Procedimento para a Engenharia de pulmão

O objetivo geral deste procedimento é gerar tecido pulmonar em cultura que seja morfologicamente e fisiologicamente comparável ao tecido pulmonar nativo. Isso é feito colhendo primeiro o coração e os pulmões de um rato adulto. O próximo passo é canular a artéria pulmonar e a traqueia e conectar os pulmões canulados a um biorreator para descelularização.

Após a descelularização e enxágue, o pulmão é transferido para um biorreator de cultura estéril e preparado para assentamento. A etapa final do procedimento é semear o compartimento desejado do pulmão com uma população de células preparada. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a matriz extracelular descelularizada eficientemente repovoada com células que expressam marcadores pulmonares regionalmente específicos por meio de microscopia de imunofluorescência.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes de cultura de células pulmonares in vitro é que as células mantêm fenótipos diferenciados por um longo período de tempo, de modo que podem ser estudadas por várias semanas em um substrato tridimensional biologicamente derivado. Para a descelularização, os pulmões são conectados à tampa do biorreator por meio da cânula vascular, e a tampa é conectada ao aparelho de descelularização. A garrafa de vidro acima dos pulmões é mantida no lugar por um suporte de anéis e uma braçadeira anexada.

Nesse ponto, o material celular pode ser removido para produzir uma estrutura de matriz extracelular, que pode ser repovoada com material celular. A montagem do biorreator para semeadura e cultura de tecido pulmonar projetado é mostrada neste diagrama. O conector de trava de isca da cânula traqueal se conecta a um loop respiratório entre o reservatório da traqueia e a câmara principal.

O circuito respiratório inclui duas válvulas unidirecionais. Posições tais que o meio segue um caminho diferente para dentro e para fora do pulmão. Um pequeno reservatório é temporariamente incorporado à linha de perfusão para semeadura de células endoteliais.

Uma bomba pulsátil é usada para transportar células do reservatório para o compartimento vascular do pulmão. A perfusão vascular é fornecida usando uma bomba de rolo. O meio é perfundido na artéria pulmonar através da cânula anexada, flui através da vasculatura pulmonar e sai da veia pulmonar diretamente para o biorreator principal, onde o meio é extraído para perfusão.

O epitélio pulmonar é assentado por injeção na alça respiratória. A câmara principal contendo o pulmão e o reservatório da traqueia são usados para cultura pulmonar de longo prazo. Quando os pulmões foram extraídos e a artéria e a traqueia são canuladas corretamente, os pulmões recém-extraídos devem reter o ar sem vazamento.

Isso pode ser verificado inflando-os com ar enquanto submersos em líquido. Não deve haver bolhas indicando vazamentos de ar. Para iniciar o protocolo, os pulmões são inflados com PBS contendo nitropress de sódio até que os pulmões estejam cheios, mas não superinflados, tampando imediatamente a cânula traqueal para que os pulmões permaneçam inflados.

Em seguida, perfunda os pulmões com PBS e SNP por pelo menos 15 minutos a 15 milímetros de mercúrio. Depois disso, remova a rolha da cânula traqueal para permitir que os pulmões esvaziem. Continue a perfusão com PBS e SNP por 15 a 30 minutos, se necessário.

Reabasteça PBS e SNP para garantir que a pressão de profusão seja mantida em 10 a 15 milímetros de mercúrio. Para iniciar o procedimento de descelularização longa, a tampa do biorreator é conectada ao aparelho de descelularização. Em seguida, os pulmões são conectados à tampa.

Usando as conexões de trava de isca ligadas à cânula em forma de YS, a cânula da artéria pulmonar deve se conectar à linha de perfusão e a cânula traqueal deve flutuar livremente. Para garantir a descelularização total do tecido, é crucial manter o ar fora do sistema. As válvulas unidirecionais na cânula arterial e traqueal ajudam a limpar as bolhas de ar na tubulação, permitindo a reversão do fluxo na tubulação.

Portanto, permitindo que as bolhas de ar sejam removidas pela seringa, certifique-se de que todas as linhas estejam livres de ar. Comece a perfusão com solução de descelularização. Perfundido com solução de descelularização.

Até que 500 mililitros de solução tenham perfundido através dos pulmões, a pressão ideal é inferior a 15 milímetros de mercúrio. Isso normalmente exigirá 2,5 horas. As taxas de fluxo são tipicamente muito lentas inicialmente e aumentam rapidamente durante a segunda hora para aproximadamente um mililitro por minuto ou mais.

Durante a perfusão removida periodicamente, usou fluido de descelularização do biorreator, garantindo que houvesse fluido suficiente para suportar o pulmão e a cânula traqueal. Quando a perfusão com o fluido de descelularização estiver completa, transfira os pulmões e o biorreator para uma capa de cultura de tecidos. Para iniciar o enxágue dos órgãos, remova o frasco de 500 mililitros que contém o fluido de descelularização e substitua-o por um frasco estéril contendo até um litro de PBS estéril.

Use sucção a vácuo ou uma seringa para garantir que as linhas estejam livres de perfundir PBS através da vasculatura a 10 a 15 milímetros de mercúrio da mesma maneira. Quanto à descelularização, usando técnicas estéreis, remova periodicamente os resíduos de PBS do biorreator e substitua ou reabasteça o frasco de PBS. Com PBS fresco e estéril, continue enxaguando até que pelo menos 2,5 litros de PBS estéril tenham perfundido os pulmões.

