas as linhas são claras de ar. Um sistema de vácuo pode ser útil para fornecer sucção. </li></ol> Perfundir com solução decelularização até 500ml de solução tem perfundidos através do pulmão. Pressão ideal é &lt;15 mmHg (~ 20 cm H 2 O). Isso normalmente requer 2,5 horas. Taxas de fluxo são normalmente muito lento (0.2-0.5ml/minute) inicialmente, e aumentar rapidamente durante a segunda hora para cerca de 1ml/minute ou superior. Periodicamente, remover o líquido decelularização usado de biorreator, garantindo bastante líquido continua a apoiar o pulmão e cânula traqueal. 4. Órgão de lavagem e esterilização <ol><li> Transferência de pulmão e biorreator para uma capa de cultura de tecidos. Começar a lavagem com PBS estéril, removendo o frasco de 500ml que continha o líquido decelularização e substituir por um frasco estéril contendo até 1L de PBS estéril. Use sucção a vácuo para garantir linhas são claras de ar. </li><li> Perfundir PBS através da vasculatura de 15/10 mmHg, da mesma maneira como para decelularização. Periodicamente, remova os resíduos de PBS biorreator e substituir e / ou encher o frasco com PBS fresco, PBS estéril. É aconselhável o uso de técnica estéril. </li><li> Continuar a enxaguar até pelo menos 2,5 L de PBS estéril têm perfundidos no pulmão. </li><li> Transferência de pulmão para um novo sistema de biorreator, estéril, contendo PBS fresco. Assegurar que tanto o ciclo inteiro de perfusão e as linhas das vias aéreas todo são preenchidos com fluido. Todas as etapas subseqüentes será usar uma bomba pulsátil para perfundir pulmões na 5ml/min. </li><li> Esterilizar o cadafalso, quer através de perfusão durante a noite com PBS + 10% FBS + 10% de solução caneta strep ou por 3 horas com 0,1% de ácido peracético em PBS. Este último vai exigir a lavagem do pulmão com 3 mudanças de 250ml PBS durante várias horas para remover o ácido residual. Para cada lavagem, o pulmão deve ser ventilado, bem como perfundidos para garantir que todas as partes do tecido fiquem completamente lavados. </li><li> Transferência do pulmão para a 37 ° C incubadora e perfundir com PBS que tem 10% de SFB e 10% de penicilina / estreptomicina por ~ 1h ou até que a temperatura é equilibrado, em preparação para o tratamento benzonase. </li><li> Tratar de pulmão com benzonase para remover DNA remanescente: <ol><li> Aquecer o tampão benzonase (ver Tabela de Reagentes) a 37 ° C. </li><li> Para cada pulmão, encha uma seringa de 10 ml com tampão benzonase apenas e uma seringa de 10 ml com benzonase 90U/ml no buffer. </li><li> Parar perfusão do pulmão. </li><li> Inflar as vias aéreas com tampão benzonase. </li><li> Permitir que o pulmão esvaziar (por ~ 1 minuto). Então, encha o pulmão com a solução benzonase. Durante a inflação com tampão benzonase &amp; benzonase, para tentar evitar qualquer injeção de ar no pulmão. </li><li> Permitir que o pulmão se sentar sem perfusão ou ventilação a 37 ° C durante 1 hora após inflável com benzonase. </li></ol></li><li> Retomar a perfusão com o PBS + 10% FBS, 10% de penicilina / estreptomicina que já está no biorreator, e continuam durante a noite. No dia seguinte, o pulmão pode ser armazenado a 4 ° C (por até 3 meses) ou preparados para a semeadura de células. </li><li> Para preparar o andaime para repovoamento celular, substituir o PBS / SBF / benzonase solução com ~ 250ml de meio de cultura. Perfundir por pelo menos uma hora antes de as células são introduzidas, umand substituir com meio de cultura fresco directamente antes de as células semeadura. </li></ol> 5. Recellularization A escolha da fonte de células para reseeding órgão é deixada para os investigadores individuais. Muitas fontes de células podem ser utilizadas, incluindo as populações disponíveis comercialmente, recém-isoladas neonatal ou fetal células pulmonares, células-tronco embrionárias, ou fontes de células disponíveis comercialmente. Protocolos de isolamento específico para estas populações de células pode ser encontrada em outros lugares 4,5,6. Aqui, nós fornecemos instruções sobre como semente de ambas as populações de células endoteliais e epiteliais. Semeadura endotelial: <ol><li> Prepare uma suspensão de população de células endoteliais desejado, em meio de cultura apropriado. Suspensão de células do filtro através de um filtro para remover células 40um aglomerados de células. A semeadura típico endotelial em nosso laboratório poderia utilizar cerca de 30 