Name: Conjugadas acasalamento Os ensaios para a análise específica da sequência de proteínas de transferência envolvidos na conjugação bacteriana (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Aprenda ensaios de acasalamento para análise de transferência de plasmídeos em bactérias usando recombinação homóloga e mutações genéticas. Este método identifica regiões de interação proteica no sistema de secreção tipo IV.

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Esta pesquisa foi apoiada por uma Grant Descoberta da Ciência e Engenharia Conselho Natural do Canadá (NSERC).

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

processo de conjugação bacteriana fornece um meio pelo qual as bactérias podem espalhar genes proporcionando uma vantagem evolutiva para o crescimento em ambientes difíceis, tais como a propagação de marcadores de resistência a antibióticos. Porque muitos dos plasmídeos conjugativos são tão grandes, 12 estudos funcionais sobre as proteínas envolvidas na montagem do aparelho de transferência através de mutação de genes alvo no próprio plasmídeo conjugativo são pesadas. Os protocolos aqui descritos proporcionam...

A transferência de genes e proteínas ao nível micro-organismo ao desempenha um papel central na sobrevivência e evolução bacteriana, bem como processos de infecção. A troca do ADN entre as bactérias ou entre uma bactéria e uma célula pode ser conseguido através de transformação, conjugação ou transdução de vector. Conjugação 1,2 é único em comparação com a transformação e transdução em que durante a conjugação entre as bactérias gram-negativas tais como Escherichia coli, a transferência de ADN ocorre de um modo controlado-doador no qual um sistema macromolecular complexa liga células dadoras e receptoras. A conjugação é também a maneira mais direta em que as células bacterianas interagem com as células hospedeiras para injetar genes, proteínas ou produtos químicos para sistemas host. 3 Muitas vezes, a transferência desses agentes tem efeitos notáveis sobre o anfitrião, que vão desde patogenia e carcinogênese para hospedar evolução e adaptação. Tem sido demonstrado que recombinatio conjugativon aumenta a taxa de adaptação 3 vezes em bactérias com taxas de mutação elevadas sob condições de stress ambiental. 4 Além disso, a conjugação é de longe a via mais comum, através do qual os genes de resistência a antibióticos em estirpes bacterianas são distribuídos. 5,6 Os microrganismos têm evoluído sistemas de secreção especializados para suportar a transferência de macromoléculas através das membranas celulares; existem actualmente 9 tipos de sistemas de secreção (TSSs) em bactérias gram-negativas que foram descritos: T1SS, T2SS, T3SS, T4SS, T5SS, T6SS, T7SS, bem como a SEC (secreção) e Tat (de dois arginina translocação) vias. 7,8 Cada tipo de sistema de secreção é dividido em diferentes subtipos, uma necessidade devido à diversidade de proteínas e o carácter distintivo de caminhos envolvidos, em diferentes estirpes bacterianas. Por exemplo, no sistema de secreção de tipo IV (T4SS), os sistemas de Ti e facilitar o transporte CAG efector ao passo que a F-plasmídeo, R27 umnd pKM101 T4SSs facilitar a transferência de um plasmídeo conjugada. 7,9,10 uma compreensão detalhada dos mecanismos pelos quais os organismos montam os seus respectivos sistemas de secreção de proteínas a partir de seus componentes e partilham conteúdo celular com um receptor ou o seu ambiente circundante é um factor importante no desenvolvimento de estratégias que apontam para combater microrganismos patogénicos e processos de infecção celular. Após a conjugação bacteriana identificação inicial em E. coli por Lederberg &amp; Tatum, 11 de um grande número de plasmídeos conjugativos móveis e têm sido identificadas e caracterizadas. 12 Tais plasmídeos móveis mostrar considerável gama é de tamanho (de 1 a mais de 200 quilobases (kb)), no entanto, todos os plasmídeos móveis contêm um relaxase, que reconhece a origem de transferência (oriT) permitindo assim a transmissão do plasmídeo. Os plasmídeos conjuntivos mais genes codificam para a montagem de um T4SS funcional, bem como um tipoproteína de ligação IV. 12 Por exemplo, a 100 kb F plasmídeo de E. coli codifica todos os genes conjugadas dentro de uma transferência de 33,3 kB (tra) região. 13 Os genes na região do tra do plasmídeo codifica F todas as proteínas que facilitam a formação de pilus, Acasalamento formação de pares (MPF), a transferência de DNA e as funções de exclusão durante a transferência de plasmídeo conjugada. 10,14,15 Um corpo significativo de conhecimento está disponível para T4SSs conjugada, porém detalhado estudos estruturais das proteínas conjugadas e complexos só são mais recentemente se tornando disponíveis. 16-28 Para montar uma visão abrangente do processo conjugada, é necessário um acoplamento de estudos estruturais detalhados para mutacional análises de proteínas de transferência conjugadas. Isto pode ser conseguido através de ensaios de encaixe conjugadas. Para o plasmídeo F, cada proteína codificada dentro da região de TRA desempenha um papel na co-F mediadanjugation; por conseguinte, o nocaute / eliminação de um gene de transferência vai abolir a capacidade conjugadas das células (Figura 1). Enquanto plasmídeos celulares mais pequenas são mais conducentes para procedimentos de eliminação padrão, por plasmídeos conjugativos maiores, tais como F, nocaute de genes são mais prontamente conseguidas através de recombinação homóloga em que o gene alvo é substituída com uma transmissão de um gene de resistência a antibiótico distinta. No protocolo atual, que empregam recombinação homóloga para substituir um gene transfer de interesse com cloranfenicol acetiltransferase (CAT) na 55 kb F plasmídeo derivado pOX38-Tc; 29,30 nocaute o plasmídeo resultante, pOX38-Tc :: Δgene Cm, facilita a resistência à presença de cloranfenicol (Cm) no meio de crescimento. células dadoras que albergam pOX38-Tc :: Δgene cm são incapazes de afectar conjugativo transferência de ADN / acasalamento como observado através da utilização de um ensaio de acoplamento; a eficácia de acoplamento de uma célula doadora pOX38-Tc Δgene :: cm e uma recip normaistário vai diminuir ou, mais frequentemente, ser abolido. transferência conjugativa do plasmídeo pOX38-Tc :: Δgene cm pode ser restaurada por meio de uma pequena recuperação de plasmídeo que alberga o gene alvo de transferência. Este plasmídeo de recuperação pode ser uma que proporciona a expressão constitutiva, tal como pK184 plasmídeo (pK184-gene), 31 ou um que fornece expressão indutível enquanto que o plasmídeo alvo correctamente o gene para a localização correcta no interior da célula (citoplasma ou periplasma). Consequentemente, em ensaios de acasalamento entre este novo doador (abrigando pOX38-Tc Δgene plasmídeos :: Cm + pK184 de gene) e uma célula receptora, a eficiência de acoplamento é esperado para restaurar a quase que de um ensaio de acoplamento doador-receptor normal. Este sistema permite uma para sondar a função do gene eliminado por meio da geração de uma série de construções pK184-Gene (deleções ou mutações pontuais) e testando a capacidade de cada construção para restaurar a capacidade de acoplamento do pOX38-Tc Δgene :: Cm abrigando célula doadoras.

