phiC31-Integração de transgene dirigida ao local mediada por integrase: uma técnica de microinjeção para integração de transgene específico do local em um vetor de Anopheles

A integrase phiC31 é uma enzima recombinase derivada de fagos que catalisa a recombinação específica do local de um transgene, um gene estranho, em um genoma hospedeiro. Para a integração do transgene em um hospedeiro Anopheles, comece com um embrião de Anopheles em um tampão adequado.

O genoma do Anopheles é pré-projetado com um local de ligação para integração de genes e um marcador ciano-fluorescente para seleção visual. Em seguida, adicione um pequeno volume de plasmídeo doador carregando a carga transgênica desejada, um local de fixação, um marcador fluorescente vermelho e componentes de backbone de plasmídeo a um frasco. Em seguida, adicione um volume ideal de um plasmídeo auxiliar carregando uma integrase codificadora de genes. Agora, carregue a mistura de plasmídeo em uma microsseringa.

Injete suavemente os plasmídeos no pólo posterior do embrião, o local de origem das células germinativas, resultando em um leve movimento do citoplasma. Uma vez dentro do embrião, o plasmídeo auxiliar começa a sintetizar enzimas integrases.

A enzima integrase medeia a recombinação específica do local entre o plasmídeo doador e o genoma do hospedeiro. Assim, o transgene e o marcador fluorescente vermelho do plasmídeo doador integram-se nos locais de ligação recombinantes no genoma de Anopheles. Em seguida, incubar o embrião injetado em condições fisiológicas para eclosão, com redemoinho intermitente.

Em poucos dias, o embrião eclode em uma larva. Sob um microscópio de fluorescência, a larva de Anopheles com genes integrados com sucesso expressa tanto a fluorescência ciano, marcando o genoma do hospedeiro, quanto a fluorescência vermelha, marcando o transgene do plasmídeo doador.

Purifique os plasmídeos doadores e auxiliares usando um kit de purificação livre de endotoxinas. Combinar o plasmídeo dador marcado com attB que transporta o transgene de interesse e o plasmídeo auxiliar que transporta a integrase para obter uma mistura com uma concentração final de 350 nanogramas por microlitro do plasmídeo do dador e de 150 nanogramas por microlitro do plasmídeo auxiliar.

Precipite o DNA adicionando 0,1 volume de acetato de sódio 3 molar, em 2,5 volumes de etanol 100% gelado. Então, vórtice. Um precipitado branco deve ser imediatamente visível. Lave o pellet e ressuspenda-o em tampão de injeção, até atingir uma concentração final total de 500 nanogramas por microlitro. Em seguida, prepare alíquotas de 10 a 15 microlitros cada e armazene-as a 20 graus Celsius negativos.

Alimente com sangue mosquitos de 4 a 7 dias de idade da linha de ancoragem desejada e seus equivalentes do tipo selvagem, 72 horas antes da microinjeção. Realize microinjeções de embriões de Anopheles gambiae, em cloreto de sódio 25 milimolar, visando o pólo posterior do embrião em um ângulo de 45 graus.

Realize microinjeções de embriões de Anopheles stephensi, em óleo de halocarbono, visando o pólo posterior em um ângulo de 30 graus. Imediatamente após a injeção, transfira os ovos para uma placa de Petri cheia de água destilada estéril e devolva-os às condições de insetismo. Após a eclosão, transfira as larvas G₀ para uma bandeja com água destilada com sal diariamente e crie para as pupas.