milhões de pulmão de ratos células endoteliais microvasculares em 60ml de meio de cultura. </li><li> Dispense suspensão de células em um pequeno reservatório temporariamente incorporadas ao circuito de perfusão do biorreator (Figura 2). Garantir que a tubulação a partir deste reservatório e do laço de perfusão inteiro é claro de bolhas de ar. </li><li> Infundir células na artéria pulmonar em 3ml/min usando uma bomba de rolete. </li><li> Após a infusão de células, continue perfusão com meio recirculado do biorreator principal na taxa desejada. </li><li> Em uma base diária, garantir que o tubo de perfusão é claro de bolhas de ar. </li><li> Médio deve ser substituído por meio fresco regularmente, o que muitas vezes é feito a cada 3-4 dias. </li></ol> Semeadura epiteliais: <ol><li> Prepare uma suspensão de células da população de células epiteliais desejado. Em nosso laboratório, isso normalmente é composto por cerca de 5-10 células de rato neonatal pulmonar. Filtrar a população através de peneira de células 40um e suspender em 15ml de meio de cultura em uma seringa. Encher o reservatório das vias aéreas com 80ml de meio de cultura. </li><li> Coloque o biorreator de 37 ° C a cultura de tecidos incubadora, e ligar a bomba de seringa para ventilação. Assegurar que todas as linhas de ventilação são claras de ar. <ol><li> Semente das células para o pulmão através da injeção de 15ml de suspensão celular como um bolus único na cânula traqueal. </li><li> Começar imediatamente uma respiração única e lenta usando a bomba de seringa. Esta respiração é administrado pela retirada de 60ml de ar do biorreator principal no 3ml/minute, portanto, com duração de aproximadamente 20 minutos. Garantir os filtros de ar no biorreator principais são tampados imediatamente após a injeção da suspensão celular e antes de começar a respiração lenta. </li></ol></li><li> Permitir que os pulmões para sentar-se estaticamente por cerca de 18hrs, e então começar a perfusão vascular lento (aproximadamente 0,5 ml / min). </li></ol> 6. Cultura de órgãos Embora os detalhes da perfusão e ventilação varia de acordo com desenho experimental, os seguintes pontos são observados: <ol><li> Durante a cultura endotelial, a perfusão é tipicamente realizada em 1-3 ml / min usando uma bomba de rolete. Durante a cultura epitelial, a ventilação é geralmente fornecida a uma taxa contínua de uma respiração por minuto usando uma bomba de seringa. Retirada de 5 10ml de ar do biorreator principal é normalmente necessário para efetuar a ventilação pulmonar em um volume normal de maré. Devido à necessidade de manter o hermético biorreator durante a ventilação, a ventilação deve ser pausada diária e do ar na câmara principal deve ser trocada. Todo o ar no sistema é ar ambiente, que é aproximadamente 21% de oxigênio por pressão parcial. A retirada 5 10ml de ar do biorreator (que induz uma inspiração 5-10ml de fluido pelo pulmão) é baseado no tamanho do pulmão e quantos lobos estão sendo cultivados (lobos pode ser amarrado para análise, enquanto o lobos restantes continuam na cultura). A quantidade de ar retirado pela bomba de seringa é escolhido para aproximar o "volume corrente" do pulmão cultivadas. </li><li> Médio deve ser alterado aproximadamente a cada 3-4 dias durante a cultura. </li><li> Durante a co-cultura do epitélio e endotélio, as experiências em nossa semente de laboratório primeiro tipicamente o epitélio por 4-8 dias, durante os quais o da engenharia de tecidos é ventilado. O endotélio é então semeado através de perfusão, após o qual o tecido é tanto perfundidos e ventilado. </li></ol> 7. Resultados representativos: Decelularização Quando o protocolo é realizado corretamente, os pulmões recém-extraídos deve segurar o ar, sem vazamento. Inflando-os com ar ao mesmo tempo submerso em líquido pode verificar isso - não deve haver quaisquer bolhas, indicando vazamento de ar. A decelularização subseqüentes devem permitir ~ 500ml de líquido decelularização a fluir através dos pulmões ao longo de 2,5 - 3 horas a 37 ° C, e PBS deve finalmente ser capaz de fluir através dos pulmões em cerca de 10 ml / min (em ~ 15 mm Hg de pressão hidrostática) no final da lavagem. Após o tratamento com 0,1% de ácido peracético e benzonase, os pulmões podem ser armazenados a 4 ° C por até 3 meses, e ainda permanecem adequados para recellularization. A matriz extracelular decelularizado finais devem ser completamente desprovido