Conjugadas acasalamento Os ensaios para a análise específica da sequência de proteínas de transferência envolvidos na conjugação bacteriana

O objetivo geral deste ensaio de acasalamento é avaliar os efeitos de mutações dentro do gene de transferência conjugativa em sua capacidade de afetar a transferência de plasmídeo no contexto de um complexo funcional de secreção do tipo quatro. Este método permite fazer perguntas específicas sobre proteínas, como identificar regiões de interações proteína-proteína que ocorrem entre proteínas de transferência à medida que montam um sistema funcional de secreção tipo quatro na conjugação bacteriana. Nesta técnica, genes em grandes plasmídeos conjugativos são nocauteados por recombinação homóloga.

A função do gene é avaliada fornecendo o gene alvo para os knock-outs em um plasmídeo menor. Geralmente, os indivíduos novos nesse método terão dificuldades porque a organização e a configuração são fundamentais para conduzir esse procedimento com sucesso. A preparação experimental adequada é necessária para obter resultados interpretáveis.

Comece este protocolo com a preparação do plasmídeo pBAD33 digerido conforme descrito no protocolo de texto. Execute cada resumo em um gel de agarose. Usando um gabinete UV e uma lâmina de barbear estéril, corte a banda de base de 2,8 quilos que corresponde à sequência de cateterismo do gel.

Trabalhe rapidamente para minimizar a exposição UV do DNA. Extraia o DNA da fatia de gel cortada usando um kit de extração de gel de acordo com o protocolo do fabricante. Para amplificar o de gato extraído por reação em cadeia da polimerase ou PCR.

Prepare a mistura de reação em um tubo de PCR estéril. Use primers que contenham saliências homólogas à sequência do gene alvo para recombinação homóloga. Configure um controle negativo que contenha os mesmos componentes, exceto substituir o DNA molde por água destilada duplamente.

Além disso, configure um controle positivo usando DNA molde e primers que comprovadamente funcionam em uma reação de PCR. Misture todo o conteúdo da reação suavemente pipetando. Em seguida, amplifique o de gato extraído usando os parâmetros de PCR listados no protocolo de texto.

Use apenas cinco microlitros de cada reação para confirmar o tamanho correto da amplificação por meio de eletroforese em gel de agarose. Purifique o amplicon PCR usando um kit de purificação PCR com o protocolo do fabricante. Adicione 300 nanogramas do de gato amplificado em 50 microlitros de células DY330R eletrocompetentes, abrigando o plasmídeo pOX38-Tc no gelo.

Pipete suavemente para cima e para baixo para misturar. Repita esta etapa usando o plasmídeo pBAD33 não modificado como controle positivo. Em seguida, transfira as células para uma cubeta de eletroporação pré-resfriada de um milímetro.

Eletroporar as células a 1,8 quilovolts com uma constante de tempo de 5,5 milissegundos usando um eletroporador. Imediatamente, após a aplicação do pulso, diluir as células com um mililitro de meio SOC e transferir para um novo tubo de microcentrífugas. Incube as células a 32 graus Celsius por duas horas.

Em seguida, alíquota de 100 microlitros de cada amostra em placas de ágar contendo 10 microgramas por mililitro de tetraciclina e 20 microgramas por mililitro de cloranfenicol. Espalhe a alíquota sobre a placa usando um espalhador estéril. Incube a placa de cabeça para baixo a 32 graus Celsius durante a noite.

No dia seguinte, selecione os recombinantes bem-sucedidos. O de gato introduzido na célula sofrerá recombinação homóloga com o gene de interesse e criará o clone nocaute de cloranfenicol pOX38-Tc. Separe os 300 nanogramas eletroporados do gene pK184 ou do plasmídeo mutante do gene pK184 em 50 microlitros de células eletrocompotentes DY330R que abrigam o plasmídeo knock-out de cloranfenicol pOX38-Tc como antes.

Para gerar as células doadoras XK1200, realize o acoplamento conjugativo seguido de eletroporação para gerar células XK1200, perfurando tanto o nocaute de cloranfenicol quanto o plasmídeo PK184, conforme descrito no protocolo de texto. Preparação de cultura noturna dessas células doadoras XK1200 em 20 mililitros de LB estéril com cloranfenicol e canamicina. Prepare também as células receptoras MC4100 em 50 mililitros de LB com 50 microgramas por mililitro de estreptomicina usando células de um estoque de glicerol ou de uma única colônia em placa de ágar ang.