<table><tbody><tr><td>Kit de Mini-Preparação de Plasmídeo GeneJet</td><td>Fisher Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Extração de Gel GeneJet</td><td>Fisher Scientific</td><td>K0692</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Purificação de PCR GeneJet</td><td>Fisher Scientific</td><td>K0702</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Kit de Mutagênese Dirigida ao Local</td><td>New England Biolabs</td><td>E0554S</td><td></td></tr><tr><td>Escada de DNA de Amplo Alcance</td><td>New England Biolabs</td><td>N0303A</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Eletroporador</td><td>Eppendorf</td><td>4309000027</td><td></td></tr><tr><td>Cubetas de Eletroporação</td> As cubetas <td>Fisher Scientific</td><td>FB101</td><td>têm uma folga de 1 mm.</td></tr><tr><td>Enzimas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AvaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0152S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104L</td><td></td></tr><tr><td>NdeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111S</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA Polimerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td><forte>Antibióticos</forte></td><td></td><td></td><td><forte>Concentrações Finais</forte></td></tr><tr><td>Cloranfenicol (Cm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP904-100</td><td>20 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>de canamicina (Km)</td><td>BioBasic Inc.</td><td>DB0286</td><td>50 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>de ácido nalidíxico (Nal)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8878-25G</td><td>10 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>Rifampicina (Rif)</td><td>Calbiochem</td><td>557303</td><td>20 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>Tetraciclina (Tc)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP912-100</td><td>10 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>Estreptomicina (Sm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP910-50</td><td>50 &micro; g/mL</td></tr></tbody></table>

conjugadas acasalamento os ensaios para a análise específica da sequência de proteínas de transferência envolvidos na conjugação bacteriana