de materiais celulares, e manter as características brutas, microscópicos e ultra-estruturais de pulmão nativo. Decelularização insuficiente ou de lavagem podem resultar em remanescente DNA "degola" para o cadafalso, que podem ser visualizados com um padrão hematoxilina e eosina (veja a Figura 3 para comparação). Repovoamento da matriz acelular e cultura de tecido pulmonar Se as células são recém isoladas de sete dias de idade os filhotes de rato neonatal, conforme descrito no suplemento on-line que acompanha o trabalho de Petersen e colaboradores 4, pode-se esperar um rendimento de células de 120-150 milhões de células por ninhada de 10 filhotes (pouco mais de 10 milhões células por recém-nascido). Condições ideais para a semeadura de células e cultura subseqüente do pulmão no biorreator deve render bem distribuídos em todas as células cinco lobos do pulmão, e deve fornecer uma cobertura de aproximadamente 70% da matriz extracelular andaime (Figura 3). A população de células cultivadas será positivo para os principais marcadores de células respiratórias, como a secretora pró-proteína C (SPC), proteína secretora Clara celular (CCSP), e aquaporina-5 (AQP), em ordem de abundância relativa (Figura 4). <img src="/files/ftp_upload/2651/2651fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Posições Cânulas e biorreator decelularização <img src="/files/ftp_upload/2651/2651fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Biorreator utilizado para plantio e cultura de tecido pulmonar de engenharia <img src="/files/ftp_upload/2651/2651fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Histologia de natal, decelularizado e repovoada pulmão <img src="/files/ftp_upload/2651/2651fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Coloração de imunofluorescência para os marcadores de pulmão chave

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LEN possui ações da Humacyte, uma empresa de medicina regenerativa. Humacyte não financiar esses estudos, e não afetar o design, a interpretação, ou o relato de qualquer uma das experiências ou métodos descritos. Os autores (LEN, THP, EAC) e Yale University entraram com um pedido de patente relacionada à engenharia de tecidos dos pulmões.

Os aspectos mais críticos do sistema aqui apresentado incluem a manutenção da esterilidade, e acompanhar de perto as pressões aplicadas ao leito vascular em todo o processo de preparação e semeando o andaime e cultura do pulmão repovoada. Esterilidade é melhor mantida em autoclave todo o material antes do uso, e pela montagem do pulmão em um sistema fechado logo após explante e evitar violação posterior desta barreira. Após a matriz decelularizado foi cuidadosamente lavado e transferido para um biorreator estéril para a cultura, a tampa de silicone e outras vedações e conexões não deve ser perturbado ou removidos. Para manter sob controle as pressões, o fluxo impulsionado pela força da gravidade é preferível sempre que possível. Quando uma bomba é necessária para a recirculação do líquido, com início após lavagem com PBS e continuando durante a cultura, recomendamos medir diretamente a pressão um pouco antes o fluido entra na artéria pulmonar, com um transdutor de pressão. A magnitude da pressão aplicada não deve exceder 15 mm Hg. Recellularized pulmões podem ser cultivadas por períodos variáveis ​​de tempo, normalmente variando de 4 dias para até 3 semanas. Perfusão vascular é normalmente realizado em 1-3 ml / min durante a cultura endotelial, enquanto a ventilação é normalmente aplicado a uma taxa de 1 respiração / min durante a cultura epitelial. Durante os períodos da cultura combinado, ventilação e perfusão simultânea é apropriado. Ventilação pode ser feita com qualquer meio líquido ou ar. Ao longo da últimas décadas, diversos grupos têm feito um trabalho de engenharia de tecidos importantes mostrando a viabilidade de diferenciação epitélio pulmonar in vitro e de reproduzir vários aspectos do pulmão microanatomia 7,8,9, 10. No entanto, até recentemente, nenhum 4,5 dessas tentativas de engenheiro de tecido pulmonar resultou em um órgão implantáveis ​​que foi capaz de manter a separação entre o sangue e os compartimentos das vias aéreas e que poderiam participar em troca de gás. Portanto, embora os métodos descritos são apenas um primeiro passo em direção à meta de longo prazo de geração de tecido pulmonar funcional, este trabalho é um passo encorajador para