Microscopia de Fluorescência de Reflexão Interna Total para Visualização de Eventos Exocíticos

Comece com uma placa com fundo de vidro contendo neurônios corticais embrionários em uma fluorescência de reflexão interna total ou estágio de microscópio TIRF.

Esses neurônios expressam uma proteína fluorescente verde sensível ao pH ou um marcador de vesícula marcado com GFP que fluoresce em pH extracelular neutro, mas permanece não fluorescente em vesículas ácidas.

Após a fusão da vesícula com a membrana plasmática, a exposição ao pH extracelular induz fluorescência, marcando o evento de exocitose.

Selecione o objetivo e defina o índice de refração para corresponder ao neurônio.

Direcione o feixe de laser em um ângulo em relação ao vidro, o que causa reflexão interna total e gera uma onda evanescente. Essa onda excita seletivamente os marcadores GFP próximos à membrana plasmática.

Defina a profundidade de penetração do TIRF para excluir os marcadores GFP acima do campo evanescente.

Primeiro, use a iluminação de epifluorescência de campo amplo para localizar neurônios que expressam GFP.

Em seguida, mude para a iluminação TIRF para excitação específica da membrana.

Adquira imagens de lapso de tempo para registrar o evento de fusão da vesícula e visualizar a exocitose.

Depois de configurar o microscópio TIRF e a amostra e encontrar um plano focal neuronal de acordo com o protocolo de texto, inicie o software do laser e conecte-se ao software de controle do laser. Defina a iluminação para campo amplo e selecione a objetiva. Em seguida, defina o índice de refração da amostra e ajuste a intensidade do laser desmarcando TTL para o laser 491.

A otimização dos parâmetros de imagem é importante durante a aquisição de imagens de vesículas exocíticas intactas no assoalho para evitar desvio de foco e fototoxicidade ao produzir imagens de alta relação sinal-ruído suficiente para análise.

Ajuste o controle deslizante para 100 e, em seguida, abaixe-o novamente para um valor entre 20 e 40. Em seguida, verifique novamente o TTL. Em seguida, concentre-se na amostra novamente na iluminação de luz transmitida.

Em seguida, no software de imagem, selecione a iluminação do laser 491 e abra o obturador. Coloque o condensador de cabeça para baixo na bancada óptica para não arranhar a lente. Ajuste fino o ponto focal do laser no teto.

E com o condensador removido, centralize o ponto no centro do diafragma de campo fechado. Em seguida, substitua o condensador. E no software TIRF, defina a profundidade de penetração para 110 nanômetros. Em seguida, alterne da iluminação de campo amplo para o modo de iluminação TIRF para geração de imagens.

Agora, usando epifluorescência de campo amplo, encontre células que expressam florina VAMP2 através das oculares. Em seguida, para reduzir o fotobranqueamento e a fototoxicidade, ajuste os parâmetros de imagem para maximizar a relação sinal-ruído e a faixa dinâmica usando o mínimo de tempo de exposição e intensidade do laser. Defina o foco automático contínuo por célula. Em seguida, adquira um conjunto de imagens de lapso de tempo com aquisição ocorrendo a cada 0,5 segundos por 5 minutos.