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

A transferência de material genético por conjugação bacteriana é um processo que ocorre por meio de complexos formados por proteínas de transferência específicas. Em Escherichia coli, essas proteínas de transferência compõem uma maquinaria de transferência de DNA conhecida como formação de pares de acasalamento, ou complexo de transferência de DNA, que facilita a transferência conjugativa de plasmídeos. O objetivo deste artigo é fornecer um método que possa ser usado para determinar o papel de uma proteína de transferência específica que está envolvida na conjugação usando uma série de deleções e / ou mutações pontuais em combinação com ensaios de acasalamento. O gene alvo é nocauteado no plasmídeo conjugativo e é então fornecido em trans através do uso de um pequeno plasmídeo de recuperação que abriga o gene alvo. Mutações que afetam o gene alvo no plasmídeo de recuperação podem revelar informações sobre aspectos funcionais da proteína-alvo que resultam na alteração da eficiência de acasalamento das células doadoras que abrigam o gene mutado. Alterações na eficiência de acasalamento fornecem informações sobre o papel e a importância da proteína de transferência específica, ou de uma região dela, na facilitação da transferência conjugativa de DNA. O acoplamento deste ensaio de acasalamento com estudos estruturais tridimensionais detalhados fornecerá uma compreensão abrangente da função da proteína de transferência conjugativa, bem como fornecerá um meio para identificar e caracterizar regiões de interação proteína-proteína.

O processo de conjugação bacteriana F-driven plasmídeo é um processo coordenado que envolve proteínas de transferência dentro da região do tra de o F-plasmídeo que monta um T4SS para facilitar a síntese de pilus e transferência de ADN conjugativo. A proteína TRAF (Registo de GenBank # BAA97961; UniProt ID P14497) é necessária para a formação de F-pilus conjugativo. 10,14,35 - 37 A proteína contém um domínio tioredoxina-como C-terminal, apesar de ...

Aqui, apresentamos um protocolo para nocautear um gene de interesse envolvido na conjugação de plasmídeos e, posteriormente, analisar o impacto de sua ausência usando ensaios de acasalamento. A função do gene é explorada para uma região específica de sua sequência usando deleção ou mutações pontuais.

Conjugadas acasalamento Os ensaios para a análise específica da sequência de proteínas de transferência envolvidos na conjugação bacteriana

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

O objetivo geral deste ensaio de acasalamento é avaliar os efeitos de mutações dentro do gene de transferência conjugativa em sua capacidade de afetar a transferência de plasmídeo no contexto de um complexo funcional de secreção do tipo quatro. Este método permite fazer perguntas específicas sobre proteínas, como identificar regiões de interações proteína-proteína que ocorrem entre proteínas de transferência à medida que montam um sistema funcional de secreção tipo quatro na conjugação bacteriana. Nesta técnica, genes em grandes plasmídeos conjugativos são nocauteados por recombinação homóloga.A função do gene é avaliada fornecendo o gene alvo para os knock-outs em um plasmídeo menor. Geralmente, os indivíduos novos nesse método terão dificuldades porque a organização e a configuração são fundamentais para conduzir esse procedimento com sucesso. A preparação experimental adequada é necessária para obter resultados interpretáveis.Comece este protocolo com a preparação do plasmídeo pBAD33 digerido conforme descrito no protocolo de texto. Execute cada resumo em um gel de agarose. Usando um gabinete UV e uma lâmina de barbear estéril, corte a banda de base de 2,8 quilos que corresponde

conjugative-mating-assays-for-sequence-specific-analysis-transfer

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Um método rápido e eficiente para integrar DNA estranho de juros em cepas pré-fabricados receptoras, chamadas de tensões almofada de aterragem, é descrito. O método permite site-specific integração de uma cassete de ADN no locus engenharia aterragem almofada de uma estirpe dada, por meio de conjugação e expressão da integrase ΦC31.