a possibilidade de aumentar a quantidade de tecido pulmonar disponíveis para transplante. Além disso, este trabalho elabora trabalho realizado por Ott et al. Uygun e 11,12 e colegas, demonstrando a eficácia de uma matriz extracelular decelularizado como um andaime para engenharia de tecidos tridimensionais complexas estruturas e apoiar o crescimento ea sobrevivência de vários tipos de células . Este trabalho também é significativo por sua contribuição ao arsenal de células respiratórias e biólogos moleculares. Ao fornecer um único, ambiente tridimensional que pode também dar o devido estímulo mecânico, e que não compartilha o perigo de atendimento rápido de diferenciação que se pode encontrar ao epitélio cultura de roedores em laboratório com métodos mais tradicionais 13, os cientistas poderiam usar nosso sistema de ganhar uma nova visão sobre célula-célula e célula-matriz interações que desempenham um papel na diferenciação celular e função. Este conhecimento pode ser particularmente poderosa, se usado como alavanca para orientar o destino de populações de células-tronco diferentes, como grupo Cortiella tem demonstrado em estudos iniciais 14.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> Eutanásia </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Heparina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H4784 </td><td></td></tr><tr><td> Nitroprussiato de sódio </td><td> Fluka </td><td> 71778 </td><td></td></tr><tr><td> Euthasol solução eutanásia </td><td> Virbac AH </td><td> 710101 </td><td> 390 mg / ml solução estoque pentobarbital sódica devem ser diluídos de forma adequada para a administração IP </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Decell Solution </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> CHAPS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3023 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Americana Bioanalytical </td><td> AB01915 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E5134 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> JT Baker </td><td> 3722-01 </td><td></td></tr><tr><td> 1X PBS </td><td> Gibco </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Componentes biorreator </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 480 ml jar </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-3460560 </td><td></td></tr><tr><td> Rolha de silicone, tamanho 14 </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06298-26 </td><td></td></tr><tr><td> Y-conectores </td><td> Cole Parmer </td><td> ED-30614-08 </td><td> Usado para cânulas arterial e traqueal </td></tr><tr><td> Tubo de silicone </td><td> Masterflex </td><td> 96420-14, 16 </td><td> L / S 14, 16 </td></tr><tr><td> Transdutores de pressão </td><td> Edwards Lifesciences </td><td> PX-212 </td><td></td></tr><tr><td> Válvula de retenção </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-98553-20 </td><td> Válvula unidirecional </td></tr><tr><td> 4-way torneiras </td><td> Edwards Lifesciences </td><td> 594WSC </td><td></td></tr><tr><td> Seringa de filtro </td><td> Cole Parmer </td><td> 2915-08 </td><td> PTFE, 0,2 Hm </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Decell e apparati lavagem (adições ao biorreator) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 500 e 1000 ml de vidro de garrafas </td><td> Corning </td><td> 1395-500;-1L </td><td> Usado para decell e lavagem pela gravidade </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Tratamento Benzonase </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> Gibco </td><td> 15140122 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr><tr><td> Tris-HCl </td><td> Americana Bioanalytical </td><td> AB14043 </td><td> 1M, pH 8,0 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> JT Baker </td><td> 2444-01 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A9647 </td><td></td></tr><tr><td> Benzonase Nuclease </td><td> Sigma </td><td> E1014 </td><td> Endonuclease usado para remover restos de DNA a partir da matriz </td></tr></tbody></table>

procedimento para a engenharia de pulmão

Procedure for Lung Engineering