Isso normalmente leva dois dias a partir do início do processo de descelularização, quando o enxágue é concluído. Transfira os pulmões para um novo sistema de biorreator estéril contendo PBS fresco mais 10% de FBS mais 10% de estreptococos de Pen para garantir que todo o circuito de perfusão e todas as linhas das vias aéreas sejam preenchidas com fluido. A partir daqui, uma bomba pulsátil será usada para perfundir os pulmões a cinco milímetros por minuto.

Esterilize a estrutura da matriz extracelular pulmonar por perfusão noturna com PBS que tenha 10% de FBS e 10% de estreptomicina de penicilina. Depois de concluir esta etapa, transfira os pulmões para uma incubadora de 37 graus Celsius por uma hora ou até que a temperatura esteja equilibrada. Em preparação para o tratamento com Ben Nase, o próximo passo é tratar os pulmões com Ben Nase.

Para remover o DNA remanescente de cada pulmão, primeiro encha uma seringa de 10 mililitros apenas com tampão Ben Nase pré-aquecido e uma seringa de 10 mililitros com 90 unidades por mililitro. Ben Nase diluído em tampão Ben Nase. Pare a perfusão dos pulmões.

Em seguida, encha as vias aéreas com tampão Ben Nase, evitando injetar ar no pulmão. Deixe o pulmão esvaziar por um minuto. Em seguida, encha o pulmão com a solução de Ben Nase.

Mais uma vez, tomando cuidado para não introduzir ar no pulmão depois de inflar com Ben Nase. Deixe os pulmões assentarem sem perfusão ou ventilação a 37 graus Celsius por uma hora. Ao final da hora, retomar a perfusão com PBS mais 10% FBS 10% de penicilina estreptomicina que já está no biorreator e continuar a perfusão durante a noite no dia seguinte.

Após o enxágue e a esterilização, o andaime de matriz extracelular longa pode ser preparado para o repovoamento celular. Substitua o benzo P-B-S-F-B-S por uma solução com 250 mililitros de cultura. Perfu médio por pelo menos uma hora antes de as células serem introduzidas e substituí-lo por meio de cultura fresco diretamente antes de semear as células.

Muitas fontes celulares podem ser utilizadas para a retração de órgãos. Aqui, serão demonstrados assentos com uma população de células epiteliais. Primeiro, prepare uma seringa contendo 15 mililitros de uma suspensão celular da população de células epiteliais desejada.

Em seguida, encha o reservatório das vias aéreas com 80 mililitros de meio de cultura e certifique-se de que todas as linhas de ventilação estejam livres de ar. Em seguida, coloque o biorreator em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 graus Celsius e conecte a bomba de seringa para ventilação. Semeie as células nos pulmões usando um único bolus rápido, injetando a suspensão de células de 15 mililitros na cânula traqueal.

Certifique-se de que os filtros de ar do biorreator principal estejam tampados. Em seguida, comece imediatamente uma única respiração lenta usando a bomba de seringa para retirar 60 mililitros de ar do biorreator principal a três mililitros por minuto. Isso durará aproximadamente 20 minutos.

A permite que os pulmões fiquem estaticamente por aproximadamente 18 horas depois disso. Comece a perfusão vascular lenta em aproximadamente 0.5 mililitros por minuto. Durante a cultura de órgãos, a perfusão é normalmente realizada a um a três mililitros por minuto.

Usando uma bomba de rolo durante a cultura epitelial, a ventilação é normalmente fornecida a uma taxa contínua de uma respiração por minuto e volume corrente de cinco a 10 mililitros. Usando uma bomba de seringa, o ar é retirado ciclicamente, retirado e injetado no biorreator para afetar a respiração, alternando entre pressão negativa e pressão atmosférica dentro da câmara principal. Devido à necessidade de manter o biorreator hermético durante a ventilação, a ventilação deve ser pausada diariamente e o ar na câmara principal deve ser trocado.

Além disso, o meio deve ser trocado aproximadamente a cada três a quatro dias. Durante a cultura, aproximadamente metade do volume total deve ser trocada a cada vez por cultura de epitélio pulmonar e endotélio vascular. Dentro do andaime montado no biorreator, somos capazes de gerar tecido pulmonar capaz de participar das trocas gasosas por curtos intervalos de tempo.

Uma coloração padrão de hemat, toin e eoin de pulmão de rato nativo é mostrada aqui para comparação com uma coloração H e e de um pulmão de rato descelularizado. A matriz extracelular descelularizada final deve ser completamente desprovida de materiais celulares e manter as características macroscópicas, microscópicas e ultraestruturais do pulmão nativo. A coloração h e e permitirá a visualização de qualquer DNA remanescente, aderindo ao andaime como resultado de descelularização insuficiente ou enxágue das condições ideais para a semeadura celular e subsequente cultura do pulmão.

E o biorreator deve produzir células bem distribuídas em todos os cinco lobos do pulmão e deve fornecer cobertura de aproximadamente 70% do andaime da matriz extracelular. Essas imagens comparam o pulmão nativo com o pulmão repovoado quando corado por imunofluorescência. Para os principais marcadores pulmonares, a população de células cultivadas é positiva para a proteína secretora de células Clara pró-proteína secretora C e Aquaporina cinco.

Os marcadores de interesse são mostrados em vermelho e os núcleos corados com DAPI estão em azul em todos os painéis. Uma vez dominado, este procedimento, desde a descelularização até o recuo, pode ser feito em quatro a cinco dias, se realizado corretamente.