Cultive as culturas a 37 graus Celsius, agitando a 200 rpm. Adicione glicose a uma concentração final de 100 milimolares a todas as células doadoras. No dia seguinte, faça 1 em 70 diluições de cada cultura noturna separadamente em dois mililitros de LB estéril com os mesmos antibióticos.

Aumente as células até a fase logarítmica intermediária a 37 graus Celsius com agitação a 200 rpm. Centrifugue a cultura de células para peletar as células e descarte o sobrenadante. Em seguida, lave o pellet celular uma vez com LB estéril frio para remover os antibióticos.

Depois de centrifugar uma segunda vez, como antes, suspendemos as células em dois mililitros de LB.In estéril a frio duplicada, alíquota de 100 microlitros de células doadoras e 100 microlitros de células receptoras para 800 microlitros de meio LB estéril para um mililitro de volume total. Deixe as células acasalarem a 37 graus Celsius por uma hora sem tremer. Depois de uma hora, vórtice as células por 30 segundos para interromper os pares de acasalamento.

Em seguida, coloque as células no gelo por 10 minutos para evitar mais acasalamento. Usando as culturas de log médio e LB estéril fresco, prepare seis diluições seriadas das células doadoras e receptoras de 1 e 100 para 1 e 10 milhões. Em cada uma das duas metades de uma placa de ágar contendo ácido nacalíxico, cloranfenicol e canamicina, localize alíquotas de 10 microlitros de cada diluição de células doadoras XK1200.

Repita a detecção das diluições das células receptoras MC4100 em placas de ágar contendo estreptomicina. Em seguida, incube as placas durante a noite a 37 graus Celsius. Em seguida, usando a mistura de vórtice e LB estéril fresco, prepare seis diluições dos transconjugantes.

Selecione para as células transconjugantes MC4100 que abrigam o nocaute de cloranfenicol pOX38-Tc, identificando alíquotas de dez microlitros de cada diluição em cada metade das placas de ágar contendo estreptomicina e cloranfenicol. Repita para ambas as misturas duplicadas. Em seguida, incube as placas durante a noite a 37 graus Celsius.

Calcule a eficiência de acasalamento contando o número de colônias da mesma mancha de diluição para cada célula doadora, receptora e transconjugante em suas respectivas placas. Além disso, conte as colônias receptoras para testar qualquer viés resultante de um número maior de transconjugantes do que os receptores naquela diluição. Calcule a eficiência de acasalamento como o número de colônias transconjugantes dividido pelo número de colônias doadoras, multiplicado por 100 para obter o valor da eficiência por 100 células doadoras.

Quando o gene do sistema de secreção tipo quatro-tra-F é eliminado do plasmídeo pOX38-Tc, isso resulta em uma perda de transferência conjugativa do plasmídeo pOX38-Tc traF cloranfenicol knock out do doador para as células receptoras. No entanto, quando o gene traF é fornecido em trans pelo plasmídeo PK184 traF e pelas células doadoras, observa-se uma recuperação da transferência conjugativa do plasmídeo knock-out de cloranfenicol pOX38-Tc traF. Quando fornecidos mutantes de diluição de traF e do plasmídeo PK184 nas células doadoras, pode ser observada perda de transferência conjugativa do plasmídeo knock-out de cloranfenicol pOX38-Tc traF.

A perda da transferência conjugativa indica a região da proteína importante para as interações proteína-proteína dentro do sistema de secreção conjugativo tipo quatro. Essa região pode então ser investigada com mais detalhes por mutações pontuais que afetam a eficiência da transferência. Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em um único dia de trabalho com tempos de crescimento esperados.

Este protocolo pode ser feito em células diferentes das demonstradas aqui. O aspecto crítico, neste ponto, é que as células doadoras e receptoras não abrigam o plasmídeo de interesse. Para que, ao adicionar o plasmídeo knock-out, você não obtenha resultados conflitantes.

Ao tentar este procedimento, é importante ser muito organizado, pois existem diferentes condições de crescimento e antibióticos para células doadoras, receptoras e transconjugadas. Após este procedimento, outros métodos como cristalografia, RMN ou espectrometria de massa podem ser realizados para obter uma imagem estrutural e funcional detalhada da proteína de interesse.