phiC31-Integração de transgene dirigida ao local mediada por integrase: uma técnica de microinjeção para integração de transgene específico do local em um vetor de Anopheles

A integrase phiC31 é uma enzima recombinase derivada de fagos que catalisa a recombinação específica do local de um transgene, um gene estranho, em um genoma hospedeiro. Para a integração do transgene em um hospedeiro Anopheles, comece com um embrião de Anopheles em um tampão adequado.

O genoma do Anopheles é pré-projetado com um local de ligação para integração de genes e um marcador ciano-fluorescente para seleção visual. Em seguida, adicione um pequeno volume de plasmídeo doador carregando a carga transgênica desejada, um local de fixação, um marcador fluorescente vermelho e componentes de backbone de plasmídeo a um frasco. Em seguida, adicione um volume ideal de um plasmídeo auxiliar carregando uma integrase codificadora de genes. Agora, carregue a mistura de plasmídeo em uma microsseringa.

Injete suavemente os plasmídeos no pólo posterior do embrião, o local de origem das células germinativas, resultando em um leve movimento do citoplasma. Uma vez dentro do embrião, o plasmídeo auxiliar começa a sintetizar enzimas integrases.

A enzima integrase medeia a recombinação específica do local entre o plasmídeo doador e o genoma do hospedeiro. Assim, o transgene e o marcador fluoresce