Tecido pulmonar, incluindo câncer de pulmão e doenças pulmonares crônicas, como doença pulmonar obstrutiva crônica, cumulativamente conta para alguns 280.000 mortes anualmente, doença pulmonar obstrutiva crônica é atualmente a quarta causa de morte nos Estados Unidos 1. Contribuem para esta mortalidade é o fato de que os pulmões não costumam reparar ou regenerar além do nível, microscópicos celular. Portanto, o tecido do pulmão que está danificado pela degeneração ou infecção, ou tecido pulmonar, que é cirurgicamente ressecados não é funcionalmente substituído in vivo. Para explorar se o tecido pulmonar pode ser gerado in vitro, nós tratamos os pulmões de ratos adultos usando um procedimento que remove componentes celulares para produzir uma matriz extracelular do pulmão acelular andaime. Este andaime mantém as estruturas hierárquicas de ramificação das vias aéreas e vasos, bem como uma membrana basal intacta, que compreende colágeno IV, laminina, e fibronectina. O andaime é montado em um biorreator projetado para imitar os aspectos críticos do pulmão da fisiologia, como a ventilação de pressão negativa e perfusão vascular pulsátil. Por epitélio pulmonar e cultura endotélio vascular dentro do biorreator andaime montado, somos capazes de gerar tecido pulmonar que é fenotipicamente comparável ao tecido pulmonar nativa e que é capaz de participar em troca de gás para intervalos de tempo curtos (45-120 minutos). Estes resultados são encorajadores e sugerem que o repovoamento do pulmão matriz é uma estratégia viável para a regeneração de pulmão. Essa possibilidade apresenta uma oportunidade não só para trabalhar para aumentar a oferta de tecido pulmonar para transplante, mas também para o estudo de células respiratórias e biologia molecular in vitro por longos períodos de tempo e em um microambiente mais preciso do que foi previamente possível.

Nós desenvolvemos uma matriz extracelular e de pulmão decelularizado biorreator romance biomimético que pode ser usado para gerar tecido pulmonar funcional. Por semeadura de células na matriz e cultura no biorreator, geramos tecido que demonstra a troca gasosa eficaz quando transplantadas in vivo por curtos períodos de tempo.

Procedimento para a Engenharia de pulmão

O tecido pulmonar, incluindo o câncer de pulmão e doenças pulmonares crônicas, como a doença pulmonar obstrutiva crônica, representam cumulativamente cerca de 280.000 mortes ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar tecido pulmonar em cultura que seja morfológica e fisiologicamente comparável ao tecido pulmonar nativo. Isso é realizado primeiramente colhendo o coração e os pulmões de uma rata adulta. O próximo passo é canular a artéria pulmonar e a traqueia e conectar os pulmões canulados a um biorreator para descelularização.Após a descelularização e a lavagem, o pulmão é transferido para um biorreator de cultura estéril e preparado para o semeadura. O passo final do procedimento é semear o compartimento desejado do pulmão com uma população celular preparada. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram a matriz extracelular descelularizada eficientemente repovoada com células que expressam marcadores pulmonares regionalmente específicos por meio de microscopia de imunofluorescência.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes de cultivo de células pulmonares in vitro é que as células mantêm fenótipos diferenciados por um período prolongado, permitindo que sejam estudadas por várias semanas em um substrato tridimensional de origem biológica. Para a descelularização, os pulmões são conectados à tampa do biorreator por meio da cânula vascular, e a tampa é conectada ao aparelho de descelularização. O frasco de vidro acima dos pulmões é mantido no lugar por um suporte com argola e preso com uma braçadeira.Neste ponto, o material celular pode ser removido para produzir um suporte de matriz extracelular, que pode ser repovoado com material celular. A montagem do biorreator para semeadura e cultivo de tecido pulmonar engenheiro é mostrada neste diagrama. O conector com trava da cânula traqueal conecta-se a um circuito respiratório entre o reservatório da traqueia e a câmara principal.O circuito respiratório inclui duas válvulas unidirecionais. Posicionadas de modo que o meio siga um caminho diferente ao entrar e sair do pulmão. Um pequeno reservatório é temporariamente incorporado à linha de perfusão para o cultivo de células endoteliais.Uma bomba pulsátil é usada para transportar células do reservatório até o compartimento vascular do pulmão. A perfusão vascular é realizada utilizando uma bomba de roletes. O meio é perfundido na artéria pulmonar por meio da cânula acoplada, percorre a vasculatura pulmonar e sai pela veia