Criação de um denso Transposon inserção biblioteca usando bacteriana conjugação em entérobactérienne cepas tais como Escherichia Coli ou Shigella flexneri

O objetivo geral deste procedimento experimental é criar uma biblioteca de inserção de transposons de alta densidade em Escherichia coli ou Shigella flexneri usando conjugação bacteriana. Esta técnica permite a criação de centenas de milhares de mutantes bacterianos únicos pela inserção genômica aleatória de um transposon Tn10. A principal vantagem dessa técnica é que a transferência do plasma ao abrigar o transposon é feita por meio de conjugação bacteriana em vez de outros métodos menos eficientes, como a eletroporação.

Além disso, o próprio transposon Tn10 se insere no genoma com menos viés do que outros transposons. Usando a técnica estéril, adicione um mililitro de cultura noturna da cepa doadora em um tubo eppendorf estéril. O tubo deve ser rotulado, por exemplo, com um D, para doador.

Faça o mesmo para a cepa receptora, removendo um mililitro de cultura noturna da cepa receptora em um tubo eppendorf estéril. Novamente, por exemplo, rotulado com R, para recipient. Centrifugue ambos os tubos por um minuto a 14.000 vezes G à temperatura ambiente.

Isso pode ser feito em uma centrífuga de bancada. Enquanto a centrífuga estiver funcionando, prepare os filtros para conjugação. Use uma pinça estéril para colocar um filtro de nitrocelulose em uma placa de ágar LB rotulada sem antibióticos.

Em alternativa, em vez do filtro de nitrocelulose, pode ser utilizado papel mata-borrão estéril. Coloque cada filtro em uma placa de ágar LB separada para minimizar a contaminação. Certifique-se de que cada filtro seja colocado em uma placa de ágar LB devidamente rotulada.

Faça três pratos, cada um contendo um filtro. Um para a cepa doadora, um para a cepa receptora e um para a biblioteca. Assim que a centrífuga terminar, remova as culturas durante a noite.

Remova todos os meios de crescimento contendo antibióticos do tubo eppendorf e descarte. Tome cuidado para não interromper ou perturbar a paleta de células bacterianas, mas tente remover todos os meios de crescimento. Certifique-se de trabalhar assepticamente e trocar as pontas entre cada amostra.

Para cada tubo eppendorf, adicione 110 microlitros de meio LB fresco sem antibióticos e pipete para cima e para baixo para ressuspender a cultura. Certifique-se de trabalhar assepticamente. Pipetando para cima e para baixo várias vezes para garantir que não permaneçam aglomerados de células.

Esta etapa é feita para concentrar a cultura bacteriana e remover quaisquer antibióticos deixados da cultura noturna. Usando uma pipeta, coloque 50 microlitros da cultura concentrada do doador no filtro rotulado como Doador. Adicione lentamente os 50 microlitros ao filtro de forma gota.

Faça o mesmo para a cepa receptora adicionando 50 microlitros da cultura ressuspensa, a cultura ressuspensa concentrada no filtro receptor de forma gota. Para que a conjugação ocorra, tanto a cepa receptora quanto a cepa doadora são adicionadas ao mesmo papel de filtro para que estejam em contato físico próximo. Para fazer isso, adicione 50 microlitros da cepa doadora e da cepa receptora ao mesmo filtro na biblioteca rotulada de placas.

Coloque essas placas de ágar contendo os filtros a 37 graus por seis horas. O processo de conjugação ocorre ao longo de seis horas a 37 graus Celsius. Durante a conjugação, a plasmina pJA1 se move para a cepa receptora.

Após a conjugação, as bactérias são dissociadas do filtro por vórtice e induzidas com um IPTG milimolar. O IPTG induz a transposase e o transposon contendo o gene para resistência à canamicina é inserido aleatoriamente no genoma da cepa receptora. As bactérias são plaqueadas em placas de ágar LB contendo canamicina e outro antibiótico para selecionar a cepa receptora contendo o transposon.

A cepa receptora é Lambda pir negativa, então a plasmina pJA1 é perdida. Após seis horas de crescimento a 37 graus Celsius, a conjugação está completa. Remova as placas que contêm os filtros da incubadora.

Use uma pinça estéril para remover o filtro contendo o controle doador negativo da placa de ágar LB. Bata no tubo para colocar o papel de filtro no fundo do frasco cônico e certifique-se de que o filtro esteja totalmente submerso no meio LB. Este tubo contém dois mililitros de meio LB com IPTG e uma concentração final de um milimolar.

Vortex o tubo por um minuto para desassociar as bactérias do filtro de nitrocelulose. O meio LB deve ficar turvo com células bacterianas. Repita isso para o controle de destinatário e também para a biblioteca.

Depois que os filtros contendo as células bacterianas foram completamente vórtices para dissociar as bactérias do filtro, as células bacterianas são revestidas em meios selecionados. Nesta etapa, as bactérias são semeadas em placas de ágar LB contendo canamicina e outro antibiótico, como o ácido nalidíxico. A canamicina é usada para selecionar células receptoras que possuem o transposon contendo o marcador de resistência à canamicina integrado com sucesso ao genoma.

As células receptoras que não tiveram o marcador integrado ao genoma são selecionadas. Outro antibiótico, como o ácido nalidíxico, é usado para selecionar a cepa do doador. A cepa doadora usada aqui é sensível ao ácido nalidíxico, enquanto a cepa receptora é resistente ao ácido nalidíxico.

Usando este segundo antibiótico, é possível remover a cepa do doador. Nesta etapa, várias diluições devem ser plaqueadas para determinar uma diluição da biblioteca que produz muitas colônias adequadamente espaçadas. Depois de contar e registrar o número de colônias em todas as placas que contêm a biblioteca de transposons, alguns usuários podem querer agrupar ou combinar a biblioteca em um tubo.

Isso pode ser feito usando um espalhador estéril. Adicione um mililitro de mídia LB à placa de ágar LB contendo a biblioteca de transposons. Depois que o meio for adicionado à placa, use o espalhador estéril para raspar e desassociar as bactérias da placa.

Muitas vezes não é possível tirar todas as bactérias do prato. Remova a suspensão bacteriana e coloque em uma cônica de 50 mil ou 15 mil. Repita isso para todos os pratos.

Depois que todas as placas forem raspadas, faça um vórtice da suspensão bacteriana acumulada por um minuto inteiro para quebrar quaisquer aglomerados de células. Isso agora constitui a biblioteca em pool. Após o crescimento a 37 graus por 18 horas, não deve haver crescimento nas placas de controle do doador ou receptor.

As placas contendo a biblioteca mutante contêm idealmente muitas colônias com uma variedade de tamanhos. Diferentes tamanhos de colônia indicaram clones de aptidão variada e são um bom sinal de que o protocolo funcionou. A criação de uma densa biblioteca de mutagênese de transposons em bactérias é potencialmente vantajosa para muitas aplicações a jusante, desde descobertas de genes de virulência e patógenos bacterianos até o estudo de genes essenciais e a identificação de redes de interação genética.

Todas essas aplicações downstream dependem da construção de uma biblioteca densa de inserção de transposons. O método apresentado aqui fornece um procedimento simples, rápido e barato para fazer uma biblioteca de transposons muito densa em cepas de enterobactérias, como E coli ou Shigella flexneri.