Microscopia de Fluorescência de Reflexão Interna Total para Visualização de Eventos Exocíticos

Comece com uma placa com fundo de vidro contendo neurônios corticais embrionários em uma fluorescência de reflexão interna total ou estágio de microscópio TIRF.

Esses neurônios expressam uma proteína fluorescente verde sensível ao pH ou um marcador de vesícula marcado com GFP que fluoresce em pH extracelular neutro, mas permanece não fluorescente em vesículas ácidas.

Após a fusão da vesícula com a membrana plasmática, a exposição ao pH extracelular induz fluorescência, marcando o evento de exocitose.

Selecione o objetivo e defina o índice de refração para corresponder ao neurônio.

Direcione o feixe de laser em um ângulo em relação ao vidro, o que causa reflexão interna total e gera uma onda evanescente. Essa onda excita seletivamente os marcadores GFP próximos à membrana plasmática.

Defina a profundidade de penetração do TIRF para excluir os marcadores GFP acima do campo evanescente.

Primeiro, use a iluminação de epifluorescência de campo amplo para localizar neurônios que expressam GFP.

Em seguida, mude para a iluminação TIRF para excitação específica da membrana.

Adquira imagens de lapso de tempo para registrar o evento de fusão da vesícula e visualizar a exocitose.

Depois de configurar