pulmonar diretamente para o biorreator principal, onde o meio é aspirado para a perfusão.O epitélio pulmonar é posicionado por injeção no circuito respiratório. A câmara principal, que contém o pulmão e o reservatório da traqueia, é utilizada para o cultivo prolongado do pulmão. Quando os pulmões são extraídos e a artéria e a traqueia são canuladas corretamente, os pulmões recém-extraídos devem reter ar sem vazamentos.Isso pode ser verificado enchendo-os com ar enquanto estão submersos em líquido. Não deve haver bolhas indicando vazamentos de ar. Para iniciar o protocolo, os pulmões são inflados com PBS contendo nitroprussiato de sódio até que fiquem cheios, mas não sobreinflados; imediatamente, tampe a cânula traqueal para que os pulmões permaneçam inflados.Em seguida, perfundir os pulmões com PBS e SNP por pelo menos 15 minutos a 15 milímetros de mercúrio. Depois disso, remover a tampa da cânula traqueal para permitir o desinflamento dos pulmões. Continuar a perfusão com PBS e SNP por 15 a 30 minutos, se necessário.Reabasteça o PBS e o SNP para garantir que a pressão de perfusão seja mantida entre 10 e 15 milímetros de mercúrio. Para iniciar o procedimento de descelularização prolongada, a tampa do biorreator é conectada ao aparelho de descelularização. Em seguida, os pulmões são conectados à tampa.Usando as conexões com trava de engate ligadas à cânula em formato de YS, a cânula da artéria pulmonar deve ser conectada à linha de perfusão e a cânula traqueal deve ficar suspensa livremente. Para garantir a descelularização completa do tecido, é fundamental manter o ar fora do sistema. As válvulas unidirecionais nas cânulas arterial e traqueal ajudam a remover bolhas de ar nos tubos, permitindo o fluxo reverso no tubo.Portanto, permita que as bolhas de ar sejam removidas pela seringa e certifique-se de que todas as linhas estejam livres de ar. Inicie a perfusão com a solução de descelularização. Perfundido com a solução de descelularização.Até que 500 mililitros de solução tenham perfundido através dos pulmões, a pressão ideal é inferior a 15 milímetros de mercúrio. Isso geralmente exigirá 2,5 horas. As taxas de fluxo geralmente são muito lentas no início e aumentam rapidamente durante a segunda hora para aproximadamente um mililitro por minuto ou mais.Durante a perfusão, remova periodicamente o fluido de descelularização do biorreator, garantindo que permaneça fluido suficiente para sustentar o pulmão e a cânula traqueal. Quando a perfusão com o fluido de descelularização estiver completa, transfira os pulmões e o biorreator para uma cabine de cultura de tecidos. Para iniciar a lavagem do órgão, remova o frasco de 500 mililitros que contém o fluido de descelularização e substitua-o por um frasco estéril contendo até um litro de PBS estéril.Use sucção a vácuo ou uma seringa para garantir que os tubos estejam livres de ar e perfunda PBS pela vasculatura a 10 a 15 milímetros de mercúrio da mesma forma. Quanto à descelularização, utilizando técnicas estéreis, remova periodicamente o PBS residual do biorreator e substitua ou reabasteça o frasco de PBS. Continue a lavagem com PBS fresco e estéril até que pelo menos 2,5 litros de PBS estéril tenham perfundido os pulmões.Isso geralmente levará dois dias a partir do início do processo de descelularização, quando a lavagem estiver completa. Transfira os pulmões para um novo sistema de biorreator estéril contendo PBS fresco mais 10% de FBS mais 10% de penicilina-estreptomicina, garantindo que tanto todo o circuito de perfusão quanto todas as linhas da via aérea estejam completamente preenchidos com líquido. A partir deste ponto, uma bomba pulsátil será utilizada para perfundir os pulmões a cinco milímetros por minuto.Esterilize o suporte de matriz extracelular pulmonar por perfusão noturna com PBS contendo 10% de FBS e 10% de penicilina-estreptomicina. Após concluir este passo, transfira os pulmões para uma incubadora a 37 graus Celsius por uma hora ou até que a temperatura esteja equilibrada. Em preparação para o tratamento com Ben Nase, o próximo passo é tratar os pulmões com Ben Nase.Para remover o DNA remanescente de cada pulmão, preencha primeiro uma seringa de 10 mililitros apenas com o tampão Ben Nase pré-aquecido e uma seringa de 10 mililitros com 90 unidades por mililitro de Ben Nase diluído em tampão Ben Nase. Interrompa a perfusão dos pulmões.Em seguida, insuflar a via aérea com o tampão Ben