Site-specific Engenharia cromossomo bacteriano: ΦC31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

Fonte: Erdogan, F., et al., Ensaios de acasalamento conjugativo para análise específica de sequência de proteínas de transferência envolvidas na conjugação bacteriana. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra o procedimento para transferir um plasmídeo F do doador para as células de E. coli receptoras usando um plasmídeo de resgate e selecionando transconjugantes por meio de resistência dupla a antibióticos. O processo inclui a mistura de culturas bacterianas, incubação sem agitação, interrupção...

Transferência de plasmídeo F e seleção dupla de antibióticos em E. coli

Descrevemos aqui três protocolos diferentes para a investigação in vitro de conjugação, transdução, transformação e natural em Staphylococcus aureus.

Metodologia para o Estudo da transferência horizontal de genes em<em&gt; Staphylococcus aureus</em

Com o objetivo de entender os comportamentos dos vários elementos de conjugativo bacterianos DNA sob diferentes condições, descrevemos um protocolo para a detecção de diferenças na frequência de conjugação, com alta resolução, para estimar quanto à eficácia da bactéria doadora inicia a conjugação.

Comparação de alta resolução de frequências de conjugação bacteriana

Aqui, apresentamos um protocolo descrevendo como i) montar um vetor auto-replicante usando o kit de ferramentas de clonagem modular CyanoGate, ii) introduzir o vetor em um hospedeiro cianobacteriano por conjugação, e iii) caracterizar cepas transgênicas de cianobactérias usando um leitor de placa ou citometria de fluxo.

Modificação genética de cianobactérias por conjugação usando o kit de ferramentas de clonagem modular CyanoGate

Descrevemos um método para gerar bibliotecas mutantes transposon saturadas em bactérias Gram-negativas e preparação subsequente de bibliotecas de amplicon de DNA para sequenciamento de alto rendimento. Como exemplo, focamos no patógeno ESKAPE, Acinetobacter baumannii,mas este protocolo é agradável para uma ampla gama de organismos Gram-negativos.

Gerando Bibliotecas de Inserção Transposon em bactérias gram-negativas para sequenciamento de alto rendimento

A conjugação medeia a transferência horizontal de genes mobilizando o DNA plasmídico através de duas células diferentes, facilitando a disseminação de genes benéficos. Este trabalho descreve um método amplamente utilizado para a detecção eficiente da transferência conjugativa de plasmídeos, baseado no uso de marcadores diferenciais no plasmídeo conjugativo, doador e receptor para detectar a transconjugação.

Detecção de Transferência Horizontal de Genes Mediada por Plasmídeos Conjugativos Naturais em E. coli

Neste manuscrito, descrevemos um protocolo para examinar funcionalmente a transcrição e a atividade inibitória de agentes antibacterianos direcionados à transcrição bacteriana.

Transcrição in vitro Ensaios e sua aplicação em Drug Discovery

Aqui apresentamos um protocolo que facilita a caracterização funcional de médio a alto rendimento de construções de genes e promotores em tecidos secundários de árvores em prazos comparativamente curtos. É eficiente, fácil de usar e amplamente aplicável a uma variedade de espécies de árvores.

O uso de Induced Somatic Análise Sector (ISSA) para estudar genes e promotores envolvidos na formação da madeira e Desenvolvimento secundária da haste

Aqui, apresentamos protocolos de cultura de células humanas para analisar os fatores de iniciação da tradução que se ligam à tampa 5' do mRNA durante condições fisiológicas de oxigênio. Este método utiliza um análogo de tampa m7GTP ligado à agarose e é adequado para investigar fatores de ligação de tampas e seus parceiros de interação.

Análise de proteínas Cap-ligação em células humanas expostas a condições de oxigênio fisiológicos

Aprenda ensaios de acasalamento para análise de transferência de plasmídeos em bactérias usando recombinação homóloga e mutações genéticas. Este método identifica regiões de interação proteica no sistema de secreção tipo IV.

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