Nase, evitando injetar ar no pulmão. Deixar o pulmão desinsuflar por um minuto. Em seguida, insuflar o pulmão com a solução Ben Nase.Novamente, tomando cuidado para não introduzir ar nos pulmões após a insuflação com Ben Nase. Deixe os pulmões repousar sem perfusão ou ventilação a 37 graus Celsius por uma hora. Ao final dessa hora, reinicie a perfusão com a solução de PBS contendo 10% de FBS e 10% de penicilina-estreptomicina já presente no biorreator e continue a perfusão durante a noite no dia seguinte.Após a lavagem e esterilização, a matriz extracelular longa pode ser preparada para repovoamento celular. Substitua a solução de P-B-S-F-B-S benzo A por 250 mililitros de meio de cultura. Realize a perfusão por pelo menos uma hora antes da introdução das células e substitua por meio de cultura fresco imediatamente antes da semeadura das células.Muitas fontes celulares podem ser utilizadas para o recobrimento de órgãos. Aqui, será demonstrado o recobrimento com uma população de células epiteliais. Primeiro, prepare uma seringa contendo 15 mililitros de uma suspensão celular da população desejada de células epiteliais.Em seguida, encha o reservatório da via aérea com 80 mililitros de meio de cultura e certifique-se de que todas as linhas de ventilação estejam livres de ar. Depois, coloque o biorreator em uma incubadora de cultura tecidual a 37 graus Celsius e conecte a bomba de seringa para ventilação. Semee as células nos pulmões usando um bolus rápido único, injetando a suspensão celular de 15 mililitros na cânula traqueal.Certifique-se de que os filtros de ar do biorreator principal estejam tampados. Em seguida, inicie imediatamente uma única respiração lenta utilizando a bomba de seringa para retirar 60 mililitros de ar do biorreator principal a uma taxa de três mililitros por minuto. Isso durará aproximadamente 20 minutos.Deixe os pulmões em repouso estático por aproximadamente 18 horas após isso. Inicie a perfusão vascular lenta a cerca de 0,5 mililitros por minuto. Durante o cultivo de órgãos, a perfusão é geralmente realizada a uma taxa de um a três mililitros por minuto.Usando uma bomba de roletes durante o cultivo epitelial, a ventilação é geralmente fornecida a uma taxa contínua de uma respiração por minuto e volume corrente de cinco a 10 mililitros. Usando uma bomba de seringa, o ar é ciclicamente retirado e injetado no biorreator para provocar a respiração, alternando entre pressão negativa e pressão atmosférica na câmara principal. Devido à necessidade de manter o biorreator hermético durante a ventilação, a ventilação deve ser pausada diariamente e o ar na câmara principal deve ser trocado.Além disso, o meio deve ser trocado aproximadamente a cada três ou quatro dias. Durante o cultivo, cerca de metade do volume total deve ser substituído a cada vez no cultivo do epitélio pulmonar e do endotélio vascular. Na estrutura montada no biorreator, somos capazes de gerar tecido pulmonar capaz de participar da troca gasosa por intervalos curtos de tempo.Uma coloração padrão de hematoxilina, eosina e tricrômio de pulmão nativo de rato é mostrada aqui para comparação com uma coloração H e E de um pulmão de rato descelularizado. A matriz extracelular descelularizada final deve estar completamente isenta de materiais celulares e manter as características macroscópicas, microscópicas e ultraestruturais do pulmão nativo. A coloração H e E permitirá a visualização de qualquer DNA residual aderido ao esqueleto como resultado de descelularização ou lavagem insuficientes, condições ideais para o plaqueamento celular e subsequente cultura do pulmão.E o biorreator deve gerar células bem distribuídas em todos os cinco lobos do pulmão e deve proporcionar cobertura de aproximadamente 70% do arcabouço da matriz extracelular. Essas imagens comparam o pulmão nativo ao pulmão repovoado quando coradas por imunofluorescência. Para marcadores pulmonares principais, a população celular cultivada é positiva para a proteína secretória de células de Clara, proteína secretória pro C e aquaporina cinco.Os marcadores de interesse são mostrados em vermelho e os núcleos corados com DAPI estão em azul em todos os painéis. Uma vez dominado este procedimento, da descelularização até a recolonização, ele pode ser realizado em quatro a cinco dias, se realizado corretamente.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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